Zika Virus Ikke-strukturelt Protein 4B interagerer med DHCR7 for at lette viral infektion

ABSTRAKT

Zika-virus (ZIKV) udvikler ikke-strukturelle proteiner for at undgå immunrespons og sikre effektiv replikation i værtscellerne. Kolesterol metabolisk enzym 7-dehydrocholesterol reduktase (DHCR7) blev for nylig rapporteret at påvirke medfødte immunresponser i ZIKV-infektion. Det vitale ikke-strukturelle protein og de mekanismer, der er involveret i DHCR7-medieret virusunddragelse, er imidlertid ikke godt belyst. I denne undersøgelse viste vi, at ZIKV-infektion lettede DHCR7-ekspression. Især lettede den opregulerede DHCR7 igen ZIKV-infektion og blokering af DHCR7-undertrykte ZIKV-infektion. Mekanisk interagerede ZIKV ikke-strukturelt protein 4B (NS4B) med DHCR7 for at inducere DHCR7-ekspression. Desuden hæmmede DHCR7 TANK-bindende kinase 1 (TBK1) og interferon regulatorisk faktor 3 (IRF3) phosphorylering, hvilket resulterede i reduktion af interferon-beta (IFN-) og interferon-stimulerede gener (ISG'er) produktioner. Derfor foreslår vi, at ZIKV NS4B binder til DHCR7 for at undertrykke TBK1- og IRF3-aktivering, hvilket igen hæmmer IFN- og ISG'er, og derved letter ZIKV-unddragelse. Denne undersøgelse udvider indsigten i, hvordan virale ikke-strukturelle proteiner antagoniserer medfødt immunitet for at lette viral infektion via kolesterolmetaboliske enzymer og mellemprodukter.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

1. Introduktion

Som et myggebåret flavivirus blev Zika-virus (ZIKV) oprindeligt identificeret fra rhesus-makak i Uganda i 1947. ZIKV-epidemien gennemgik adskillige udbrud verden over, og ZIKV-epidemien er blevet en kumulativ global sundhedstrussel på grund af den eksplosive ekspansion gennem myggeveje, verdensomspændende rejser med asymptomatiske transportører og seksuel overførsel. De fleste ZIKV-infektioner i tidligere epidemier var asymptomatiske eller milde (Wang et al., 2016), men i de seneste adskillige epidemier har ZIKV-infektion ført til ødelæggende sygdomme, herunder neurologiske følgesygdomme under graviditeten (mikrocefali og fosterdød) og neurologisk lidelse (Guillain-Barre syndrom) hos voksne (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson og Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). Det medfødte immunsystem er den første og kritiske linje af værtens immunforsvar mod virusinfektion. Efter ZIKV-infektion blev viralt RNA genkendt af intracellulært retinsyre-inducerbart gen I (RIG-I) (Chazal et al., 2018; Hertzog et al., 2018; Kato et al., 2006), som initierede det nedstrøms medfødte immunforsvar reaktioner, herunder TANK-bindende kinase 1 (TBK1) aktivering, interferon regulatorisk faktor 3 (IRF3) phosphorylering og derefter fører til type I interferon (IFN-I) produktion (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016; Xia et al., 2018) og ekspressionen af ​​snesevis af interferon-stimulerede gener (ISG'er) med forskellige antivirale virkninger (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). Værtsimmunsystemet producerer IFN'er og ISG'er for at begrænse viral infektion, dog udviklede ZIKV selv en række forskellige flugtmekanismer for at sikre succesfuld overlevelse og replikation i værtscellen, såsom kodning af specifikke ikke-strukturelle (NS) proteiner. ZIKV genomisk RNA genererer syv ikke-strukturelle proteiner, herunder NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5 (Berhoux, 2020). ZIKV NS1 rekrutterer værtsdeubiquitinase USP8 til at stabilisere caspase-1 og dæmper type I IFN-signalering til gavn for ZIKV-infektion (Zheng et al., 2018). En mutant NS1 er blevet rapporteret at binde til TBK1 og mindske phosphoryleringen af ​​TBK1, hvilket fører til reduceret IFN-produktion (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 binder til og sekvestrerer humane stilladsproteiner (14-3-3ε og 14-3-3η) (Riedl et al., 2019), mens NS4A interagerer med MAVS for at dæmpe RIG-I- og MDA{{50} }medierede medfødte immunresponser (Ma et al., 2018). Især ZIKV NS5 binder og nedbryder signaltransducer og aktivator af transkription 2 (STAT2) for at dæmpe type I IFN-signalering (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). Desuden blev NS5 også bevist at interagere med RIG-I og undertrykke den K63--koblede polyubiquitinering af RIG-I og derved undertrykke IFN-produktion (Li et al., 2020). Derudover er ZIKV NS2A, NS2B, NS4A og NS4B også blevet påvist at overmande IFN-produktion ved at målrette mod diskrete elementer i RIG-I-vejen (Xia et al., 2018). For at opnå effektiv replikation i pattedyrsceller er ZIKV også afhængig af de værtscellulære lipidmetaboliske komponenter for at danne en kappe og komplet viral partikelsamling (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020). Kolesterol er en af ​​lipidkomponenterne i cellemembraner og deltager i flere biologiske funktioner (Ikonen, 2008). Cellulær kolesterolhomeostase er tæt moduleret af kolesterolsyntese, herunder absorption fra lipoproteinpartikler og frigivelse til ekstracellulære acceptorer. Stort set alle pattedyrsceller er afhængige af kolesterolmetabolisme (Luo et al., 2020). Akkumulerende beviser har indikeret, at kolesterolmetabolisme deltager i medfødt immunrespons mod virusinfektion (Blanc et al., 2013; Petersen et al., 2014; York et al., 2015). Ved viral infektion blev kolesterolsyntesen markant ændret og ledsaget af den øgede ekspression af IFN-I og ISG'er i makrofager (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015). Som nøgleenzymet i kolesterolmetabolismen omdanner kolesterol-25-hydroxylase (CH25H) kolesterol til 25-hydroxycholesterol (25HC), som er blevet identificeret som det biologiske produkt, der bidrager til en medfødt immunrespons mod et stort flertal af vira, herunder human immundefektvirus 1 (HIV-1), vesikulær stomatitisvirus (VSV), herpes simplex virus 1 (HSV-1), ebolavirus (EBOV), ZIKV, murint gammaherpesvirus ( MHV68), Rift valley fever virus (RVFV) og russisk forårs-sommer encephalitis virus (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013). Nuværende undersøgelser er begrænsede til at undersøge, hvordan kolesterolmetaboliske produkter (f.eks. 25HC) kunne manipulere signaltransduktion og deltage i medfødt immunitet. Til dato er enzymerne eller mellemprodukterne opstrøms for kolesterolbiosyntesen stadig ikke godt belyst. Som det vitale kolesterolmetabolske enzym kan 7-dehydrocholesterolreduktase (DHCR7) slette C (7-8) dobbeltbindingen i B-ringen af ​​steroler og katalysere kolesterolet fra 7-dehydrocholesterol ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-DHC er også en forløber for D-vitamin, og DHCR7-mutationer er forbundet med højere D-vitamin, hvilket tyder på, at DHCR7 udviser komplicerede biologiske effekter i omdannelsen af ​​kolesterol og D-vitamin (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016a). En velpræsenteret undersøgelse har vist, at DHCR7-stilhed kunne aktivere PI3K-AKT3-vejen, hvilket fører til IRF3 Ser385-phosphorylering og fremmer IFN-produktion for at hæmme multiple virusinfektioner in vitro og in vivo (Xiao et al., 2020). Forståelsen af ​​DHCR7-medieret kolesterolmetabolisme i ZIKV NS-proteinmedieret immunundvigelse er imidlertid dårligt defineret. Her belyser vi en særskilt mekanisme, som ZIKV NS4B målretter mod DHCR7, et nøgleenzym i kolesterolsyntese, for at svække IFN-I-responset og lette ZIKV-infektion. Vi fandt, at ZIKV-infektion øgede DHCR7-ekspression. Interessant nok fremmer forbedret DHCR7 ZIKV-infektion, mens at slå ned eller målrette mod DHCR7 med inhibitorer kan undertrykke ZIKV-infektion. Desuden kunne ZIKV NS4B binde DHCR7 og dermed inducere DHCR7-ekspression, hvilket hæmmede TBK1- og IRF3-aktivering og førte til reduceret IFN- og ISG-produktion. Derfor foreslår vi, at ZIKV NS4B-binding til DHCR7 reducerer IRF3-aktivering, hvilket igen hæmmer IFN- og ISG'er for at lette ZIKV-unddragelse. Denne undersøgelse udvider ny indsigt i, hvordan ZIKV ikke-strukturelt protein ophæver medfødt immunitet for at lette virusinfektion gennem interaktion med kolesterolmetaboliske enzymer.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Materialer og metoder

2.1. Cellelinjer

U251-celler blev købt fra China Center for Type Culture Collection (CCTCC) (Wuhan, Kina). Cercopithecus aethiops nyre (Vero) celler, humane embryonale nyre (HEK 293T) celler og humane lunge adenokarcinom (A549) celler blev købt fra American Tissue Culture Collection (ATCC). Celler blev holdt i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco), penicillin (100 U/ml) og streptomycinsulfat (100 ug/ml) ved 37 C og 5 % CO2. Aedes albopictus (C6/36) celler blev dyrket i Minimum Essential Medium (MEM) suppleret med 10% FBS, penicillin (100 U/mL) og streptomycinsulfat (100 ug/mL) ved 28 C med 5% CO2.

2.2. ZIKV amplifikation, titrering og infektion

ZIKV-isolatet z16006 (GenBank-accessionsnummer, KU955589.1) blev dyrket i C6/36-celler, og ZIKV blev uddelt i frysehætteglas og opbevaret ved 80 C. ZIKV-titre blev målt ved plakassay. Cellerne blev inficeret med ZIKV ved den angivne multiplicitet af infektion (MOI) i 2 timer, efterfulgt af vask med phosphatbuffer saltvand (PBS), og derefter dyrket, høstet og undersøgt.

2.3. Plasmider og reagenser

Ekspressionsplasmid pcDNA3.1(þ)-3 Flag blev brugt til at klone individuelle ZIKV-gener fra tilsvarende fragmenter af ZIKV-cDNA. For at konstruere pGEX6p-1-NS4B blev ZIKV NS4B subklonet ind i pGEX6p-1-vektor ved anvendelse af ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech, Nanjing, Kina). De cDNA'er, der koder for human DHCR7, RIG-I, TBK1 og IRF3, klonet ind i pCAGGS-HA-vektor eller pcDNA3.1 (þ)-3-flagvektor, blev konstrueret ved standard molekylær kloningsmetode. Missense-mutationen G410S af DHCR7 blev konstrueret ved anvendelse af site-site-directed mutagenese-metoden. Monoklonal kanin-anti-ZIKV-kappe (GTX133314) blev købt fra GeneTex (Irvine, CA, USA). Kanin polyklonal anti-DHCR7 (A8049), kanin monoklonal anti-ISG15 (A2416), kanin monoklonal anti-TBK1 (A3458), kanin monoklonal anti-P-TBK1 ved Ser172 (AP1026), kanin polyklonal anti-11F18A anti-1 -kanin-IgG (ac005) og anti-muse-IgG (ac011) blev købt fra ABclonal Technology (Wuhan, Kina). Antimuse FITC og anti-kanin Cy3 sekundære antistoffer blev købt fra Abbkine (Wuhan, Kina). Kanin monoklonalt anti-P-IRF3 ved Ser396 (29047S) og kanin monoklonalt anti-ISG56 (14769S) blev købt fra Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, USA). Muse monoklonalt anti-Flag (F3165), kanin monoklonalt anti-HA (H6908) og muse monoklonalt anti-GAPDH (G9295) blev købt fra Sigma (St Louis, MO, USA). Muse monoklonalt antiFlavivirus gruppe antigen-antistof (MAB10216) blev købt fra Millipore (Mass, USA). Lipofectamine 2000 (11668-027) og Trizol (15596018) blev købt fra Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Poly(I:C) blev købt fra InvivoGen (San Diego, CA, USA).

2.4. Plaque assay

ZIKV-holdig supernatant blev fortyndet med serumfrit DMEM og inficerede Vero-celler i en 12-brøndsplade i 2 timer, efterfulgt af vask med 1 ml PBS to gange. DMEM indeholdende 2 % FBS og 2 % agarose med lavt smeltepunkt blev blandet godt i overensstemmelse med et volumenforhold på 1:1, og 1 ml blanding blev tilsat til hver brønd. De inficerede celler blev dyrket ved 37 C med 5% CO2 i 5-7 dage. Cellerne blev fikseret med 4 % paraformaldehyd i 1 time og farvet med 0,5 % krystalviolet i 30 min. 12-brøndpladen blev vasket med vand, og plaques blev beregnet.

2.5. Lentivirus produktion og infektion

Målretningssekvenserne for shRNA'er for det humane DHCR7 var som følger: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. pLKO.1-vektoren, der bærer et forvrænget shRNA til en negativ kontrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) eller den specifikke målsekvens blev transficeret ind i HEK293T-celler sammen med psPAX2 og pMD2.G med Lipofectamine 2{{19} }00. Virale partikler indeholdende supernatanter blev høstet 36 timer efter transfektion og derefter centrifugeret ved 210 g i 10 minutter. Den cellefrie supernatantfase blev filtreret gennem et 0,45 μm filter for at fjerne celleaffaldet. U251-celler blev inficeret med lentivirale partikler i nærvær af 8 ug/ml polybren. Efter 48 timers dyrkning blev U251-celler udvalgt med puromycin (2 ug/ml, Sigma). Nedbrydningseffektiviteten af ​​sh-DHCR7 blev bestemt ved RT-PCR og Western blot-analyse.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

2.6. Western blot

Celler blev lyseret med RIPA-buffer suppleret med proteaseinhibitorer og phosphatasehæmmere på is i 1 time, derefter centrifugeret ved 4 C, 13, 000 g i 1{{10}} min for at opsamle cellen lysat. Proteinkoncentration i cellelysat blev målt ved bicinchoninsyre (BCA) proteinassay. Proteinet blev separeret ved SDS-PAGE og derefter overført til en polyvinyldifluorid (PVDF) membran. PVDF-membranen blev blokeret med immunoblotting-blokerende buffer TBST (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mol/L NaCl og 0,05 % Tween-20) indeholdende 5 % BSA i 1 time. Efter vask med TBST blev membranen inkuberet med primære antistoffer og andre antistoffer og efterfølgende påvist ved anvendelse af et Chemiluminescence-billeddannelsessystem (Bio-Rad).

2.7. Total kolesterol assay

Det totale kolesterol i celler blev påvist ved anvendelse af et Tissue total-cholesterol assaykit fra Applygen Technologies Inc. (Beijing, Kina). 5 mmol/L kolesterolstandarden blev udsat for en seriefortynding med vandfri ethanol for at tegne standardkurven, og mængderne af cellulært totalcholesterol blev beregnet i overensstemmelse med standardkurverne. Eksperimentet blev udført ved at følge den af ​​producenten angivne procedure.

2.8. Co-immunpræcipitationsassays

HEK293T-celler blev transficeret med de angivne plasmider. Celler blev høstet og lyseret med RIPA-lysebuffer suppleret med proteaseinhibitorer. Efter centrifugering ved 18, 000 g i 15 minutter ved 4 C, blev cellelysater opsamlet og immunpræcipiteret med Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) i 4 timer ved 4 C. De bundne proteiner blev elueret med 2 loading buffer og analyseret ved immunoblotting.

2.9. Realtids PCR

Totale RNA'er blev ekstraheret fra celler ved at bruge TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies), og cDNA blev produceret med et M-MLV revers transkriptase-kit (Promega, Madison, WI, USA). RT-PCR blev udført ved hjælp af SYBR RT-PCR Kits (DBI Bio-science) på Roche LC480. Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) mRNA blev sat som den endogene reference for at normalisere mRNA'erne, og genekspressionsniveauerne blev beregnet ved hjælp af 2 ΔΔCT metoden. Sekvenserne af RT-PCR-primere er vist i supplerende tabel S1. 2.10. Konfokal mikroskopi

U251-celler blev transficeret med plasmid og dyrket i 3 0 timer, derefter vasket tre gange med PBS. Celler blev fikseret med 4 % paraformaldehyd i 15 minutter og permeeret med PBS indeholdende 0,1 % TritonX-100 i 5 minutter. Efter vask med PBS blev cellerne forseglet med PBS indeholdende 5% BSA i 30 min. Celler blev vasket tre gange med PBS og inkuberet med anti-HA, anti-FLAG og anti-flavivirus, derefter inkuberet med anti-muse FITC og anti-kanin Cy3 sekundære antistoffer. Celler blev farvet med 40,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI) og udført ved hjælp af et Olympus konfokalmikroskop.

2.11. GST pull-down assays

Plasmidet pGEX6p-1-NS4B blev transficeret ind i Escherichia coli (E. coli) stamme BL21. GST og GST-NS4B blev induceret af IPTG med en slutkoncentration på 0,5 mmol/L, og kulturerne blev dyrket i yderligere 6-8 timer ved 37 C. Og derefter GST-proteinet og GST- NS4B-protein blev oprenset fra E. coli-bakterier. GST- eller GST-NS4B-proteinet blev inkuberet med glutathion-Sepharose-perler (Novagen) og vasket tre gange med PBS. GST- og GST-NS4B-protein blev inkuberet med det eukaryote fusionsprotein HA-DHCR7, som stammede fra plasmider, der koder for HA-DHCR7--udtrykte HEK293T-cellelysater i 4 timer ved 4 C. Bundfaldene blev vasket fem gange, kogt i 2 SDS loading buffer og detekteret ved Western blot med anti-GST og anti-HA antistoffer.

2.12. HA-DHCR7 site-directed mutagenese

Passende par af mutagene primere (Supplerende tabel S1) blev syntetiseret og brugt til at generere den muterede konstruktion ved PCR. HA-DHCR7 blev brugt som skabelon for PrimeSTAR® HS Premix (Takara). Efter PCR blev vildtypeplasmidet, der var tilbage i PCR-produktet, selektivt fordøjet af DpnI (New England Biolabs). Det fordøjede PCR-produkt blev transficeret ind i E. coli-stamme DH5. Den ønskede mutant blev bekræftet ved Sanger-sekvensanalyse.

cistanche planteforøgende immunsystem

2.13. Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev gentaget mindst tre gange med lignende resultater. Data er udtrykt som gennemsnitlig standardafvigelse (SD). Betydningen af ​​variabiliteten blev bestemt af den studerendes to-sidede uparrede t-test for to-gruppe eller en-vejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest eller to-vejs ANOVA med Sidaks multiple sammenligningstest for multiple gruppe sammenligninger ved hjælp af GraphPad Prism softwaren (version 8.0.1). En værdi på P < 0.{{10}}5 blev anset for at være statistisk signifikant, og P > 0.05 blev identificeret som statistisk ikke-signifikant. For alle dataene blev signifikansen præsenteret som *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001.

3. Resultater

3.1. ZIKV-infektion inducerer DHCR7-ekspression

Akkumulerende beviser har vist, at kolesterolmetabolisme påvirker værtens medfødte immunrespons mod flavivirusinfektion, såsom ZIKV og Dengue-virus (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 koder for et enzym, der omdanner 7-DHC til kolesterol, det sidste trin i biosyntesen af ​​kolesterol (Moebius et al., 1998). Vi opdagede først DHCR7-ekspression ved ZIKV-infektion. Human astrocyt U251 blev inficeret med ZIKV, som dosisafhængigt øgede DHCR7-ekspression ved både mRNA og protein (fig. 1A-C). For at bekræfte fænomenet undersøgte vi derefter DHCR7-ekspression i Vero-celler og fandt ud af, at ZIKV-infektion i det væsentlige inducerede DHCR7-ekspression (fig. 1D-F), hvilket var i overensstemmelse med resultaterne i U251-celler.

cistanche fordele-styrker immunsystemet

3.2. Målretning af DHCR7 fremkalder en kritisk anti-ZIKV-aktivitet

For at evaluere virkningerne af DHCR7 mod ZIKV-infektion blev U251- og A549-cellerne transficeret med HA-DHCR7-kodende plasmid og derefter inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1). Resultaterne viste, at DHCR7-overekspression signifikant forbedrede ZIKV-mRNA-ekspression (fig. 2A og B). Navnlig med akkumulering af DHCR7-protein blev ekspressionen af ​​ZIKV strukturelt protein E også øget (fig. 2C og D). Derudover udførte vi yderligere en plaque-assay under anvendelse af supernatanten fra fig. 2C og fandt ud af, at DHCR7-overekspression signifikant steg plaque-dannende enheder sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 2E og F). Missense-mutationen G410S af DHCR7 er blevet rapporteret at ophæve enzymaktivitet (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). For yderligere at bestemme virkningerne af DHCR7 på ZIKV-infektion konstruerede vi derefter en inaktiv mutant af DHCR7 (G410S). Sammenlignet med vildtypen af ​​DHCR7 kunne G410S-mutanten signifikant hæmme ZIKV-infektion (fig. 2G). Vi udførte også en konfokal mikroskopianalyse for at bekræfte observationen. Som vist i fig. 2H øgede overekspression af DHCR7 ZIKV-infektion. For at afgøre, om endogen DHCR7-enzymaktivitet er kritisk for ZIKV-infektion, designede vi to korte hårnåle-RNA'er (shDHCR7-1 og sh-DHCR7-2) specifikt målrettet mod DHCR7 og genereret DHCR7--dæmpet U251-celle linjer med shRNA-system (fig. 3A). Til sidst valgte vi en sh-DHCR7-1 for dens højere lyddæmpningseffektivitet. Sammenlignet med cellelinjetransduceret kontrol-shRNA viste disse DHCR7 knockdown-celler lavere modtagelighed for ZIKV-infektion (fig. 3B og C). Vi brugte derefter den selektive DHCR7-hæmmer AY9944, som forhindrer 7-DHC i at konvertere til kolesterol (Xu et al., 2011), som har vist sig at hæmme DHCR7-enzymaktivitet (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). Sammenlignet med kontrol hæmmede AY9944-administration dosisafhængigt ZIKV-infektion i U251-celler (fig. 3D-F). Plaque-assay blev også udført i Vero-celler for yderligere at vurdere virkningerne af DHCR7 og viser, at AY9944 signifikant kunne undertrykke ZIKV-infektion (fig. 3G og H). Konfokal mikroskopi viste især, at ZIKV E-protein var væsentligt reduceret i nærvær af AY9944 (fig. 3I). Disse resultater indikerede, at målretning mod DHCR7 kunne hæmme ZIKV-infektion.

Fig. 1. ZIKV-infektion inducerer DHCR7-ekspression. A–F U251- og Vero-celler blev inficeret med ZIKV (MOI ¼ 0, 1 og 2) i 24 timer, og de intracellulære RNA-niveauer af ZIKV (A, D) og DHCR7 (B, E) blev bestemt af RT-PCR med GAPDH som intern kontrol. De relative proteinniveauer af DHCR7- og ZIKV-kapper blev påvist ved Western blot (C, F). Data er fra mindst tre uafhængige eksperimenter (middel SD) eller repræsentative data (C, F). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, standardafvigelse.

3.3. DHCR7 hæmmer TBK1 og IRF3 aktivering for at reducere IFN- og ISGs produktion

Da DHCR7 er det vitale enzym til omdannelse af 7-DHC til kolesterol (Moebius et al., 1998), og ZIKV-infektion kunne øge DHCR7-ekspression, målte vi således kolesterolniveauet ved ZIKV-infektion. Vi afslørede, at ZIKV-infektion har ringe effekt på kolesterolsyntese i U251- og Vero-celler (fig. 4A og B), selvom DHCR7 var øget (fig. 1A-D). I betragtning af den forbedrede DHCR7 efter ZIKV-infektion og nøglerollerne for IFN'er i at konfrontere ZIKV-infektion, bestemte vi derefter effekten af ​​DHCR7 på IFN-I-signalvejen. Kontrol- og DHCR-7-dæmpende U251-celler blev inficeret med ZIKV eller transficeret med poly(I:C), og IFN-ekspression blev undersøgt. Sammenlignet med kontrolgruppen forbedrede ZIKV-infektion eller poly(I:C)-behandling markant IFN-ekspression i DHCR7--dæmpende U251-celler (fig. 4C og D). ISG'er er effektorerne af interferonhandlinger og spiller en stor rolle i det medfødte immunforsvar mod ZIKV-infektion. Vi viste også, at blokering af DHCR7 signifikant kunne forstærke ISG15- og ISG56-ekspression på både mRNA- og proteinniveauer (fig. 4E-J). Konsekvent kunne DHCR7-hæmmer AY9944-behandling inducere IFN-, ISG15 og ISG56-ekspression (fig. 4K, L). Det er vigtigt, at den inaktive mutant G410S delvist kunne vende de inhiberende virkninger af DHCR7 på IFN- og ISG-ekspression (fig. 4M, N). TBK1- og IRF3-aktivering er afgørende for IFNs-ISGs-induktion, så vi undersøgte derefter effekten af ​​DHCR7 på TBK1- og IRF3-ekspression og aktivering. Vi demonstrerede, at DHCR7 ikke kun dosisafhængigt hæmmede proteinniveauet, men også undertrykte niveauet af TBK1- og IRF3-phosphorylering (fig. 5A-C). Desuden vendte den inaktive mutant G410S ufuldstændigt de hæmmende virkninger af DHCR7 på IRF3- og TBK1-phosphorylering (fig. 5D). Uoverensstemmelse med resultaterne af DHCR7-overekspression kunne AY9944-behandling inducere IRF3- og TBK1-aktivering i U251-celle (fig. 5E).

3.4. ZIKV NS4B interagerer med DHCR7 for at hæmme TBK1- og IRF3-phosphorylering

Montering af beviser har afsløret, at ZIKV udviklede specifikke NS-proteiner for at lette effektiv replikation i værtsceller ved direkte at omgå værtens medfødte og adaptive immunitet via et væld af diskrete mekanismer. Vi udførte et co-IP-assay for at screene for det individuelle ZIKV NS-protein, der kunne interagere med DHCR7. HEK293T-celler blev co-transficeret med pCMV-DHCR7-HA og plasmid, der udtrykker individuelt NS-protein fusioneret med Flag-tag. Som vist i fig. 6A binder DHCR7 kun til NS4B, men interagerer ikke med andre NS-proteiner. Gensidige co-IP-assays blev yderligere udført og viste, at NS4B-protein interagerede med DHCR7 i HEK293T-celler (fig. 6B og C). For at bekræfte interaktionen mellem NS4B og DHCR7 udførte vi derefter et konfokalt mikroskop og fandt ud af, at NS4B-protein og DHCR7-protein blev kolokaliseret i cytoplasmaet (fig. 6D). GST pull-down assay viste yderligere interaktionen mellem NS4B og DHCR7 (fig. 6E). Desuden kunne forbigående transfektion af NS4B i U251-celler dramatisk inducere DHCR7-ekspression (fig. 6F). Det er vigtigt, at NS4B dosisafhængigt kunne blokere phosphorylering af både TBK1 og IRF3, hvilket var positivt korreleret med den øgede aktivering af TBK1 og IRF3 som svar på DHCR7 (fig. 6G og H). NS4B-overekspression i HEK293T-celler reducerede imidlertid proteinniveauet af TBK1 signifikant, men havde ringe effekt på IRF3-protein (fig. 6G og H). For yderligere at bekræfte disse observationer blev NS4B transficeret ind i DHCR7 knockdown U251-celler og viste inhiberende virkninger på endogene protein- og phosphoryleringsniveauer af TBK1 og IRF3 (fig. 6I). Tilsammen viste disse resultater, at ZIKV NS4B interagerede med DHCR7 og forbedrede DHCR7-ekspression for at blokere TBK1- og IRF3-aktivering og derefter lette ZIKV-infektion.

Fig. 2. Overekspression af DHCR7 fremmer ZIKV-replikation. A-D U251- og A549-celler blev transficeret med HA-vektor eller HA-DHCR7 ved de angivne koncentrationer i 12 timer og derefter inficeret med ZIKV i yderligere 36 timer. ZIKV RNA-niveauerne blev påvist ved RT-PCR med GAPDH som en intern kontrol (A, B), og proteinniveauerne af ZIKV-kappen, HA-DHCR7 og GAPDH blev påvist ved Western blot (C, D). E, F Vero-celler blev inficeret med ZIKV-holdig supernatant fra fig. 2C i 48 timer for at bestemme ZIKV-kopier ved plakassay. G U251-celler blev transficeret med HA-vektor, HA-DHCR7 eller HA-DHCR7 (G410S) i 12 timer og inficeret med ZIKV i 36 timer, og proteinniveauerne af ZIKV-kappe, HA-DHCR7 og GAPDH blev påvist ved Western blot. H U251-celler blev transficeret med HA-vektor eller HA-DHCR7 (1 ug) i 12 timer inficeret med ZIKV i 36 timer og efterfølgende inkuberet med muse-anti-flavivirus og kanin-anti-HA-antistoffer, efter farvet med FITC-konjugeret antimus og Cy3-konjugerede anti-kanin sekundære antistoffer. Kerner blev farvet med DAPI. Billederne blev visualiseret ved konfokal mikroskopi. Målestok ¼ 100 μm. Data er fra mindst tre uafhængige eksperimenter (middel SD) eller repræsentative data (C, D, E, G, H). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Students to-halede uparrede t-test (F) eller envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest (A, B). *P < 0,05, ***P < 0,001. SD, standardafvigelse.

4. Diskussion

Type I IFN'er og deres downstream ISG'er konfronterer en stor række af patogener og spiller en afgørende rolle i værtens immunforsvar mod ZIKV (Lazear et al., 2016). For at undgå den IFN-medierede overvågning og opnå tilstrækkelig replikation udvikler ZIKV NS-proteiner rettet mod forskellige punkter på IFN-signalvejen for at flygte fra det cellulære medfødte immunsystem (Lee et al., 2021). Monteringsundersøgelser har vist, at ZIKV NS1, NS3, NS4A og NS5 hæmmer forskellige moduler af RIG-I/IFN-I-vejen og letter virusinfektion ved at bruge uafhængige og forskellige mekanismer (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016 ; Ma et al., 2018; Riedl et al., 2019; Xia et al., 2018; Zheng et al., 2018). Imidlertid er den specifikke mekanisme for ZIKV NS4B, der modvirker immunrestriktion, dårligt defineret. ZIKV NS4B er et ekstremt hydrofobt protein bestående af 251 aminosyrer og er placeret i den endoplasmatiske retikulummembran med N-terminal (Zou et al., 2014). NS4B-hæmning af IFN-I-signalvejen er blevet identificeret i forskellige flavivira (Ding et al., 2013; Munoz-Jordan et al., 2003, 2005; Shan et al., 2021; Yi et al., 2016; Zhang et al. al., 2021). En nylig undersøgelse har rapporteret, at ZIKV INMI1-stammen, der er isoleret i Brasilien, bruger NS4B til at antagonisere nedstrøms for IFN-I-signalvejen ved at knuse STAT1-phosphorylering og følgelig afbryde STAT1-kernetransport (Fanunza et al., 2021). I denne undersøgelse fandt vi en særskilt mekanisme, hvor ZIKV NS4B afskaffede IFN-produktion ved at undertrykke TBK1 og IRF3 phosphorylering, opstrømskomponenten af ​​IFN-I signalvejen. Især er aminosyresubstitution (G18R) blevet opdaget i ZIKV NS4B, hvilket bidrog til den reducerede IFN-produktion og svækkede ISG-ekspression og som følge heraf lettede virusinfektion i mus, hvilket indikerer betydningen af ​​NS4B som en determinant for patogenese (Gorman et al. ., 2018). Nye beviser indikerede den kritiske betydning af kolesterolmetabolisme, der deltager i medfødt immunrespons (Akula et al., 2016; Dang et al., 2017; Reboldi et al., 2014; York et al., 2015). Selvom flere mellemprodukter i kolesterolmetabolisme er blevet dokumenteret at have brede antivirale virkninger (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013; Xiao et al., 2020), illustrerede vores undersøgelse en ny mekanisme at kolesterolmetabolisk enzym DHCR7 var involveret i ZIKV-infektion ved at dæmpe TBK1- og IRF3-aktivering for at lette virusinfektion. Som et nøgleenzym, der er involveret i desmosterol- og kolesterolmetabolisme, repræsenterer DHCR7 en overgang til omdannelse af 7-DHC til D-vitamin i hudceller udsat for UVB (Prabhu et al., 2016b). Desuden er DHCR7 ikke kun placeret ved indgangen til Bloch-vejen, men også i slutningen af ​​Kandutsch-Russell-vejen (Prabhu et al., 2016a, 2016b), som spiller en afgørende rolle i at kontrollere kolesterolsyntese. Krydstalen af ​​DHCR7 og dets interaktion med andre enzymer i flere veje kan styrke flere funktioner i forskellige celletyper eller organer. Tidligere undersøgelse har afsløret, at blokering af DHCR7 kunne mindske desmosterol, den umiddelbare forløber for kolesterolbiosyntese, og derved tilbyde tilstrækkelig beskyttelse mod HCV-infektion (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). Det er vigtigt, at Xiao et al. har vist, at VSV-infektion nedsætter DHCR7-ekspression, hvilket fører til reduceret kolesterol, men meget mere 7-DHC-akkumulering i makrofager og leveren (Xiao et al., 2020). Makrofager behandlet med 7-DHC gav en forbedret antiviral respons; mens tilsætning af kolesterol viste mindre beskyttelse. DHCR7-hæmmere og administration af 7-DHC kan være nyttige metoder til at bekæmpe virusinfektioner såsom HIN1, HSV og VSV. I denne undersøgelse fandt vi, at DHCR7-hæmmer AY9944 kunne undertrykke ZIKV-infektion. Vores undersøgelse afslørede imidlertid, at ZIKV-infektion inducerede DHCR7-ekspression, men havde ringe effekt på kolesterolbiosyntese i gliaceller. Vi undersøgte ikke niveauet af 7-DHC-ekspression efter ZIKV-infektion, ikke desto mindre er det værd at undersøge nærmere, om 7-DHC og AY9944 har en synergisk terapeutisk effekt til at behandle patienter, der er blevet inficeret med ZIKV infektion i hjernen. DHCR7-overekspression fremmede ZIKV-infektion, mens behandlingen med DHCR7-selektiv inhibitor (AY9944) kraftigt øgede IFN-produktion mod ZIKV-infektion. TBK1- og IRF3-aktivering er afgørende for priming af IFN-I-signalering. Tidligere undersøgelse viste, at DHCR7-dæmpning eller 7-DHC-behandling aktiverede PI3K-AKT3-vejen til phosphorylering af IRF3, men ikke TBK1 i makrofager (Xiao et al., 2020). Ikke desto mindre viste vores resultater, at DHCR7 dosisafhængigt reducerede både IRF3- og TBK1-ekspression samt IRF3- og TBK1-phosphorylering. Disse undersøgelser antydede, at DHCR7 kunne bidrage til ZIKV-infektion i en kolesterolmetabolisme-uafhængig mekanisme i hjernen. Det er blevet godt belyst, at ZIKV brugte NS-proteiner til direkte at interagere med forskellige komponenter af RIG-I/IFN-I-vejen for at undgå immunrespons og lette viral replikation. Vi har tidligere rapporteret interaktionen af ​​ZIKV NS5 med RIG-I for at svække IFN-produktion (Li et al., 2020). Andre viste, at ZIKV NS1 og NS2B var målrettet mod TBK1, NS3 målrettet mod RIG-I og MDA5 for at reducere IFN-I og ISGs produktion (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). Funktionen af ​​ZIKV NS-proteiner rettet mod kolesterolmetabolisme forbliver dog stort set uhåndgribelig. I denne undersøgelse har vi også illustreret en urapporteret interaktion mellem det kolesterolmetaboliske enzym DHCR7 og ZIKV NS-proteiner. Vi viste DHCR7 specifikt bundet til NS4B, ikke til andre NS-proteiner. Vi leverede det kritiske bevis for, at ZIKV NS4B interagerede med DHCR7 og i det væsentlige inducerede dets ekspression, hvilket var i overensstemmelse med resultaterne i U251-celler efter ZIKV-infektion. Vigtigt, bortset fra direkte at demonstrere engagementet af DHCR7 og ZIKV NS4B, fandt vi også, at ZIKV NS4B øgede DHCR7-ekspression for at hæmme TBK1- og IRF3-phosphorylering og lette ZIKV-infektion. I overensstemmelse med vores resultater afslørede en nylig undersøgelse, at DHCR7-mangel kunne aktivere IRF3 og IFN-signalering for at hæmme VSV og andre vira i makrofager.

Fig. 3. Knockdown af DHCR7 reducerer ZIKV-infektion i U251-celler. U251-celler blev transduceret med de lentivirale partikler indeholdende shRNA mod DHCR7 (shDHCR7-1 og sh-DHCR7-2) eller en ikke-målsekvens (sh-NTC), efterfulgt af puromycin-selektion i 14 dage. Knockdown-effektiviteten blev bestemt ved RT-PCR. B, C DHCR7-silencing U251 (sh-DHCR7) og sh-NTC U251-celler blev falske inficerede eller ZIKV-inficerede (MOI ¼ 1) i 36 timer. Det intracellulære ZIKV RNA-niveau blev påvist ved RT-PCR med GAPDH som en intern kontrol (B), og proteinniveauerne af ZIKV-kappen, DHCR7 og GAPDH blev påvist ved Western blot (C). D, E U251-celler blev behandlet med DHCR7-hæmmer AY9944 ved den angivne koncentration i 2 timer, derefter infektion med ZIKV (MOI ¼ 1) i 48 timer. Cellerne blev udsat for RT-PCR for at detektere ZIKV RNA (D). Proteinniveauerne af ZIKV-kappen, DHCR7 og GAPDH blev påvist ved Western blot (E). F U251-celler blev behandlet med DHCR7-hæmmer AY9944 ved den angivne koncentration i 36 timer, og DHCR7 og GAPDH blev påvist ved Western blot. G, H Vero-celler blev inficeret med ZIKV-holdig supernatant fra fig. 3E i 48 timer for at bestemme ZIKV-kopier ved plakassay. I U251-celler blev behandlet med AY9944 ved den angivne koncentration i 2 timer, derefter infektion med ZIKV ved MOI ¼ 1 i 36 timer. Billederne blev visualiseret ved konfokal mikroskopi. Målestok ¼ 100 μm. Data er fra mindst tre uafhængige eksperimenter (middel SD) eller repræsentative data (C, E, F, G og I). Statistisk signifikans beregnes ved hjælp af envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest (A, D, H) eller tovejs ANOVA med Sidaks multiple sammenligningstest (B). ***P < 0,001. SD, standardafvigelse.

Fig. 4. DHCR7 hæmmer IFN- og ISG-produktion. A-, B U251- og Vero-celler blev inficeret med ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 og 1) i 24 timer, og cellulært kolesterol blev målt med vævs-totalkolesterol-assaykit. C–H DHCR7-dæmpende U251 (sh-DHCR7) og sh-NTC U251 celler blev inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) eller behandlet med Poly(I:C) (1 ug/ml) i 6 timer. Totalt cellulært RNA blev ekstraheret og underkastet RT-PCR for mRNA-ekspressionen med GAPDH som en intern kontrol. De relative udtryk for IFN- og ISG'er blev normaliseret til det for sh-NTC-prøver i den falske gruppe, og foldændringer blev vist urimelige. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) og ISG56 (G, H). I, J DHCR7-silencing U251 (sh-DHCR7) og sh-NTC U251 celler blev inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) eller transficeret med Poly(I:C) (1 ug/ml) i 24 timer, og proteinniveauerne af ISG15, ISG56 og GAPDH blev påvist ved Western blot. K U251-celler blev behandlet med den angivne dosis AY9944 i 2 timer, derefter inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) i 6 timer. IFN-RNA-niveauet blev påvist ved RT-PCR med GAPDH som en intern kontrol. L U251-celler blev behandlet med den angivne dosis AY9944 i 2 timer og derefter inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) i 24 timer. Proteinniveauerne af ISG15, ISG56 og GAPDH blev påvist ved Western blot. M U251-celler blev transficeret med HA-vektor, HA-DHCR7 eller HA-DHCR7 (G410S) i 24 timer og inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) i 6 timer. IFN-RNA-niveauerne blev påvist ved RT-PCR med GAPDH som en intern kontrol. N U251-celler blev transficeret med HA-vektor, HA-DHCR7 eller HA-DHCR7 (G410S) i 24 timer og derefter inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) i 24 timer. Proteinniveauerne af ISG15, ISG56 og GAPDH blev påvist ved Western blot. Data er fra mindst tre uafhængige eksperimenter (middel SD) eller repræsentative data (I, J, L, N). Statistisk signifikans beregnes ved hjælp af envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest (A, B, K, M) eller tovejs ANOVA med Sidaks multiple sammenligningstest (C–H). ns, P > 0,05, ***P < 0,001. SD, standardafvigelse.

Fig. 5. DHCR7 hæmmer TBK1- og IRF3-aktivering. A, B HEK293T-celler blev co-transficeret med TBK1-kodende plasmid sammen med DHCR7-udtrykkende plasmid eller tom vektor (A). HEK293T-celler blev co-transficeret med IRF3-kodende plasmid, RIG-I-kodende plasmid sammen med DHCR7-udtrykkende plasmid eller tom vektor (B). Celler blev høstet 24 timer efter transfektion og udsat for Western blot med indikerede antistoffer [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-PIRF3(S396), anti-HA og anti-GAPDH ]. C U251-celler blev transficeret med den angivne dosis af DHCR7-udtrykkende plasmid eller tom vektor i 24 timer. Celler blev derefter inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) høstet 6 timer efter infektion og udsat for Western blot med indikerede antistoffer [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3( S396), anti-HA og anti-GAPDH]. D U251-celler blev transficeret med HA-vektor, HA-DHCR7 eller HA-DHCR7 (G410S) i 24 timer. Celler blev derefter inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) høstet 6 timer efter infektion og udsat for Western blot med indikerede antistoffer [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-PIRF3(S396) anti-HA og anti-GAPDH]. E U251-celler blev behandlet med den angivne dosis AY9944 i 2 timer og inficeret med ZIKV (MOI ¼ 1) i 6 timer, derefter underkastet Western blot med indikerede antistoffer [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti -IRF3, anti-P-IRF3(S396) og anti-GAPDH]. Data er fra mindst tre uafhængige eksperimenter og vist som repræsentative data (A–E).

Fig. 6. ZIKV NS4B interagerer med DHCR7 for at hæmme TBK1- og IRF3-phosphorylering. A HEK293T-celler blev co-transficeret med plasmider, der koder for HA-DHCR7, og plasmider, der koder for ZIKV ikke-strukturelle proteiner (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B og FLAG-NS5) eller tomt kontrolplasmid for 3 0 t. Cellelysaterne blev immunpræcipiteret med anti-Flag-antistoffer og derefter analyseret ved immunoblotting med angivne antistoffer. B, C HEK293T-celler blev co-transficeret med plasmider, der koder for HA-DHCR7, plasmider, der koder for FLAG-NS4B, eller tomt kontrolplasmid i 30 timer. Cellelysaterne blev immunpræcipiteret med anti-HA-antistof (B) eller anti-FLAG-antistof (C) og derefter analyseret ved immunoblotting med angivne antistoffer. D U251-celler blev transficeret med FLAG-NS4B-plasmid sammen med plasmider, der koder for HA-DHCR7. Lokaliseringen af ​​FLAG-NS4B (grøn), HA-DHCR7 (rød), kernemarkør DAPI (blå) og fusion blev analyseret med konfokal mikroskopi. Målestok ¼ 10 μm. E Cellelysater fra HEK293T-celler transficeret med HA-DHCR7 blev inkuberet med GST-protein eller GST-NS4B-protein, som blev inkuberet med glutathion-Sepharose-perler. Blandinger blev påvist ved Western blot med anti-HA- og anti-GST-antistoffer (øverst). Lysater fra transficerede HEK293T-celler og de oprensede proteiner blev påvist ved Western blot med anti-HA- og anti-GST-antistoffer (nederst). F U251-celler blev transficeret med plasmid kodende for FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). De relative proteinniveauer af DHCR7, FLAG-NS4B og GAPDH blev påvist ved Western blot. G, H HEK293T-celler blev co-transficeret med NS4B-udtrykkende plasmid eller tom vektor sammen med TBK 1--kodende plasmid (F), IRF3--udtrykkende plasmid og plasmider, der koder for RIG-I (G) . Celler blev høstet 24 timer efter transfektion og udsat for Western blot med indikerede antistoffer [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3(S396), anti-FLAG og antiGAPDH ]. I DHCR7-silencing U251 (sh-DHCR7) og sh-NTC U251 celler blev transficeret med NS4B-udtrykkende plasmid eller tom vektor. Celler blev høstet 6 timer efter transfektion og udsat for Western blot med angivne antistoffer [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3(S396), anti-FLAG og antiGAPDH ]. Data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter.

5. Konklusioner

Sammenfattende afslørede en tidligere undersøgelse, at kolesterolmetabolismeenzymet DHCR7 er involveret i medfødt immunrespons mod forskellige virusinfektioner. Vores undersøgelse har præsenteret, at ZIKV NS4B interagerede med DHCR7 og inducerede DHCR7-ekspression. Den øgede DHCR7 hæmmer kraftigt TBK1- og IRF3-aktivering og resulterer i reduceret IFN- og ISG-produktion, hvilket dermed letter ZIKV-infektion i gliaceller. Disse resultater har afsløret en ny viral immunundslippende mekanisme, som ZIKV overvinder immunrespons ved direkte at målrette DHCR7 med NS4B.

Referencer

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. Kontrol af det medfødte immunrespons ved mevalonatvejen. Nat. Immunol. 17, 922-929.

Berthoud, L., 2020. Begrænsningen af ​​flavivirus. Virol. Synd. 35, 363-377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. Transkriptionsfaktoren STAT-1 kobler makrofagsyntese af 25-hydroxycholesterol til det antivirale interferonrespons. Immunity 38, 106-118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier. , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Guillain-Barre Syndrome udbrud forbundet med Zika virus infektion i Fransk Polynesien: et tilfælde -kontrolundersøgelse. Lancet 387, 1531-1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I genkender 5' region af dengue- og Zika-virusgenomer. Cell Rep. 24, 320-328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Metabolisk omprogrammering af Zika-virussen fremkalder betændelse i den menneskelige moderkage. Nat. Commun. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Oxysterol-begrænsning af kolesterolsyntese forhindrer AIM2-inflammasomaktivering. Celle 171, 1057-1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Hepatitis C-virus NS4B blokerer interaktionen mellem STING og TBK1 for at undgå værtens medfødte immunitet. J. Hepatol. 59, 52-58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 INMI1 Zika-virus NS4B antagoniserer interferonsignaleringen ved at undertrykke STAT1-phosphorylering. Virus 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε og TBK1 er væsentlige komponenter i IRF3-signaleringen vej. Nat. Immunol. 4, 491-496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutations i Δ{{ 3}}sterolreduktasegen hos patienter med Smith-Lemli-Opitz syndrom. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8181-8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3rd, KH, Ruckert, C. ., Young, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. En immunkompetent musemodel af Zika-virusinfektion. Cell Host Microbe 23, 672–685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. Zika-virus retter sig mod human STAT2 for at hæmme type I interferon-signalering. Cell Host Microbe 19, 882-890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. Infektion med et brasiliansk isolat af Zika-virus genererer RIG-I-stimulerende RNA, og det virale NS5-protein blokerer type I IFN-induktion og signalering. Eur. J. Immunol. 48, 1120-1136.

Horlick, L., 1966. Virkning af en ny inhibitor af kolesterolbiosyntese (AY 9944) på ​​serum- og vævssteroler hos rotter. J. Lipid Res. 7, 116-121.

Ikonen, E., 2008. Cellulær kolesterolhandel og kompartmentalisering. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 125-138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Differentielle roller for MDA5 og RIG-I helikaser til genkendelse af RNA-vira. Natur 441, 101-105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. DHCR7-mutationer forbundet med højere D-vitaminstatus tillod tidlig menneskelig migration til nordlige breddegrader. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. Zika-virus hæmmer type-I-interferonproduktion og nedstrøms signalering. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. En musemodel af Zika-viruspatogenese. Cell Host Microbe 19, 720–730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Skjul og søg: samspillet mellem Zika-virus og værtens immunrespons. Foran. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Et globalt lipidkort definerer et netværk, der er vigtigt for Zika-virusreplikation. Nat. Commun. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. NS5-konservativt sted er påkrævet for at Zika-virussen kan begrænse RIG-I-signaleringen. Foran. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu. , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Hydroxycholesterol beskytter værten mod Zika-virusinfektion og dens associerede mikrocefali i en musemodel. Immunity 46, 446-456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. En kolesterolbiosyntesehæmmer blokerer Staphylococcus aureus virulens . Science 319, 1391-1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Interferon-inducerbar kolesterol-25-hydroxylase inhiberer bredt viral indtrængen ved produktion af 25- 25-hydroxycholesterol. Immunitet 38, 92-105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. Mekanismer og regulering af kolesterol-homeostase. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 225-245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. De terminale enzymer af kolesterolsyntese, DHCR24 og DHCR7, interagerer fysisk og funktionelt. J. Lipid Res. 56, 888-897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. Zika-virus ikke-strukturelt protein 4A blokerer RLR-MAVS-signaleringen. Foran. Microbiol. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Molekylær kloning og ekspression af den humane delta7-sterolreduktase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1899-1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Hæmning af alfa/beta-interferon-signalering af NS4B-proteinet fra flavivira. J. Virol. 79, 8004-8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Hæmning af interferon-signalering af dengue-virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 14333-14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Male, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Den vigtigste cellulære sterolregulerende vej er nødvendig for Andes-virusinfektion. PLoS Pathog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. Den fortsatte trussel om nye flavivirus. Nat. Microbiol. 5, 796-812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: et vigtigt enzymskifte mellem kolesterol- og D-vitaminproduktion. Prog. Lipid Res. 64, 138-151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. Kolesterol-medieret nedbrydning af 7-dehydrocholesterol reduktase skifter balancen fra kolesterol til vitamin D-syntese. J. Biol. Chem. 291, 8363-8373. Randall, G., 2018. Lipiddråbemetabolisme under dengue-virusinfektion. Trends Microbiol. 26, 640-642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Zika-virus og fødselsdefekter – gennemgang af beviserne for kausalitet. N. Engl. J. Med. 374, 1981-1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Inflammation. 25-Hydroxycholesterol undertrykker interleukin-1-drevet inflammation nedstrøms for type I-interferon. Science 345, 679-684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zika-virus NS3 efterligner en cellulær { {2}}bindingsmotiv for at antagonisere RIG-I- og MDA5-medieret medfødt immunitet. Cell Host Microbe 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. Lipidmetabolitprofilering identificerer desmosterolmetabolisme som et nyt antiviralt mål for hepatitis C-virus. J. Am. Chem. Soc. 134, 6896-6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITM'erne hæmmer Zika-virusreplikation. Cell Rep. 15, 2323-2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Interferon-stimulerede gener: et komplekst net af værtsforsvar. Annu. Rev. Immunol. 32, 513-545.