Et IL-12--baseret nanocytokin styrker sikkert anticancer-immunitet gennem spatiotemporal kontrol af inflammation for at udrydde avancerede forkølelsessvulster

Behandling af immunologisk kolde tumorer er en stor udfordring for immun checkpoint inhibitors (ICI'er). Interleukin 12 (IL-12) kan styrke ICI'er mod kolde tumorer ved at etablere robust antitumorimmunitet. Imidlertid har dets toksicitet og systemiske induktion af modvirkende immunsuppressive signaler hindret translation. Her er IL-12-aktivitet spatiotemporalt styret for sikkert at booste effektiviteten uden stimulering af forstyrrende immunresponser ved at generere et nano-cytokin, der forbliver inaktivt ved fysiologisk pH, men frigiver sin fulde aktivitet ved sur tumor-pH. Det IL-12-baserede nanocytokin (Nano-IL-12) akkumulerer og frigiver IL-12 i tumorvæv, hvilket fremkalder lokaliseret antitumoral inflammation, samtidig med at det forhindrer et systemisk immunrespons, modvirkende immunreaktioner og uønskede toksiciteter selv efter gentagen intravenøs administration. Den Nano-IL-12-medierede spatiotemporale kontrol af inflammation fremkalder overlegen anticancer-effektivitet og synergiserer med ICI'er for dybt at inflammere tumormikromiljøet og fuldstændigt udrydde ICI-resistente primære og metastatiske tumorer. Strategien kunne være en lovende tilgang til sikrere og mere effektive immunterapier.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

1. Introduktion

Immune checkpoint-hæmmere (ICI'er), såsom anti-PD-1 (nivolumab) og anti-CTLA- 4 (ipilimumab) antistoffer, har revolutioneret kræftbehandling.[1,2] Imidlertid har et stort antal af patienter har stadig ikke gavn af disse behandlinger.[3] En sådan mangelfuld respons er blevet forbundet med en kold tumorfænotype, der er ufølsom over for ICI'er.[4,5] Disse kolde tumorer præsenterer normalt et immunsuppressivt mikromiljø og lave niveauer af T-celleinfiltration, der svækker virkningerne af ICI'erne.[5-7 ] Der er således et presserende behov for midler til at flytte tumoren fra den kolde fænotype til en betændt (varm) fænotype med høj T-celleinfiltration mod at øge effektiviteten af ​​ICI'er og udvide det terapeutiske landskab. Interleukin-12 (IL-12), som er blandt de stærkeste proinflammatoriske cytokiner, har et højt potentiale for at booste antitumorimmunitet og overvinde ICI-resistens.[8-10] Imidlertid inducerer IL-12 alvorlige immunrelaterede uønskede hændelser (irAE'er), når de injiceres systemisk.[8,10] Således en række forskellige proteinteknologiske tilgange, herunder immuncytokiner,[11-13] fusionsproteiner[14] og proteasefølsomme cytokiner[15] ] er under intens undersøgelse for at forbedre sikkerheden ved IL-12 ved at reducere systemisk eksponering og øge tumorselektiviteten. På den anden side har IL-12 stadig kritiske ulemper relateret til den spatiotemporale dynamik af inflammationen, der fører til modvirkende immunreaktioner, der underminerer dens effektivitet.[16-19] For eksempel fremmede gentagen IL-12-injektion. den systemiske udvidelse af antiinflammatorisk interleukin-10 (IL-10) hos patienter, hvilket begrænsede antitumoreffektiviteten.[20-22] I denne henseende udviklede systemer, der er i stand til spatiotemporalt at kontrollere IL{{36 }}medieret inflammation kunne maksimere effektorfunktionerne og stimulere robust antitumorimmunitet, samtidig med at man undgår forstyrrende immunreaktioner. Desværre er den inflammatoriske dynamik for de ovennævnte protein-konstruerede systemer ikke fuldt ud forstået, og deres sammenhæng med at modvirke sekundære responser mangler at blive afklaret. Heri udviklede vi stimuli-responsive nanoskalerede cytokiner (nano-cytokiner) ved at indkapsle native IL-12 med biokompatible polymerer for at opnå rumlig styring af dets aktivitet. De IL-12-baserede nanocytokiner (Nano-IL-12) blev designet til at frigøre den fuldt aktive IL-12 efter at have registreret den sure intratumorale pH, da acidose er et kendetegn for cancer[23] og er forbundet med immunsuppression.[24,25] Faktisk har vi for nylig fundet ud af, at den pH-omskiftelige funktion kan tillade høj og selektiv aktivering i ICI-resistente tumorer.[26] Farmakokinetikken, sikkerheden og effektiviteten af ​​Nano-IL-12 blev evalueret i murine modeller af koldt melanom og brystkræft. Vores resultater viste, at NanoIL-12 inducerer en vedvarende inflammatorisk reaktion i tumorvæv ved at øge intensiteten og varigheden af ​​eksponeringen for IL-12 og samtidig undgå interaktionen med immuncellerne i sundt væv for at undertrykke off- mål immunrespons. Således blokerede Nano-IL-12 effektivt modvirkende sekundære reaktioner både systemisk og intratumoralt, hvilket viste effekt ved doser, der er 10-fold lavere end naturligt forekommende IL-12. Den forbedrede antitumorimmunitet af Nano-IL-12 synergis sikkert med ICI'er for intenst at opflamme tumormikromiljøet (TME), hvilket førte til komplette responser (CR) i ICI-resistente modeller af melanom og primær og lungemetastaser af triple- negativ brystkræft (TNBC).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

2. Resultater

2.1. Nano-IL-12 registrerer intratumoral pH for at frigive fuldt aktivt cytokin

For at konstruere Nano-IL-12 syntetiserede vi carboxydimethylmaleinsyreanhydrid (CDM)-modificeret poly(ethylenglycol)-poly(LLysin) (PEG-pLL(CDM)) gennem den rapporterede metode[27] (skema S1, Understøttende oplysninger). Polymeren har halvdelen af ​​aminogrupperne i pLL-blokken konjugeret med CDM gennem amidbindingen (figur S1-S3, understøttende information). Nano-IL{{10}} dannes blot ved at blande polymeren med cytokinet under vandige betingelser uden tilsætning af organiske opløsningsmidler (figur 1a). Aminogrupperne i polymeren danner ionkomplekser med carboxylatdelene i proteinerne, mens CDM-grupperne reagerer med aminogrupperne i IL-12 såvel som i polymerstrengene for at danne pH-følsomme amidbindinger. Indkapslingseffektiviteten af ​​IL-12 i nanocytokinerne blev bestemt til at være omkring 80 %, målt ved HPLC ved at sammenligne områderne af toppene af Alexa Fluor 647 (A647)-mærket fri IL-12 og IL-12 indlæst i nanocytokinet (figur 1b). I tilfælde af ikke-fluorescensmærket IL-12 blev indkapslingseffektiviteten valideret ved ELISA-måling, da ELISA-metoden kun kan påvise det uindkapslede frie IL-12 i den reagerede blanding, fordi polymercoatingen af ​​Nano -IL-12 blokerer genkendelsen af ​​den indlæste IL-12 med detektionsantistoffet. Ved at beregne forholdet mellem det uindkapslede IL-12 versus det samlede IL-12-feed blev indkapslingseffektiviteten også bestemt til at være omkring 80 % (figur S4a, understøttende information), i overensstemmelse med resultatet fra HPLC-målingerne. NanoIL-12 blev oprenset ved centrifugalfiltrering for at fjerne fri IL-12 og relativt små polymer-IL-12-konjugater (figur S4b, understøttende information). Oprensningen blev bekræftet ved HPLC (figur 1b, nederste panel). Dannelsen af ​​det polymere skjold på Nano-IL-12 blev bekræftet ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) og dynamisk lysspredning (DLS). I TEM blev den IL-12-belastede kerne af NanoIL-12 dannet af pLL-blokken af ​​polymeren og IL-12 farvet med uranylacetat[28] og visualiseret som ensartede sorte prikker med en gennemsnitlig diameter på 23,2 ± 4 nm (figur 1c, d). Ved DLS blev den hydrodynamiske diameter af Nano-IL-12 målt til at være 42 ± 2 nm (figur 1e). Ved at sammenligne størrelsen målt med TEM og DLS kan vi beregne, at tykkelsen af ​​PEG-skallen i disse partikler er cirka 10 nm. Dette resultat indikerer en tæt PEGylering, som ville være nyttig til at forbedre farmakokinetikken.[29] Desuden bekræftede fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) undersøgelser af den A647-mærkede Nano-IL-12 dannelsen af ​​associerede forbindelser med større molekylvægt end fri A647-mærket IL-12 (Tabel S1, Understøttende oplysninger). Ved at sammenligne antallet pr. molekyle i FCS-målingen af ​​A647-mærket IL-12 og A647-mærket Nano-IL-12 prøver, bestemte vi, at hver Nano-IL{ {67}} indeholder cirka 1,5 IL-12-molekyler i gennemsnit. Derudover blev overfladeladningen af ​​Nano-IL-12 fundet at være tæt på neutral (tabel S2, understøttende information), hvilket tyder på, at polymeren afskærmer den negativt ladede IL-12. Amidbindingerne i Nano-IL-12 dannet mellem CDM-delene og primære aminer rapporteres at være pH-følsomme.[30] Nano-IL-12 forventes således at dissociere under sure forhold for at frigive det indkapslede cytokin. Vi screenede først pH-følsomheden af ​​Nano-IL-12 ved forskellige pH-værdier fra pH 4,5 til 8,5 ved FCS-måling for at afspejle dissociationsstatus for Nano-IL-12 ved ændringen af diffusionskoefficient. Forøgelsen af ​​diffusionskoefficienten, svarende til faldet i partiklernes molekylvægt, kunne observeres under sure forhold under pH 7,0, hvilket tyder på, at Nano-IL-12 er stabile ved fysiologisk pH, men kan miste deres integritet i intratumorale læsioner med det forsurede miljø[23,31] (figur 1f). Dernæst undersøgte vi dissociationskinetikken af ​​Nano-IL -12 ved fysiologisk pH 7,4 og intratumoral pH 6,5 ved FCS-måling. FCS-målingen muliggør præcis vurdering af diffusionskoefficienterne for Nano-IL-12 og den frigivne IL-12. Det nye resultat viste, at Nano-IL-12 hurtigt mistede integritet ved pH 6,5, og prøvens diffusionskoefficient nåede værdien af ​​fri IL-12 efter 4 timers inkubation, hvilket tyder på fuldstændig aktivering af Nano-IL -12 under sådanne forhold. Ved pH 7,4 var Nano-IL-12 desuden stabile (figur 1g), og bibeholdt deres diffusionskoefficient selv efter flere dage (figur S4c, understøttende information). Disse observationer understøtter den selektive aktivering af Nano-IL-12 ved intratumorale pH-forhold og stabiliteten ved fysiologiske forhold. Da IL-12 kan stimulere sekretionen af ​​IFN-𝛾 fra splenocytter,[32] blev effekten af ​​polymerafskærmning/afskærmning på bioaktiviteten af ​​Nano-IL-12 evalueret in vitro ved splenocytassay ( Figur 1h). Nano-IL-12 inducerede lavere niveauer af IFN-𝛾-produktion fra murine splenocytter, hvilket indikerer blokering af IL-12 bioaktivitet af polymerindkapslingen. På den anden side udviste Nano-IL-12 aktiveret ved præ-inkubation i syre (pH 6,5) lignende bioaktivitet som naturligt IL-12, hvilket tyder på den aktiverede Nano-IL-12 kan fuldt ud hente bioaktiviteten af ​​cytokinet.

Figur 1. Nano-IL-12 aktiveres ved intratumoral pH for at frigive det fuldt aktive cytokin. a) Dannelse og struktur af IL-12-baseret nanocytokin (Nano-IL- 12). Nano-IL-12 er selvsamlet under vandige forhold ved blot at blande polymeren med IL-12. Samlingen drives af de pH-følsomme amidbindinger og elektrostatiske interaktioner. b) HPLC-resultater af frit IL-12-protein, PEG-pLL(CDM) + IL-12-blanding og oprenset Nano-IL-12. IL-12-proteinerne er mærket med A647. c) Repræsentativt TEM-billede af oprenset Nano-IL-12 viser tydeligt partiklernes kernestruktur. d) Fordeling af partikelkernens diameter målt fra TEM-billederne. n=100 partikler talt. e) Fordeling af de hydrodynamiske diametre af Nano-IL-12 målt ved DLS. f) pH-afhængig Nano-IL-12 disassociation angivet ved FCS-måling af Nano-IL-12 inkuberet under forskellig pH i 24 timer. Den stiplede linje ved 5,3 × 107 cm2 s−1 refererer til diffusionskoefficienten for fri IL-12. g) IL-12-frigivelsesprofil for Nano-IL-12 målt ved FCS-metoden. De stiplede linjer ved 1,2 × 107 cm2 s−1 og 5,3 × 107 cm2 s−1 henviser til henholdsvis diffusionskoefficienterne for intakt Nano-IL-12 og frigivet fri IL-12. h) IFN-𝛾 sekretion af murine splenocytter behandlet med Nano-IL-12, aktiveret Nano-IL-12 og nativ IL-12. IFN-𝛾 blev målt ved ELISA. Data er vist som middelværdi ± SD; for f og g, n=3 parallelle målinger. For h, n=5 parallelle målinger.

Bevarelsen og stabiliteten af ​​formuleringen er også vigtig for at oversætte Nano-IL-12 som et lægemiddel. Derfor udviklede vi en frysetørret version af Nano-IL-12 ved hjælp af trehalose som kryobeskyttelsesmiddel.[33] Den rekonstituerede Nano-IL-12 viste sammenlignelig størrelse og overfladeladning med frisk Nano-IL-12 uden lastlækage og delte sammenlignelig pH-følsomhed og in vitro IFN-𝛾-inducerende evne (Figur S4d–g og Tabel S2, Understøttende oplysninger). Disse resultater understøtter den lyofiliserede formulering som en levedygtig Nano-IL-12-modpart.

Figur 2. Nano-IL-12 forbedrer farmakokinetik og antitumoreffektivitet. a) IVCLSM-billeder af øreflippens hud på mus efter iv-injektion af 10 ug A647-mærket IL-12 eller Nano-IL-12 (rød farve). Målestok=50 μm. Gennemsnitlig fluorescensintensitet i vævsområdet (hvide kasser) 5 timer efter injektion blev kvantificeret og normaliseret til den maksimale intensitet i vaskulaturen umiddelbart efter injektion (Vmax). b) Blodcirkulationsprofiler for fri IL-12 og Nano-IL-12 efter iv-injektion af 10 ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL-12 bestemt ved ELISA. Koncentrationen af ​​frigivet IL-12 fra Nano-IL-12 i blodet plottes også (data er vist som middelværdi ± SD, n=5 mus pr. gruppe). c) IVIS-billede af B16F10 melanom-tumorer udskåret 24 timer efter iv-injektion af 10 ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL-12 mærket med A647. d) Kvantificering af IL-12-niveauet i 4T1 TNBC-tumorer ved 24- og 48 timer efter iv-injektion af 10 ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL-12 ved hjælp af ELISA ( Data er vist som middel ± SD; n=3 mus pr. gruppe; p-værdier er beregnet ved envejs ANOVA). e) Antitumoraktivitet af en enkelt iv-injektion (injektionsdage er angivet med pilen (dag 8 for B16F10-modellen og dag 7 for 4T1-modellen)) på 10 ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL{ {51}}. Resultaterne i B16F10 melanom er vist i det øverste panel, og resultaterne i 4T1 TNBC er vist i det nederste panel. De individuelle tumorvækstkurver er vist i de venstre paneler. De gennemsnitlige tumorvolumenkurver er vist i midterpanelerne, og overlevelseskurverne er vist i højre panel (data er vist som middel ± SEM; n=5 mus pr. gruppe, p-værdier beregnes via log-rank analyse ).

2.2. Nano-IL-12 forbedrer IL-12 farmakokinetik og aktiveres i tumorer for at forstærke antitumoreffekter

Indkapslingen i Nano-IL-12 kan forbedre farmakokinetikken af ​​IL-12. For at visualisere cirkulationen af ​​Nano-IL-12 ved intravenøs (iv) injektion, blev in vivo konfokal laserscanningsmikroskopi (IVCLSM) brugt til at spore den A647-IL-12-baserede Nano-IL -12 i blodårene på museøreflipper efter injektion fra halevenen. Frit IL-12 viste ekstravasation efter injektion (figur 2a), angivet ved den øgede fluorescensintensitet i vævsinterstitium. I betragtning af, at makromolekyler med en størrelse, der kan sammenlignes med IL-12 (75 kDa), såsom 70 kDa dextran og albumin (65 kDa), udviser begrænset adgang til huden,[34] lækagen af ​​IL-12 fra kar tyder på ustabiliteten af ​​IL-12 under blodcirkulationen. Faktisk har tidligere undersøgelser indikeret proteolysen af ​​IL-12 af enzymer til stede i serum.[35,36] For yderligere at understøtte nedbrydningen af ​​IL-12 i vores eksperimenter, er stabiliteten af ​​A{{22 }} mærket IL-12 i museplasma blev undersøgt ved størrelseseksklusionskromatografi (SEC). Efter inkubation med museplasma fandt vi ud af, at IL-12 blev nedbrudt til fragmenter med mindre molekylvægt (figur S5, understøttende information), hvilket bekræfter ustabiliteten af ​​IL-12 i blod. På den anden side viste Nano-IL-12 minimal lækage ind i huden, hvilket indikerer deres stabilitet i blodcirkulationen. Den kvantificerede cirkulationsprofil målt fra ELISA-analysen bekræftede, at den samlede Nano-IL-12 har længere cirkulation end fri IL-12 (figur 2b). I mellemtiden var niveauet af aktiveret Nano-IL-12, som blev bestemt af den frigivne IL-12, stærkt begrænset i blodet, hvilket indikerer in vivo-stabiliteten af ​​Nano-IL-12 under systemisk cirkulation, som er med til at mindske de systemiske bivirkninger. Akkumuleringen af ​​Nano-IL-12 i hjertet, milten, lungerne og nyrerne svarede til akkumuleringen af ​​fri IL-12 både 24 og 48 timer efter administration, mens der i leveren akkumuleres Nano-IL-12 var højere end for fri IL-12 efter 24 timer, men sammenlignelig efter 48 timer (Figur S6, Understøttende oplysninger). Nano-IL-12 viste signifikant højere tumorakkumulering end fri IL-12 (figur 2c) 24 timer efter injektion. Desuden, mens fri IL-12 blev fjernet fra tumorerne 48 timer efter injektion, forblev koncentrationen af ​​Nano-IL-12 høj (omkring 4-fold højere end fri IL{{59} }) (Figur 2d), hvilket tyder på, at Nano-IL-12 øgede arealet under koncentrationskurven (AUC) for IL-12 inde i tumorerne. I overensstemmelse med den forhøjede akkumulering og levedygtige aktivering i tumorer viste Nano-IL-12 forbedret antitumoral effektivitet i forhold til fri IL-12 i subkutan B16F10 melanom og orthotopisk 4T1 triple-negativ brystkræft (TNBC) modeller (figur 2e). I begge modeller førte kun en enkelt iv-injektion af Nano-IL-12 ved 10 ug IL-12-ækvivalent til en signifikant forbedret hæmning af tumorvækst end IL-12, hvilket førte til længere overlevelsestid . Navnlig i 4T1 TNBC-modellen, som er berygtet for sin stærke immunsuppression og modstand mod ICI-behandling,[37] resulterede behandlingen med Nano-IL-12 i en klart signifikant terapeutisk effekt, hvorimod fri IL{{83} } var forgæves mod tumorvækst.

2.3. Nano-IL-12 Spatiotemporalt kontrollerede den inflammatoriske respons

For yderligere at undersøge forskellen mellem de biologiske virkninger af Nano-IL-12 og fri IL-12 blev niveauet af inflammationsrespons fremkaldt fra behandlingen evalueret af cytokinresponsen både på steder uden for mål, dvs. , blod og raske organer og i tumorer (orthotopisk 4T1-model). Fire nedstrøms cytokiner af IL-12, nemlig IFN-𝛾, tumornekrosefaktor-𝛼 (TNF-𝛼), interleukin{{10}} (IL-6) og interleukin -10 (IL-10) blev valgt som indikatorer for inflammationsrespons. Blandt dem er IFN-𝛾, TNF- 𝛼 og IL-6 vigtige proinflammatoriske cytokiner forbundet med den antitumorale virkning af IL-12,[20,38], mens IL{{20 }} er et antiinflammatorisk cytokin, som er en negativ feedback, der antagoniserer IL-12-stimulering.[20,39] Nano-IL-12 og fri IL-12 blev injiceret to gange på dag 0 og 3, og inflammationsreaktionen blev sporet dagligt i 1 uge. Denne eksperimentelle indstilling gjorde det muligt for os at bestemme virkningerne af både enkelt injektion og gentagen dosering på det spatiotemporale inflammatoriske respons. Den første injektion af fri IL-12 på dag 0 førte til sekretion af de fire cytokiner i blod og organer, med en topplasmakoncentration observeret på dag 2 (figur 3a–e,g), hvilket indikerer den stærke off -target inflammation forbundet med de immunrelaterede bivirkninger (irAE'er) af IL-12.[8,10] På den anden side viste den første injektion af Nano-IL- 12 signifikant lavere cytokinniveauer end fri IL-12 i blod og sunde organer, hvilket indikerer reguleringen af ​​inflammationsreaktionen uden for målet. Den anden injektion af fri IL-12 på dag 3 stimulerede igen sekretionen af ​​IFN-𝛾, TNF-𝛼 og IL-6. De maksimale niveauer af IFN-𝛾 og TNF-𝛼 observeret på dag 5 var imidlertid klart lavere end dem, der blev observeret på dag 2 efter den første IL-12-injektion. Desuden hævede den anden injektion af frit IL-12 ekstremt niveauet af antiinflammatorisk IL-10 i plasma, organer og tumorer, hvilket er blevet forbundet med den systemiske hyperekspansion af Th1-celler for at inducere en reguleringsfase.[40] En sådan differentieret respons induceret fra gentagen IL-12-behandling er blevet bekræftet i humane kliniske forsøg, og det bidrager til reduktionen af ​​de biologiske virkninger af IL-12, herunder den antitumorale styrke.[20] I modsætning til IL-12 forværrede den anden injektion af Nano-IL-12 ikke sekretionen af ​​IL-10 i blod og organer. Koncentrationen af ​​de inflammatoriske cytokiner i blod og sundt væv var også signifikant lavere end koncentrationen af ​​fri IL-12. Disse resultater tyder på, at Nano-IL-12 ikke kun kunne reducere det systemiske inflammatoriske respons, men også overvinde begrænsningerne ved gentagen IL-12-administration, hvilket inducerede det kontraaktive anti-inflammatoriske respons. I tumorer øgede et enkelt iv-indsprøjtning af Nano-IL-12 produktionen af ​​inflammatorisk IFN-𝛾, TNF-𝛼 og IL-6, hvilket opnåede betydeligt højere intratumorale koncentrationer end fri IL{{77} } behandling (figur 3f, g). I mellemtiden inducerede Nano-IL-12-behandlingen lavere antiinflammatorisk IL-10 i tumorerne end fri IL-12, hvilket forhindrede begyndelsen af ​​anti-inflammatorisk respons. Efter den anden injektion af Nano-IL-12 blev det høje niveau af inflammatoriske cytokiner desuden opretholdt i tumorerne, mens den intratumorale IL-10-koncentration blev holdt lav. Denne opregulering af IFN-𝛾, TNF-𝛼 og IL-6 og nedregulering af IL-10 i tumorer korrelerer med de høje og vedvarende intratumorale niveauer af Nano-IL-12 og støtte en forhøjet inflammatorisk reaktion for Nano-IL-12, som er afgørende for at forbedre den antitumorale effekt.[41]

For at teste, om Nano-IL-12 kunne forbedre effektiviteten gennem dets spatiotemporale kontrol af inflammation, gentog vi eksperimentet i figur 2e, men denne gang behandlede vi musene med en 10-fold lavere dosis, dvs. 1 ug IL-12 ækvivalent ved brug af en gentagen doseringsplan, der udløser det modvirkende immunrespons for fri IL- 12. Under denne tilbagevendende lavdosisbehandling forbedrede Nano-IL-12 klart antitumoreffektiviteten i forhold til IL-12 i 4T1 TNBC-tumorer (figur 3h), hvilket førte til langsommere tumorvækst og forlænget overlevelse. På den anden side viste den gratis IL-12-behandling ubetydelig effekt, selv efter at være blevet intensivt injiceret seks gange, hvilket kunne tilskrives udvidelsen af ​​antiinflammatoriske cytokiner som IL-10. Disse resultater understøtter Nano-ILs- 12 evne til at forstærke antitumoreffektiviteten ved spatiotemporalt at kontrollere inflammation. Kontrol af det inflammatoriske respons førte også til øget sikkerhed. Vi udførte en histologisk evaluering og blodanalyse for at bestemme toksiciteten af ​​IL{{20}} og Nano-IL-12 efter to injektioner på dag 0 og 3 (figur S7a,c, understøttende information) . Resultaterne viste signifikant lavere toksicitet for lever, nyrer og bugspytkirtel efter Nano-IL-12-behandling sammenlignet med fri IL-12. Ligeledes blev kropsvægtændringerne under behandlingerne sporet som en parameter for toksicitet. Nano-IL-12-behandlede dyr tog lidt på i vægt under behandlingen, hvorimod musene, der modtog fri IL-12, led af et vægttab (Figur S7b, understøttende information). Disse observationer indikerer således, at Nano-IL- 12 fortrinsvis kan fremme inflammationsreaktionen i tumorer for at øge den antitumorale effektivitet, mens den begrænser off-target-effekter i sundt væv for at reducere toksicitet og mindske det kontraaktive anti-inflammatoriske respons.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Nano-IL-12-behandling inducerer antitumoral immuncelleinfiltration i TME

IL-12 er også kendt som en T-celle-stimulerende faktor, da det kan stimulere væksten og funktionen af ​​T-celler til at igangsætte forbedrede antitumorale immunreaktioner. Således evaluerede vi infiltrationen af ​​CD8+-celler i tumorer efter gentagen Nano-IL-12-behandling. Flowcytometrianalyse af B16F10-melanomet behandlet med to iv-injektioner af fri IL-12 eller Nano-IL-12 ved 1 ug IL-12-ækvivalens/injektion viste, at Nano-IL{{13} } øgede signifikant infiltrationen af ​​CD8+ T-celler i tumoren sammenlignet med fri IL-12 (figur 4a). Ved at udføre et immuncelleudtømningseksperiment i en mus, der bærer 4T1 TNBC-tumorer, undersøgte vi bidraget fra forskellige immuncellepopulationer til responsen fra Nano-IL-12-behandling. Nano-IL-12 blev injiceret iv fem gange på dag 7, 9, 11, 13 og 15 (1 ug IL-12 ækvivalens/injektion). Desuden blev musene intraperitonealt (ip) injiceret med anti-CD4, anti-CD8 eller anti-asiago GM1 antistoffer på dag 6, 8 og 10 for at udtømme CD4+, CD8+ eller NK-celler hhv. Resultaterne viste, at udtømningen af ​​CD8+ cytotoksiske T-celler, CD4+ T-celler og NK-celler signifikant reducerede den terapeutiske effekt af Nano-IL-12, som indikeret af den hurtigere tumorvækst og den nedsatte overlevelse i de udtømte grupper sammenlignet med musene, der kun modtog Nano-IL-12-behandlingen (figur 4b). Dette resultat er i overensstemmelse med den biologiske funktion af IL-12, herunder forøgelse af den cytotoksiske aktivitet af CD8 T-celler[42] og NK-celler,[43] og mediering af differentieringen af ​​naive T-celler til T-hjælper (Th)-celler .[44]

Desuden antyder den forskellige afbødningseffektivitet af antitumoraktiviteten som følge af udtømningseksperimentets relevans for hver cellepopulation for effektiviteten af ​​Nano-IL-12, hvor CD8+ cytotoksiske T-celler er den vigtigste fraktion . Immunhistokemianalyse af 4T1 TNBC-tumorsektioner afslørede den rumlige fordeling af tumorinfiltrerende effektorceller (figur 4c). Mens fri IL-12 ikke forbedrede tilstedeværelsen af ​​CD8+ cytotoksiske T-celler og Tbet+ (Th1)-celler i tumorerne, fremmede Nano-IL-12 høj infiltration af begge celler til dybt tumor regioner. Også opreguleringen af ​​Granzyme B i CD8+-celler antydede et højere aktiveringsniveau af cytotoksiske T-celler efter NanoIL-12-behandling (figur 4d). Desuden observerede vi, at Nano-IL-12-behandling forhøjede PD-L1-ekspressionen i tumorer sammenlignet med tumorer behandlet med PBS og fri IL{{20}}. Dette øgede PD-L1-niveau kan skyldes det højere tumor-IFN-𝛾 induceret af Nano-IL-12, som er blevet rapporteret at stimulere PD-L1-ekspression i tumorvæv,[45] der tjener som en mekanisme for immunsuppression at modstå lymfocytinfiltration. Denne intratumorale PD-L1-opregulering antyder potentialet til at synergi antitumoreffektiviteten af ​​Nano-IL-12 ved at kombinere det med anti-PD-1 eller anti-PD-L1 ICI'er. Baseret på observationen ovenfor undersøgte vi effekten af ​​Nano-IL-12 som monoterapi og i kombination med antiPD-1-antistoffer på TME (figur 4e). Eksperimentet blev udført i ortotopiske TNBC-tumorer fremstillet ud fra 4T1-celler, der udtrykker hæmagglutinin (4T1-HA), eftersom hæmagglutinin er et veldefineret immunogen, som kan inducere antigenspecifik cytotoksisk T-lymfocyt-respons i en musemodel.[46 ,47] Musene blev to gange behandlet med 10 ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL-12 på dag 0 og 3, og til kombinationsterapi modtog musene samtidig to gange injektioner af 100 ug anti-PD -1 antistof. På dag 7 blev tumorprøverne høstet til flowcytometri.

Resultaterne bekræftede, at Nano-IL-12-behandling inducerede højere infiltration af leukocytter (CD45+) i tumoren end IL-12. Kombinationen af ​​Nano-IL-12 med anti-PD-1-antistofferne præsenterede også højere CD45+-celler i tumorerne. Blandt leukocytter blev lymfoide celler og T-celler opreguleret af Nano-IL-12 og af kombinationen af ​​Nano-IL- 12/anti-PD-1antistof. Nano-IL-12-behandlingen resulterede i en beskeden ændring i NK-cellepopulationen, men førte til signifikante ændringer i T-celleundergruppen sammenlignet med fri IL-12. Navnlig var infiltrationen af ​​CD8+ T-celler i 4T1-HA-tumorer klart forhøjet af Nano-IL-12 end fri IL-12. Desuden var HA-tetramer+ T-cellerne, som svarer til de antigenspecifikke T-celler, signifikant forøget i kombinationen af ​​Nano-IL-12 plus anti-PD- 1 antistof, hvilket tyder på fremme af et adaptivt immunforsvar svar fra synergien mellem Nano-IL-12 og ICI'er. De generelle CD4+ T-celler viste opregulering i de NanoIL-12-behandlede grupper. For yderligere at specificere subpopulationen af ​​CD4+ T-celler i tumorerne farvede vi cellerne med anti-Foxp3 for at undersøge de regulatoriske T-celler (Tregs). Mens anti-PD-1 monoterapi ikke viste nogen undertrykkelse af Tregs i 4T1- HA-tumormodellen, er kombinationen af ​​Nano-IL-12 plus anti-PD-1 dramatisk udtømte Tregerne. Desuden præsenterede Nano-IL-12-behandlede tumorer højere Th-celler end fri IL-12. Disse resultater indikerer, at Nano-IL-12-behandling forbedrede antitumorimmunceller i filtration og synergiserede med anti-PD-1-antistoffer for at overvinde den immunsuppressive TME.

Figur 3. Nano-IL-12 kontrollerede spatiotemporalt den inflammatoriske respons. a) Proinflammatoriske (IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL-6) og antiinflammatoriske (IL-10) cytokinniveauer i blod i 4T1-bærende mus injiceret med 1{{14 }} ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL-12 to gange på dag 0 og 3. Cytokinniveauerne blev målt ved ELISA. Topværdierne efter de to injektioner (på dag 2 og 5 for IFN-𝛾, TNF-𝛼 og IL-10; på dag 2 og 6 for IL-6) visualiseres som søjlediagrammer på højre panel. b–f) Cytokinniveauer i organerne og tumorerne hos 4T1-bærende mus injiceret med 10 ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL-12 to gange på dag 0 og 3. Musene blev ofret på dag 2 og 5 for at indsamle vævene. (Data er vist som middel ± SD; n=6 mus pr. gruppe; p-værdier beregnes via uparret t-test.) g) Heatmaps af cytokinniveauerne i blod, organer og tumorer ud fra gennemsnitsværdierne i af konverteret til Z-score. h) Antitumoraktivitet ved gentagen iv-injektion (injiceret på dag 7, 9, 11, 13, 15 og 25, angivet med pile) af 1 ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL-12 mod murine TNBC. De individuelle tumorvækstkurver er vist i venstre panel. De gennemsnitlige tumorvolumenkurver er vist i det centrale panel, og overlevelseskurverne er vist i højre panel (Data er vist som middel ± SEM; n=6 mus pr. gruppe, p-værdier beregnes via log-rank analyse ).

Figur 4. Antitumoreffekten af ​​Nano-IL-12 genereres fra den forbedrede infiltration af effektorceller i TME. a) Flowcytometrianalyse af CTL'er infiltration i melanom efter Nano-IL-12 behandling. Mus blev inokuleret med B16F10-celler på dag 0. IL-12 (1 ug) eller tilsvarende Nano-IL-12 blev injiceret iv to gange på dag 8 og 11. Tumorprøver blev opsamlet og analyseret på dag 15 (data vist som middelværdi ± SD; n {{ 16}} mus pr. gruppe; p-værdier blev beregnet via envejs ANOVA). b) Antitumoraktivitet af Nano-IL-12 ved udtømning af CD4+-, CD8+- og NK-celler. Mus med 4T1-tumorer blev iv injiceret med Nano-IL-12 (1 ug IL-12 ækvivalent) på dag 7, 9, 11, 13 og 15. Desuden blev musene injiceret med anti-CD4 , anti-CD8 og anti-asiago GM1-antistoffer på dag 6, 8 og 10. Tumorvækstkurver (data er vist som middelværdi ± SEM) og overlevelseskurver blev registreret (n=6 mus pr. gruppe, p-værdier beregnes via log-rank analyse). c) IHC-billeder af 4T1-tumorsnit. Mus med 4T1 TNBC-tumorer (gennemsnitlig tumorvolumen: 200 mm3) blev to gange iv injiceret med PBS, 10 ug IL-12 eller tilsvarende Nano-IL-12 på dag 0 og 3. På dag 7, mus blev aflivet for at opsamle tumorerne. CD8+-, Tbet- eller PD-L1+-cellerne i tumorerne er visualiseret i gult. Cellekernerne blev farvet med Hoechst (blå). Målestok=1 mm. d) Immunfarvning af Granzyme B (grøn) og CD8 (rød) i 4T1 tumorsektioner. Cellekernerne blev farvet med Hoechst (blå). Gule pixels indikerer aktiverede CD8+ T-celler. Målestok=100 μm. e) Analyse af lymfoide cellers infiltration i 4T1-HA-tumorer behandlet med PBS, anti-PD1-antistoffer, IL-12, Nano-IL-12, IL-12 plus anti- PD1-antistoffer og Nano-IL-12 plus anti-PD1-antistoffer. IL-12 og Nano-IL-12 blev injiceret iv ved 10 ug på dag 7 og 9 efter inokulation. Anti-PD-1 blev ip injiceret ved 100 ug på dag 8 og 10 efter inokulation. På dag 17 blev mus aflivet, og tumorerne blev homogeniseret til flowcytometrimåling (data er vist som middelværdi ± SD, n=5 prøver pr. gruppe, p-værdier beregnes via envejs ANOVA).

2.5. Nano-IL-12-behandling aktiverer TME fra transskriptionsniveauet til potentieret ICI-respons

Vi undersøgte derefter aktiveringen af ​​TME af 4T1-HA-tumorer efter behandlingerne fra genekspressionsniveauet ved transkriptomanalyse. Sekventering af de samlede RNA-prøver ekstraheret fra tumorvæv blev udført efter behandling med PBS, anti-PD-1 antistoffer, IL-12, Nano-IL-12 og kombinationerne af cytokinerne med ICI'er. Varmekortet for global genekspression indikerede klart de differentierede genprofiler i tumorer, der modtog Nano-IL-12 og kombinationen af ​​Nano-IL-12 med anti-PD- 1 (Figur S11, Understøttende oplysninger ). For at specificere de påvirkede biologiske processer ved Nano-IL-12-behandling analyserede vi de differentielt udtrykte gener i hver gruppe og udførte en berigelsesanalyse på de opregulerede og nedregulerede gener (figur 5a,b). Både GOBP- og KEGG-analyse afslørede, at sammenlignet med IL-12 og PBS, opregulerede Nano-IL-12-behandling tydeligt stimuleringen af ​​proliferation, differentiering og funktionel aktivering af forskellige effektorimmunceller, såsom T-celler proliferation, differentiering af T-celler til Th-celler og T-celleaktivering og T-cellereceptorsignalvej. Desuden viste det sig, at gener relateret til PD-L1-ekspression og PD-1-kontrolpunktsti blev opreguleret ved Nano-IL-12-behandling. Disse resultater understøtter den robuste stimulering af NanoIL-12 til T-celler observeret i flowcytometri- og immunhistologiundersøgelserne. Samtidig blev gener forbundet med andre immunceller, såsom monocytter og NK-celler, positivt påvirket af Nano-IL-12-behandlingen. Cytokinrespons og andre immunprocesser, såsom antigenpræsentation, blev også opreguleret fra Nano-IL-12-behandling. På den anden side nedregulerede Nano-IL-12 veje forbundet med celledeling, hvilket tyder på, at behandlingen kunne undertrykke spredningen af ​​tumorceller (figur S11, understøttende information). Disse resultater indikerer fordelene ved Nano-IL-12 ved at aktivere både de medfødte og adaptive arme af intratumoral immunitet.

Yderligere undersøgelser af kombinationsterapierne afslørede, at kombinationsbehandlingen af ​​Nano-IL-12 plus anti-PD-1 antistoffer forbedrede den intratumorale immunitet sammenlignet med IL-12 plus anti-PD{{6} } antistoffer eller anti-PD-1 monoterapi ved at stimulere både medfødte og adaptive immunbaner (figur 5b og figur S11c, understøttende information). Imponerende nok resulterede kombinationen af ​​NanoIL-12 plus anti-PD-1-antistoffer i stærkere hæmning af de veje, der er forbundet med mitose, og det udledes, at denne kombination kunne formidle en stærkere dræbende aktivitet af de infiltrerede effektorceller mod tumorceller. Baseret på RNA-seq-resultaterne analyserede vi også populationerne af tumorinfiltrerende immunceller (figur 5c, d). Ligesom resultatet fra flowcytometri viste Nano-IL-12-behandlede grupper øget infiltration af CD8+ T-celler. Desuden afslørede resultaterne også opreguleringen af ​​monocytter og granulocytter, hvilket bekræfter den øgede inflammation i tumorer fra de boostede medfødte immunbaner. Disse resultater bekræftede, at Nano-IL-12 sætter en potent immunrespons mod tumorer, og kombinationen med anti-PD-1 kan styrke denne proces.

Figur 5. Nano-IL-12-behandling øger immunaktivering i TME for at forstærke anti-PD1-antistoffer. a) Vulkanplot af de differentielt udtrykte gener i sammenligning mellem Nano-IL-12 versus IL-12 og Nano-IL-12 + anti-PD-1 versus IL{{12} } anti-PD-1. Plotterne blev opnået fra RNA-seq-analyse af 4T1-HA-tumorer behandlet med forskellige behandlinger: 10 ug IL-12 og tilsvarende Nano-IL-12 blev injiceret iv på dag 7 og 9 efter inokulation . Anti-PD-1 blev ip injiceret ved 100 ug på dag 8 og 10 efter inokulation. På dag 17 blev mus aflivet for at indsamle tumorprøverne. b) Berigelsesanalyse, der viser de opregulerede veje i de to sammenligningspar i en. c) Heatmap af cellepopulationer i TME bestemt ved RNA-seq. Populationerne blev konverteret til Z-score for at plotte figuren. d) Histogrammer af cellepopulationerne, der viser signifikante forskelle i flere sammenligninger (data er vist som middelværdi ± SD; for PBS-gruppe, n=5 prøver; for andre grupper, n=4 prøver pr. gruppe; p-værdier beregnes via envejs ANOVA).

2.6. Nano-IL-12 synergerer med ICI'er for effektivt at udrydde primære og metastatiske tumorer

For at undersøge det terapeutiske potentiale af Nano-IL-12 til at synergi med ICI'er blev ortotopiske primære TNBC-tumorer etableret i mus ved at inokulere 4T1-celler til brystfedtpuden. Musene blev behandlet med Nano-IL-12 efter forskellige dosisskemaer og kombinationsmønstre med ICI'er for at teste den antitumorale effektivitet af de tilsvarende behandlinger. Vi fandt, at selv under en lav dosis (1 ug IL-12 ækvivalens/injektion), udøvede den gentagne behandling med Nano-IL-12 en klar antitumoraktivitet mod primære TNBC-tumorer som monoterapi, som vist ved undertrykkelse af tumorvæksthastigheden og den forlængede overlevelse (figur S12, understøttende information). Imidlertid viste gratis IL-12-behandling under denne dosis ingen effekt, selv ikke når det blev kombineret med anti-PD-1-behandling. Kombinationen af ​​Nano-IL- 12 med anti-PD-1 øgede effektiviteten yderligere, og CR blev opnået. Vi undersøgte derefter en højere Nano-IL-12 dosis (10 ug IL-12 ækvivalens/injektion) og kombinerede den med ICI cocktails (antiPD-1 og anti-CTLA4 antistoffer) for at opfylde den terapeutiske potentiel. Navnlig ved denne dosis stoppede kombinationsterapien af ​​Nano-IL-12 med ICI'er tumorvæksten og udryddede tumorer fuldstændigt (figur 6a), hvor alle mus viste CR i denne behandlingsgruppe. Desuden viste de helbredte mus resistens mod tumorgenudsættelse med 4T1-celler, hvilket understøttede eksistensen af ​​en robust immunhukommelse fra behandlingen med Nano-IL-12 og ICIs kombinationsterapi.

cistanche planteforøgende immunsystem

TNBC er kendt som en aggressiv tumor med en høj frekvens af fjernmetastaser.[48,49] Derfor undersøgte vi derefter ydeevnen af ​​Nano-IL-12 i en metastatisk TNBC-model. En spontan metastatisk TNBC-model blev etableret ved resektion af de primære ortotopiske 4T1-tumorer, hvilket vil føre til udvikling af metastaser i flere organer, primært lungerne.[50] I denne model afslørede kombinationsterapien af ​​Nano-IL-12 med ICI'er også tilfredsstillende resultater, som stoppede progressionen af ​​lungemetastase (figur 6b) og førte til CR i alle de behandlede mus. Efter genudfordring med en iv-injektion af 4T1-celler viste de fleste helbredte mus desuden robust resistens, hvilket indikerer en effektiv immunhukommelse fra kombinationen Nano-IL-12 og ICI'er. Udover TNBC testede vi også Nano-IL-12 i kombination med ICI i en primær B16F10 melanommodel (Figur S13, Understøttende oplysninger). Resultaterne viste, at kombinationen af ​​Nano-IL-12 (10 ug IL-12 ækvivalens/injektion) med anti-PD-1 antistof førte til CR i 4 mus ud af 6 i gruppen , og de helbredte mus viste modstand mod genudfordring med B16F10-celler, hvilket tyder på en stærk immunologisk hukommelse.

3. Diskussion

Vi har udviklet en tumoraktiverbar IL-12-strategi ved hjælp af følsomme nanocytokiner (Nano-IL-12), der kan dæmpe bioaktiviteten af ​​IL-12 ved pH 7,4, men hente det fuldt aktive cytokin ved intratumoral pH. Ved systemisk injektion cirkulerede Nano-IL-12 stabilt i blodbanen, hvilket reducerede immunresponset på ikke-patologiske steder og forekomsten af ​​irAE'er, selv efter gentagen administration. På den anden side fører den høje akkumulering og aktivering af Nano-IL-12 i tumorer til en betydelig forbedring af effektiviteten og synergien med ICI'er, opnår CR i kolde tumormodeller, der er resistente over for ICI'er, og giver en solid immunhukommelse efter behandling.

Nano-IL-12 aktiverede TME dybt ved at fremkalde stærk sekretion af inflammatoriske cytokiner, øget infiltration af effektorceller og nedsat tilstedeværelse af immunsuppressive celler. Desuden opregulerede Nano-IL-12 niveauerne af PD-L1 i tumorceller, hvilket kan fremme aktiviteten af ​​anti-PD-1 antistoffer. Ændringerne i TME forårsaget af Nano-IL-12 samarbejdede med antiPD-1 antistoffer for at stimulere kræftimmunitet gennem forbedring af antigenpræsentationen, den øgede tilstedeværelse af effektorceller og styrkelsen af ​​deres aktivitet, og fremme af immuncelleinteraktioner. Kliniske undersøgelser har vist, at anti-PD1/anti-PD-L1 checkpoint blokade har en højere responsrate hos PD-L1-positive TNBC patienter med et højt antal tumorinfiltrerende lymfocytter.[51,52] den overordnede ydeevne af immunkontrolpunktblokade som monoterapi mod TNBC var ikke tilfredsstillende[53,54] på grund af det generelt lave udtryk og den signifikant heterogene TME af TNBC[55,56] Faktisk kun PD-L1 blokering i kombination med kemoterapi (Nab-Paclitaxel) er blevet godkendt til metastaserende TNBC-patienter, hvilket blot giver en beskeden samlet overlevelsesfordel hos en lille del af TNBC-patienter.[57] Potentialet for Nano-IL-12 til at tilsidesætte den immunsuppressive TME og booste PD-L1-ekspressionen af ​​TNBC kan således udgøre et robust alternativ til at øge responsraterne for kontrolpunktblokade. Den øgede sikkerhed ved Nano-IL-12 er også en væsentlig fordel ved terapeutisk anvendelse. Tidligere kliniske undersøgelser har vist, at systemisk injiceret IL-12 inducerer stærk hæmatologisk og hepatisk toksicitet.[58,59] Sådanne bivirkninger er hovedsageligt forbundet med produktionen af ​​IFN-𝛾 og TNF-𝛼 induceret af IL{{40} } behandling.[42,60] I vores undersøgelse viste Nano-IL-12 signifikant lavere cytokinniveauer end frit IL-12 i blod og organer, hvilket begrænsede organskader. Således var vi i stand til at injicere Nano-IL- 12 flere gange med 10 ug IL-12 pr. mus, det vil sige omkring 500 ug kg-1, hvilket er ca. {{52} } gange højere end den maksimalt tolererede dosis (MTD) af IL-12 hos mennesker, dvs. 500 ng kg-1. [61] En anden vigtig bivirkning af systemisk IL-12-terapi observeret i kliniske undersøgelser er starten på et adaptivt antiinflammatorisk respons efter en anden administration af IL-12, hvilket fører til reduktion af effektiviteten. [20,21] Et sådant fænomen er blevet forbundet med negative feedback-mekanismer relateret til overproduktion af anti-inflammatorisk IL-10 og faldet af pro-inflammatoriske cytokiner som IFN-𝛾, TNF-𝛼 og IL{{ 67}}.[20,22] Nano-IL-12 undgik stigningen af ​​IL-10 i blod og organer efter den anden administration, hvilket kunne være praktisk til at gennemføre gentagne administrationsskemaer uden nedgang i antitumor virkninger. Navnlig øgede behandlingen med Nano-IL-12 ikke IL-10-koncentrationen i tumorer, hvilket bibeholdt høje intratumorale niveauer af IFN-𝛾, TNF-𝛼 og IL-6.

Figur 6. Nano-IL-12 synergerer med immuncheckpoint-hæmmere for at udrydde brysttumorer. I både ortotropiske og metastatiske TNBC-modeller blev mus grupperet til at modtage PBS, IL-12 + ICI'er (anti-CTLA4 og anti-PD-1) og Nano-IL-12 + ICI'er-terapier (dosis og behandlingsplan blev vist i skemaet ved henholdsvis de øverste paneler). a) Kombinationsterapi af Nano-IL-12 og ICI'er førte til fuldstændig udryddelse af ortotopiske tumorer i alle behandlede mus. De individuelle tumorvækstkurver er vist i venstre panel. Det gennemsnitlige tumorvolumen og overlevelseskurver er vist i panelet øverst til højre. De helbredte mus viste robust forsvar mod genudfordringsinjektion med 4T1-celler til brystet, uden tumorvækst på de behandlede mus (nederste højre panel). b) Kombinationsterapi af Nano-IL-12 og ICI'er viste stærk hæmning mod metastatisk tumorprogression. Efter behandling (dag 23) viste lungerne hos mus behandlet med Nano-IL-12 + ICIs kombinationsterapi klart færre metastaser, vist ved de repræsentative billeder (grønne pile: makroskopisk metastase) og histologisk evaluering (Skalalinje {{21 }} μm) præsenteret i venstre panel. Nano-IL-12 + ICIs kombinationsbehandling førte til sidst til et fuldstændigt respons hos alle behandlede mus, som angivet af overlevelseskurverne (øverst højre panel). Kuremusene viste også robust forsvar mod genudfordring af tumor ved injektion af 4T1-celler (nederste højre panel). (Data er vist som middel ± SEM.; n=6 mus pr. gruppe; p-værdier beregnes via log-rank analyse).

Fordi IL-12 regnes for at være en af ​​de mest kraftfulde immunstimulerende cytokiner, undersøges flere tilgange intenst for at svække IL-12-induceret toksicitet og forstærke dens effektivitet. Strategier, der anvender direkte intratumoral injektion, såsom formuleringer baseret på IL-12 og adjuvanser[62] og plasmid-DNA[63] eller messenger-RNA[64] der koder for IL-12 til fremstilling af cytokinet in situ, kan maksimere det terapeutiske indeks.[8] Imidlertid kan den lokale administration stå over for adskillige begrænsninger i klinikken, herunder behandling af tumorer, der vokser i ikke-injicerbare positioner,[65] operatørafhængig effektivitet,[66] ujævn fordeling af de injicerede lægemidler i tumoren[67] og lækage-induceret levering uden for målretningen.[68] Desuden er anticanceraktiviteten af ​​de intratumoralt injicerede formuleringer mod fjernmetastaser i høj grad afhængig af den variable effektivitet af en abskopal effekt,[69], som har vist lave forekomstrater i kliniske undersøgelser[70-72] og muligvis ikke er i stand til at overvinde immunsuppressive signaler i metastaser.[73] Muligheden for sikkert at administrere Nano-IL-12 ved systemisk intravenøs injektion, som er en standard klinisk procedure, kan tillade forudsigelig farmakokinetik og har potentiale til at få adgang til alle tumorsteder gennem blodforsyningen. IL-12-baserede Fc-fusionsproteiner[14] og immuncytokiner[11-13] deler også disse fordele med NanoIL-12. Imidlertid er IL-12-komponenten i disse forbindelser aktiv systemisk, hvilket giver anledning til sikkerhedsproblemer. For eksempel har langcirkulerende fusionsproteiner af IL-12 vist høje niveauer af serum IFN-𝛾[74,75] og IL-12 immuncytokiner har vist ophobninger til steder uden for målet.[76, 77] Evnen af ​​Nano-IL-12 til at kontrollere den spatiotemporale aktivering kunne give en sikker og potent strategi med specificitet i tumormålretning.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

En begrænsning af vores nuværende undersøgelse er, at Nano-IL-12 er baseret på muse-IL-12. I betragtning af, at homologien mellem mus IL-12 og human IL-12 er omkring 60-70 %, ville yderligere undersøgelser være nødvendige for at bestemme formuleringen af ​​et humant IL-12-baseret nanocytokin med aktivitet og sikkerhedsprofiler, der kan sammenlignes med det mus-baserede system. Foreløbige tests har heldigvis vist, at de polymerer, der blev brugt i vores undersøgelse, også kan belægge human IL-12 med lignende pH-følsomhed. Desuden, da polymererne kan konstrueres præcist, ville det være muligt at udvikle et menneskeligt IL-12-baseret system med passende rumlige profiler til menneskelig brug. Som konklusion opnåede Nano-IL-12 som nanocytokiner effektiv spatiotemporal kontrol af IL-12-aktivitet ved systemisk administration, hvilket sikrede præcis stimulering af intratumoral immunitet for at opnå tilfredsstillende sikkerhed og terapeutiske resultater i primær og metastatisk kold tumor modeller, synergi med checkpoint blokade. Da polymererne, der bruges til at samle Nano-IL-12, kunne konstrueres til at indkapsle en lang række proteiner med forskellige molekylvægte og overfladeladning, har systemet potentiale for bredere anvendelsesmuligheder, såsom indkapsling af andre terapeutiske cytokiner eller endda cytokin cocktails. Da det polymere system kunne konstrueres yderligere til at fornemme andre stimuli udover pH, [78] kan nanocytokinerne desuden designes til at målrette forskellige tumormikromiljøer. Endelig, i betragtning af translationspotentialet af de anvendte polymerer og nanocytokiner, lover denne strategi et løfte for fremtiden for cancerimmunterapi.

referencer

[1] AJ Korman, SC Garrett-Thomson, N. Lonberg, Nat. Rev. Drug Discovery 2021, 21, 509.

[2] A. Ribas, JD Wolchok, Science 2018, 359, 1350.

[3] A. Haslam, V. Prasad, JAMA Network Open 2019, 2, e192535.

[4] P. Sharma, BA Siddiqui, S. Anandhan, SS Yadav, SK Subudhi, J. Gao, S. Goswami, JP Allison, Cancer Discovery 2021, 11, 838.

[5] JD Martin, H. Cabral, T. Stylianopoulos, RK Jain, Nat. Rev. Clin. Oncol. 2020, 17, 251.

[6] CM Fares, EM Van Allen, CG Drake, JP Allison, S. HuLieskovan, Am. Soc. Clin. Oncol. Educ. Bestil. 2019, 39, 147.

[7] K. Chamoto, R. Hatae, T. Honjo, Int. J. Clin. Oncol. 2020, 25, 790.

[8] KG Nguyen, MR Vrabel, SM Mantooth, JJ Hopkins, ES Wagner, TA Gabaldon, DA Zaharoff, Front. Immunol. 2020, 11, 2510.

[9] EA Chiocca, AB Gelb, CC Chen, G. Rao, DA Reardon, PY Wen, WL Bi, P. Peruzzi, C. Amidei, D. Triggs, L. Seften, G. Park, J. Grant, K. Truman, JY Buck, N. Hadar, N. Demars, J. Miao, T. Estupinan, J. Loewy, K. Chadha, J. Tringali, L. Cooper, R.V Lukas, Neuro-Oncology 2021, 24, 951.

[10] B. Mirlekar, Y. Pylayeva-Gupta, Cancers 2021, 13, 167.

[11] A. Mansurov, J. Ishihara, P. Hosseinchi, L. Potin, TM Marchell, A. Ishihara, J.-MM Williford, AT Alpar, MM Raczy, LT Gray, MA Swartz, JA Hubbell, Nat. Biomed. Eng. 2020, 4, 531.

[12] N. Pasche, D. Neri, Drug Discovery Today 2012, 17, 583.

[13] J. Strauss, CR Heery, JW Kim, C. Jochems, RN Donahue, AS Montgomery, S. McMahon, E. Lamping, JL Marte, RA Madan, M. Bilusic, MR Silver, E. Bertotti, J. Schlom, JL Gulley, Clin. Cancer Res. 2019, 25, 99.

[14] K. Jung, JH Ha, JE Kim, JA Kim, YJ Kim, CH Kim, YS Kim, OncoImmunology 2018, 7, e1438800.

[15] A. Mansurov, P. Hosseinchi, K. Chang, AL Lauterbach, LT Gray, AT Alpar, E. Budina, AJ Slezak, S. Kang, S. Cao, A. Solanki, S. Gomes, J.- M. Williford, MA Swartz, JL Mendoza, J. Ishihara, JA Hubbell, Nat. Biomed. Eng. 2022, 6, 819.

[16] HD Chang, A. Radbruch, ekspert Rev. Clin. Immunol. 2014, 3, 709.

[17] H. Chang, A. Radbruch, D. Rheumaforschungszentrum, Ann. NY Acad. Sci. 2007, 1109, 40.

[18] S. Tugues, SH Burkhard, I. Ohs, M. Vrohlings, K. Nussbaum, J. Vom Berg, P. Kulig, B. Becher, Cell Death Differ. 2014, 22, 237.

[19] C. Asselin-Paturel, M. Isabelle Vergnon, B. Hamid Echchakir, M. Guillaume Dorothé, M. Sé vrine Blesson, M. Franç oise Gay, B. Fathia Mami-Chouaib, S. Chouaib, Cancer 2001, 91, 113.

[20] JEA Portielje, CHJ Lamers, WHJ Kruit, A. Sparreboom, RLH Bolhuis, G. Stoter, C. Huber, JW Gratama, Clin. Cancer Res. 2003, 9, 76.

[21] JP Leonard, ML Sherman, GL Fisher, LJ Buchanan, G. Larsen, MB Atkins, JA Sosman, JP Dutcher, NJ Vogelzang, JL Ryan, Blood 1997, 90, 2541.

[22] E. Bajetta, M. Del Vecchio, R. Mortarini, R. Nadeau, A. Rakhit, L. Rimassa, C. Fowst, A. Borri, A. Anichini, G. Parmiani, Clin. Cancer Res. 1998, 4, 75.

[23] C. Corbet, O. Feron, Nat. Rev. Cancer 2017, 17, 577. [24] M. Bellone, A. Calcinotto, P. Filipazzi, A. De Milito, S. Fais, L. Rivoltini, Oncoimmunology 2013, 2, e22058.

[25] S. Damgaci, A. Ibrahim-Hashim, PM Enriquez-Navas, S. PilonThomas, A. Guvenis, RJ Gillies, Immunology 2018, 154, 354.

[26] J. Liu, H. Cabral, B. Song, I. Aoki, Z. Chen, N. Nishiyama, Y. Huang, K. Kataoka, P. Mi, ACS Nano 2021, 15, 13526.

[27] A. Tao, GLo Huang, K. Igarashi, T. Hong, S. Liao, F. Stellacci, Y. Matsumoto, T. Yamasoba, K. Kataoka, H. Cabral, Macromol. Biosci. 2020, 20, 1900161.

[28] Y. Mochida, H. Cabral, Y. Miura, F. Albertini, S. Fukushima, K. Osada, N. Nishiyama, K. Kataoka, ACS Nano 2014, 8, 6724.

[29] JS Suk, Q. Xu, N. Kim, J. Hanes, LM Ensign, Adv. Lægemiddellevering rev. 2016, 99, 28.

[30] CY Sun, Y. Liu, JZ Du, ZT Cao, CF Xu, J. Wang, Angew. Chem., Int. Ed. 2016, 55, 1010.

[31] A. Ibrahim-Hashim, V. Estrella, Cancer Metastasis Rev. 2019, 38, 149.

[32] G. Trinchieri, F. Gerosa, J. Leukocyte Biol. 1996, 59, 505.

[33] T. Starciuc, B. Malfait, F. Danede, L. Paccou, Y. Guinet, NT Correia, A. Hedoux, J. Pharm. Sci. 2020, 109, 496.

[34] G. Egawa, S. Nakamizo, Y. Natsuaki, H. Doi, Y. Miyachi, K. Kabashima, Stem Cells Int. 2013, 3, 1932.

[35] S. Jayanthi, BP Koppolu, KG Nguyen, SG Smith, BK Felber, TKS Kumar, DA Zaharoff, Stem Cells Int. 2017, 7, 5360.

[36] MP Hwuang, RJ Fecek, T. Qin, WJ Storkus, Y. Wang, J. Controlled Release 2019, 318, 270.

[37] Q. Wang, Y. Wang, J. Ding, C. Wang, X. Zhou, W. Gao, H. Huang, F. Shao, Z. Liu, Nature 2020, 579, 421.

[38] G. Trinchieri, Annu. Rev. Immunol. 1995, 13, 251.

[39] L. Meyaard, E. Hovenkamp, ​​SA Otto, F. Miedema, J. Immunol. 1996, 156, 2776.

[40] A. Cope, GLe Friec, J. Cardone, C. Kemper, Trends Immunol. 2011, 32, 278.

[41] SP Kerkar, RS Goldszmid, P. Muranski, D. Chinnasamy, Z. Yu, RN Reger, AJ Leonardi, RA Morgan, E. Wang, FM Marincola, G. Trinchieri, SA Rosenberg, NP Restifo, J. Clin . Investere. 2011, 121, 4746.

[42] W. Lasek, R. Zago˙zd˙zon, M. Jakobisiak, Cancer Immunol. Immunother. 2014, 63, 419.

[43] C. Zhang, J. Zhang, J. Niu, Z. Zhou, J. Zhang, Z. Tian, ​​Hum. Immunol. 2008, 69, 490.

[44] NG Jacobson, SJ Szabo, RM Weber-Nordt, Z. Zhong, RD Schreiber, JE Darnell, KM Murphy, J. Exp. Med. 1995, 181, 1755.

[45] K. Mimura, JL Teh, H. Okayama, K. Shiraishi, LF Kua, V. Koh, DT Smoot, H. Ashktorab, T. Oike, Y. Suzuki, Z. Fazreen, BR Asuncion, A. Shabbir , WP Yong, J. Så, R. Soong, K. Kono, Cancer Sci. 2018, 109, 43.

[46] T. Watanabe, S. Watanabe, G. Neumann, H. Kida, Y. Kawaoka, J. Virol. 2002, 76, 767.

[47] AS Bergot, A. Durgeau, B. Levacher, BM Colombo, JL Cohen, D. Klatzmann, Cancer Gene Ther. 2010, 17, 645.

[48] ​​R. Dent, M. Trudeau, KI Pritchard, WM Hanna, HK Kahn, CA Sawka, LA Lickley, E. Rawlinson, P. Sun, SA Narod, Clin. Cancer Res. 2007, 13, 4429.

[49] BG Haffty, Q. Yang, M. Reiss, T. Kearney, SA Higgins, J. Weidhaas, L. Harris, W. Hait, D. Toppmeyer, J. Clin. Oncol. 2006, 24, 5652.

[50] AV Paschall, K. Liu, J. Visualized Exp. 2016, 2016, 54040.

[51] A. Marra, G. Viale, G. Curigliano, BMC Med. 2019, 17, 90.

[52] R. Thomas, G. Al-Khadairi, J. Decock, Front. Oncol. 2021, 10, 3464.

[53] S. Adams, P. Schmid, HS Rugo, EP Winer, D. Loirat, A. Awada, DW Cescon, H. Iwata, M. Campone, R. Nanda, R. Hui, G. Curigliano, D. Toppmeyer, J. O'Shaughnessy, S. Loi, S. Paluch-Shimon, AR Tan, D. Card, J. Zhao, V. Karantza, J. Cortés, Ann. Oncol. 2019, 30, 397.

[54] LY Dirix, I. Takacs, G. Jerusalem, P. Nikolinakos, HT Arkenau, A. Forero-Torres, R. Boccia, ME Lippman, R. Somer, M. Smakal, LA Emens, B. Hrinczenko, W. Edenfield, J. Gurtler, A. von Heydebreck, HJ Grote, K. Chin, EP Hamilton, Breast Cancer Res. Behandle. 2018, 167, 671.

[55] EA Mittendorf, AV Philips, F. Meric-Bernstam, N. Qiao, Y. Wu, S. Harrington, X. Su, Y. Wang, AM Gonzalez-Angulo, A. Akcakanat, A. Chawla, M. Curran, P. Hwu, P. Sharma, JK Litton, JJ Molldrem, G. Alatrash, Cancer Immunol. Res. 2014, 2, 361.

[56] MT Barrett, E. Lenkiewicz, S. Malasi, A. Basu, JH Yearley, L. Annamalai, AE McCullough, HE Kosiorek, P. Narang, MA Wilson Sayres, M. Chen, KS Anderson, BA Pockaj, Breast Cancer Res. 2018, 20,71.

[57] P. Schmid, S. Adams, HS Rugo, A. Schneeweiss, CH Barrios, H. Iwata, V. Diéras, R. Hegg, S.-A. Im, GS Wright, V. Henschel, L. Molinero, SY Chui, R. Funke, A. Husain, EP Winer, S. Loi, LA Emens, N. Engl. J. Med. 2018, 379, 2108.

[58] MK Gately, U. Gubler, MJ Brunda, RR Nadeau, TD Anderson, JM Lipman, U. Sarmiento, Ther. Immunol. 1994, 1, 187.

[59] UM Sarmiento, JH Riley, PA Knaack, JM Lipman, JM Becker, MK Gately, R. Chizzonite, TD Anderson, Lab. Investere. 1994, 71, 862.

[60] VM Eng, BD Car, B. Schnyder, M. Lorenz, S. Lugli, M. Aguet, TD Anderson, B. Ryffel, VFJ Quesniaux, J. Exp. Med. 1995, 181, 1893.

[61] JA Gollob, KG Veenstra, RA Parker, JW Mier, DF McDermott, D. Clancy, L. Tutin, H. Koon, MB Atkins, J. Clin. Oncol. 2003, 21, 2564.

[62] Y. Agarwal, LE Milling, JYH Chang, L. Santollani, A. Sheen, EA Lutz, A. Tabet, J. Stinson, K. Ni, KA Rodrigues, TJ Moyer, MB Melo, DJ Irvine, KD Wittrup , Nat. Biomed. Eng. 2022, 6, 129.

[63] ML Lucas, L. Heller, D. Coppola, R. Heller, Mol. Ther. 2002, 5, 668.

[64] SL Hewitt, D. Bailey, J. Zielinski, A. Apte, F. Musenge, R. Karp, S. Burke, F. Garcon, A. Mishra, S. Gurumurthy, A. Watkins, K. Arnold, J. Moynihan, E. Clancy-Thompson, K. Mulgrew, G. Adjei, K. Deschler, D. Potz, G. Moody, DA Leinster, S. Novick, M. Sulikowski, C. Bagnall, P. Martin, JM Lapointe, H. Si, C. Morehouse, M. Sedic, RW Wilkinson, R. Herbst, et al., Clin. Cancer Res. 2020, 26, 6284.

[65] RS Riley, CH June, R. Langer, MJ Mitchell, Nat. Rev. Drug Discovery 2019, 18, 175.

[66] I. Melero, E. Castanon, M. Alvarez, S. Champiat, A. Marabelle, Nat. Rev. Clin. Oncol. 2021, 18, 558.

[67] LM Wein, JT Wu, DH Kirn, Cancer Res. 2003, 63, 1317.

[68] J. Hong, C.-O. Yun, BMC Biomed. Eng. 2019, 1, 17.

[69] A. Mukhopadhyay, J. Wright, S. Shirley, DA Canton, C. Burkart, RJ Connolly, JS Campbell, RH Pierce, Gene Ther. 2018, 26, 1.

[70] MA Postow, MK Callahan, CA Barker, Y. Yamada, J. Yuan, S. Kitano, Z. Mu, T. Rasalan, M. Adamow, E. Ritter, C. Sedrak, AA Jungbluth, R. Chua , AS Yang, R.-A. Roman, S. Rosner, B. Benson, JP Allison, AM Lesokhin, S. Gnjatic, JD Wolchok, N. Engl. J. Med. 2012, 366, 925.

[71] EF Stamell, JD Wolchok, S. Gnjatic, NY Lee, I. Brownell, Int. J. Radiat. Oncol., Biol., Phys. 2013, 85, 293.

[72] EB Golden, S. Demaria, PB Schiff, A. Chachoua, SC Formenti, Cancer Immunol. Res. 2013, 1, 365.

[73] TY Seiwert, AP Kiess, J. Clin. Oncol. 2021, 39, 1.

[74] E. Gutierrez, M. Bigelow, C. LaCroix, P. Kirby, L. Markowitz, M. Naill, S. O'Neil, PA Hull, J. Engelhardt, J.-M. Cuillerott, A. Cheung, A. Grinberg, N. Wagtmann, Cancer Res. 2021, 81, 1714

[75] R. Varma, K. Liu, C. Bonzon, R. Rashid, N. Rodriguez, N. Hassanzadeh-Kiabi, C. Ardila, SY Chu, US Muchhal, JR Desjarlais, MJ Bernett, Cancer Res. 2020, 80, 5549.

[76] J. Sharifi, LA Khawli, P. Hu, S. King, AL Epstein, Hybrid Hybridomics 2001, 20, 305.

[77] C. Halin, S. Rondini, F. Nilsson, A. Berndt, H. Kosmehl, L. Zardi, D. Neri, Nat. Biotechnol. 2002, 20, 264.

[78] S. Mura, J. Nicolas, P. Couvreur, Nat. Mater. 2013, 12, 991.

[79] E. Becht, NA Giraldo, L. Lacroix, B. Buttard, N. Elarouci, F. Petitprez, J. Selves, P. Laurent-Puig, C. Sautès-Fridman, WH Fridman, A. de Reyniès, Genom Biol. 2016, 17, 218