ali.ma@wecistanche.com

Etablering af den samtidige eksperimentelle model for osteoporose kombineret med Alzheimers sygdom hos rotter og de dobbelte virkninger af echinacosid og acteosid fra Cistanche tubulosa

Yi Chena, et al

ABSTRAKT

Etnofarmakologisk relevans: Cistanche tubulosaer en dyrebar traditionel kinesisk medicin, der er blevet brugt i vid udstrækning til behandling af osteoporose ogAlzheimers sygdom. Echinacosid og acteosid er de vigtigste aktive bestanddele iCistanche tubulosader har farmakologiske aktiviteter med forskningsmæssig værdi. Det er blevet rapporteret, at echinacosid og acteosid kunne forbedre indlærings- og hukommelsesevnen, fremme spredningen og differentieringen af ​​osteoblast.

Formålet med undersøgelsen: Echinacoside og acteosid fraCistanche tubulosahar vist betydelige aktiviteter af anti-osteoporose og anti-Alzheimers sygdom, mens disse effekter ikke er blevet undersøgt samtidigt i en rottemodel. Formålet med denne undersøgelse var at etablere og verificere modellen for osteoporose kombineret medAlzheimers sygdominrats og for at undersøge de dobbelte virkninger af echinacosid og acteosid på denne samtidige model.

Materialer og metoder:Tre modelgrupper af ovariektomi (OVX), falsk kirurgi med D-galactose og AlCl3 (D), ovariektomi med D-galactose og AlCl3 (OVX plus D) blev indstillet på samme tid. Rotterne i lægemiddelbehandlingsgrupper blev ovariektomieret. Mens de udførte den intraperitoneale injektion af D-galactose og intragastrisk administration af AlCl3 i rotterne fra lægemiddelbehandlingsgrupper, fik rotterne oralt echinacosid (90 mg/kg/d), acteosid (90 mg) /kg/d), og de positive kontrollægemidler af henholdsvis østradiolvalerat (0,6 mg/kg/d), donepezil HCI (0,8 mg/kg/d). Efter lægemiddelbehandlingen på 8 uger blev Morris Water Maze (MWM) test i 6 dage først udført. Rotterne blev derefter ofret for at høste blod, livmoder, lårben, skinneben og hjernevæv. Serumet blev brugt til biokemiske tests. Livmoderen blev brugt til histomorfometri. Den højre lårben blev brugt til henholdsvis Micro-CT og histomorfometri. De rigtige skinneben blev brugt til den biomekaniske test. Hippocampus indsamlet på isboksen blev brugt til biokemiske tests. Hjernen opsamlet ved perfusion blev brugt til histomorfometri.

Resultater:Sammenlignet med Sham-gruppen kunne OVX plus D-gruppen signifikant reducere indlærings- og hukommelsesevnen ved at forårsage oxidativ skade, svække neuroner i hippocampus og påvirke hydrolysen og syntesen af ​​acetylcholin. I mellemtiden steg aktiviteterne for BALP og TRAP i OVX plus D-gruppen signifikant (P < {{0}}.001)="" sammenlignet="" med="" sham-gruppen.="" derudover,="" sammenlignet="" med="" sham-gruppen,="" faldt="" den="" gennemsnitlige="" knoglemineraltæthed="" åbenlyst="" (p="">< 0,05),="" den="" trabekulære="" knoglemasse="" og="" mikroarkitekturen="" blev="" også="" ødelagt="" signifikant="" i="" ovx="" plus="" d-gruppen.="" ydermere="" reduceredes="" den="" maksimale="" belastning="" og="" den="" maksimale="" belastning="" signifikant="" (p="">< 0,01),="" og="" energiabsorptionen="" faldt="" også="" meget="" sammenlignet="" med="" sham-gruppen.="" efter="" at="" være="" blevet="" administreret="" med="" echinacosid="" og="" acteosid,="" er="" de="" typiske="" patologiske="" træk="" ved="" osteoporose="">Alzheimers sygdomblev forbedret.

Konklusioner: Modellen af ​​osteoporose kombineret medAlzheimers sygdomi rotter var gennemførligt og succesfuldt etableret. Echinacosid og acteosid viste også nogle signifikante effekter på denne sideløbende model, og de kunne være potentielle kandidater fraCistanche tubulosamed dobbelte effekter til videre undersøgelse.

Nøgleord: Osteoporose,Alzheimers sygdom, Dobbelteffekter,Echinacoside, Acteosid, Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosatilAlzheimers sygdom

Klik til Cistanche UK

1. Introduktion

Osteoporose er en degenerativ knoglesygdom karakteriseret ved et progressivt tab af knoglemasse og ødelæggelse af mikroarkitektur, hvilket kan øge risikoen for skrøbelighedsfrakturer (Rachner et al., 2011).Alzheimers sygdom(AD) er en almindelig neurodegenerativ sygdom hos ældre, der er karakteriseret ved vedvarende mental tilbagegang, kognitiv svækkelse og tab af uafhængig livsevne i kliniske studier (Reitz et al., 2011). Dannelsen af ​​senil plak-induceret af -amyloidaflejring, neurofibrillære sammenfiltringer forårsaget af tau-hyperphosphorylering og neuronal degeneration i hjernen er de typiske patologiske træk ved AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Overfladisk set er OP og AD fuldstændig uafhængige sygdomme med forskellige patologier og kliniske træk. Imidlertid observeres OP og AD ofte at forekomme sammen i klinisk praksis (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Forekomsten af ​​begge sygdomme steg med alderen, især hos postmenopausale kvinder (Li et al., 2017; Stern, 2012). Flere og flere beviser tydede på, at personer med diagnosen AD har en øget risiko for OP (Zhou et al., 2014).

Det er nødvendigt at studere og afklare sammenhængen mellem osteoporose ogAlzheimers sygdomin vitro og in vivo. Før undersøgelserne udføres invivo, er det vigtigt at vælge de relevante dyremodeller for osteoporose ellerAlzheimers sygdom. Osteoporosemodellen kunne etableres ved hjælp af flere slags metoder, såsom intragastrisk administration af retinsyre, ovariektomikirurgi og intramuskulær injektion af glukokortikoider (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Især den postmenopausale osteoporose-model, der var induceret af ovariektomi hos rotter, var klassisk og har været meget brugt i de fleste undersøgelser (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017). Sporadisk Alzheimers sygdom er hovedtypen af ​​Alzheimers sygdom. Dyremodellerne af sporadiskAlzheimers sygdom kunneinduceres ved forskellige metoder såsom injektion af D-galactose eller -amyloid, intragastrisk administration af AlCl3 og så videre (Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Derudover er konjunktionsmodellen afAlzheimers sygdominduceret af langvarig intraperitoneal injektion af D-galactose kombineret med ovariektomi er også blevet undersøgt meget (Liu et al., 2010; Zhao et al., 2012). For at afsløre relevansen af ​​osteoporose ogAlzheimers sygdom, er det nødvendigt at etablere modellen for osteoporose kombineret medAlzheimers sygdomat studere de almindelige mekanismer af medicin mod osteoporose ogAlzheimers sygdom.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight er en parasitisk plante, som hovedsageligt er udbredt i ørkenerne i det nordvestlige Kina. De tørrede saftige stængler afCistanche tubulosa(CT) bruges som en berømt tonisk medicin kaldet Cistanches Herba med dets kinesiske navn Roucongrong i den kinesiske farmakopé (2015). Det er blevet hædret som 'ørkenens ginseng' og er meget brugt til behandling af talje- og knæsmerter, kvindelig sterilitet og forstoppelse i traditionel kinesisk medicin (Jiang og Tu, 2009). De vigtigste aktive bestanddele af CT(Cistanche tubulosa)er phenylethanoidglycosider (PhG'er), echinacosid (ECH) og acteosid (ACT) er de repræsentative forbindelser i PhG'er (Morikawaet al., 2014). Især ECH og ACT vælges typisk som markører for kvalitetskontrol i CT(Cistanche tubulosa)på grund af deres høje indhold og forskellige farmakologiske aktiviteter såsom virkningerne af neurobeskyttelse, knoglebeskyttelse, antioxidanter, anti-aldring og forbedring af indlærings- og hukommelsesevne (Wang et al., 2012; Li et al., 2016). Men virkningerne af ECH og ACT på osteoporose kombineret medAlzheimers sygdomendnu ikke var blevet undersøgt sammen i en rottemodel. Formålet med denne undersøgelse var således at etablere en rottemodel for osteoporose kombineret medAlzheimers sygdomog udforske virkningerne af echinacosid og acteosid på denne sideløbende model for at give eksperimentelt bevis for yderligere undersøgelse af den molekylære mekanisme af echinacosid eller acteosid i følgende forskning.

Cistanche tubulosatilAlzheimers sygdom

2 Materialer og metoder

2.1. Dyr

Firs 8-ugers gamle Wistar-hunrotter (certifikatnummer: SCXK,2018-0006), der vejede 180-200 g, blev erhvervet fra Sino-BritishSIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Shanghai, Kina) og opvokset i Experimental Center of Pharmaceutical Animals i China Pharmaceutical University.

2.2. Kemikalier og reagens

Klorhydrat, penicillin G-natrium, D-galactose, aluminiumchloridhexahydrat, østradiolvalerat, donepezil-HCl blev købt fra Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Kina). Echinacoside (HPLC94 procent) blev opnået fra Wuhan Yuanchengcreate Technology Co., Ltd. (Wuhan, Kina). Acteosid (HPLC 98 procent) blev købt fra Baoji HerbestBio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kina). Knoglespecifik alkalisk phosphatase (BALP), tartrat-resistent sur phosphatase (TRAP), superoxiddismutase (SOD), malonaldehyd (MDA), acetylcholinesterase (AChE) og cholinacetyltransferase (ChAT) enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) blev købt fra Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Universelt vævsfiksativ blev opnået fra WuhanServicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Kina).

2.3. Dyremodeller og behandlinger

Alle dyreforsøg blev godkendt og overvåget af den dyreetiske komité ved China Pharmaceutical University. Rotterne blev holdt med en 12 timers lys/mørke cyklus i et temperaturkontrolleret rum (22 ± 2 grader) og fodret med standard pelleteret foder og postevand.

Efter en uges tilpasning blev osteoporosemodellen opnået ved at udføre ovariektomikirurgi (French et al., 2008). Efter operationen var afsluttet, blev penicillin G natrium drysset på sårsuturen en gang for at forhindre infektion. Rotterne blev derefter fodret normalt i tre uger. Ifølge referencen (Hua et al., 2007;Alawdi et al., 2017) er modellen afAlzheimers sygdomkunne induceres ved langvarig intraperitoneal injektion af D-galactose kombineret med ovariektomi eller langvarig intragastrisk administration af AlCl3. At studere gennemførligheden af ​​modellen for osteoporose kombineret medAlzheimers sygdom, tre modelgrupper af ovariektomi (OVX-gruppe), falsk operation med intraperitoneal injektion af 150 mg/kg/d D-galactose og intragastrisk administration af 30 mg/kg/d AlCl3 (D-gruppe), ovariektomi med en intraperitoneal injektion på 150 mg/kg /d D-galactose og intragastrisk administration af 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX plus D-gruppe) blev fastsat i denne undersøgelse.

Derfor blev rotter tilfældigt opdelt i otte grupper (n {{0}} for hver gruppe) efter 3 uger og oralt behandlet med medicin i 8 uger: Sham gruppe; OVX gruppe; D gruppe; OVX plus D gruppe; østradiolvalerat-behandlingsgruppe (EV-gruppe, OVX plus D plus 0,6 mg/kg/d østradiolvalerat); donepezil HCI-behandlingsgruppe (DPZ-gruppe, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/d donepezil HCI); echinacosid-behandlingsgruppe (ECH-gruppe, OVX plus D plus 90 mg/kg/d echinacosid); acteosid-behandlingsgruppe (ACT-gruppe, OVX plus D plus 90 mg/kg/d acteosid). Ifølge Human-Rat Equivalent Dose Conversion Principle og dosis fra relateret reference (Li et al., 2013; Gao et al., 2014) blev doseringerne af lægemiddelbehandlingsgrupper i denne undersøgelse vedtaget.

Kropsvægten af ​​hver rotte blev målt hver uge. Efter hele behandlingen med lægemidler, der varede i 8 uger, blev Morris Water Maze (MWM) test i 6 dage først udført. Derefter blev 6 rotter fra hver gruppe aflivet for at høste materialerne. Rotterne blev bedøvet med intraperitoneal injektion af 3,0 ml/kg 10 procent chloralhydrat, og blod blev opsamlet fra aorta abdominalis. Blodet blev anbragt ved stuetemperatur for at størkne og centrifugeret ved 3500 r/min i 10 min. Serumet blev høstet i et 1,5 ml centrifugerør (NEST Biotechnology) og opbevaret ved -80 grader, indtil det blev brugt til biokemiske tests. Livmoderen, lårbenet, skinnebenet og hjernevævet blev derefter opsamlet. Livmoderen bruges til histomorfometri. Den højre lårben blev brugt til henholdsvis mikro-CT og histomorfometri. De højre skinneben blev brugt til den biomekaniske test. Hippocampus indsamlet på isboksen blev brugt til biokemiske tests. Derefter blev de andre tre rotter fra hver gruppe perfunderet fra hjertet med saltvand og universelt vævsfikseringsmiddel for at høste hjernen til histomorfometri.

Cistanche tubulosatilAlzheimers sygdom

2.4. Morris Water Maze (MWM) test

Rotter blev udsat for rumlig referenceindlæring og hukommelsestest i MWM-testen efter 8 ugers intervention. MWM-testen blev udført efter de tidligere rapporterede metoder (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Kort fortalt, 5 på hinanden følgende dage med fire forsøg om dagen, blev rotter trænet til at bruge en række forskellige visuelle signaler placeret på bassinvæggen for at finde en skjult neddykket platform (diameter 11 cm, højde 29 cm) i en cirkulær pool (diameter 130 cm, højde 50 cm ) fyldt med ikke-giftigt kulstoffarvet vand. Puljen var imaginært opdelt i fire kvadranter, og fire startpositioner var placeret i skæringspunkterne mellem kvadranter. Platformen var placeret i midten af ​​en af ​​kvadranterne, og positionen var konstant under forsøgene. I hvert forsøg blev rotter anbragt tilfældigt på udvalgte steder, vendt mod bassinets væg. Hvert forsøg blev afsluttet, når rotten nåede platformen eller efter 60 s, og den forløbne tid blev registreret som escapelatens. Rotter, der ikke nåede platformen, blev ført op på den. Efter hvert forsøg med skjult platform forblev rotten på platformen i 10 s. Den gennemsnitlige latenstid på fire forsøg pr. dag blev beregnet som træningsresultaterne. På dag 6 blev alle rotter udsat for et sondeforsøg, hvor de svømmede i 60 s i poolen uden platform. Overfartstiderne ved platformens placering og rejsetiden i målkvadranten blev registreret som de endelige resultater. Rotter blev overvåget af et kamera monteret i loftet direkte over poolen, og alle forsøg blev registreret og analyseret ved hjælp af MORRIS MAZE-programmet leveret af Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Beijing, Kina).

2.5. Biokemisk test ved ELISA

I henhold til producentens instruktioner for ELISA-kits blev den knoglespecifikke alkaliske fosfatase (BALP) aktivitet, tartrat-resistent acidphosphatase (TRAP) aktivitet, superoxid dismutase (SOD) aktivitet og malondialdehyd (MDA) indhold i serum testet af BioTekSynergy 2 multi- tilstand mikropladelæser (BioTek, USA). Hippocampus-vævene fra hver gruppe blev vasket med PBS (0,01 M, pH7,4) for at fjerne blodet eller urenhederne, der var tilbage på vævsoverfladen. Hippocampus-vævene på den ene side blev vejet og derefter skåret i små stykker som muligt. Hippocampus-vævene blev homogeniseret i henhold til forholdet 1:9 (vævsvægt: PBS-volumen). Homogenatet blev centrifugeret ved 4 grader, 3000 r/min i 15 min. Supernatanten blev opsamlet og fortyndet for at måle proteinkoncentrationen ved BCA-metoden. Acetylcholinesterase (AChE) aktivitet, cholin acetyltransferase (ChAT) aktivitet, superoxid dismutase (SOD) aktivitet og malondialdehyd (MDA) indhold i hippocampus væv blev derefter testet ved ELISA metoder.

Cistanche tubulosatilAlzheimers sygdom

2.6. Hippocampus histomorfometri

Hjernevævene (n=3/gruppe) blev fikseret i universelt vævsfikseringsmiddel. Hjernevævsprøverne blev derefter vasket, dehydreret med gradientethanol, indlejret med paraffinvoks og skåret i koronale sektioner på 5 μm. Sektionerne blev farvet med hæmatoxylin og eosin (HE). Derefter blev de koronale sektioner af hjernevævet fotograferet med et omvendt fluorescensmikroskop (Nikon, Japan). De morfologiske ændringer af CA1, CA2, CA3 og DG i hippocampus blev især observeret.

2.7. Uterin histomorfometri og morfometri

Den valgte livmoder (n {{0}}/gruppe) blev fikseret i universel vævsfiksering. Livmodervævsprøverne blev derefter vasket, dehydreret med gradientethanol, indlejret med paraffinvoks og skåret i tværgående sektioner på 5 μm. Sektionerne blev farvet med hæmatoxylin andeosin (HE). De tværgående sektioner af livmoderen blev observeret og fotograferet. Fem synsfelter blev tilfældigt udvalgt, diameteren af ​​den uterus tværgående sektion og uterus slimhindeepiteltykkelse blev derefter målt ved hjælp af Image-Pro Plus 6.0 software. Antallet af livmoderkirtler i lamina propria blev også talt.

2.8. Mikro-CT(Cistanche tubulosa)

Det valgte højre lårben (n=3/gruppe) blev scannet i en position med en afstand fra objektet til kilden på 121 mm og afstanden fra kameraet til kilden på 171 mm ved hjælp af en SkyScan 1176 mikrorøntgen computertomografi (Micro-CT) scanner (Bruker, Tyskland). Distalvækstpladen blev valgt som referenceoverfladen. Med en afstand på 1 mm under referenceoverfladen blev et 1,8 mm tykt område valgt som volumen af ​​interesse (VOI, 100 lag). De resulterende gråtonebilleder havde en pixelstørrelse på 17,76 μm fra knoglerekonstruktionen (65 kV, 385 μA). En semi-automatiseret konturmetode blev anvendt til at udvælge trabekler fra kortikal knogle. Direkte 3D målemetoder blev brugt til at vurdere procent af knoglevolumen (BV/TV), knogleoverfladedensitet (BS/TV), trabekulær adskillelse (Tb. Sp), trabekulært antal (Tb. N), trabekulær tykkelse (Tb. Th), strukturmodel indeks (SMI), trabekulær mønsterfaktor (Tb.Pdf) og gennemsnitlig knoglemineraltæthed (gennemsnitlig BMD) for samme VOI ved brug af CT(Cistanche tubulosa)Analyseprogram (Bruker, Tyskland). 3D-visualisering af VOI ved hjælp af en adaptiv gengivelsesalgoritme blev udført med CTvol-softwaren (Bruker, Tyskland).

Cistanche tubulosatilAlzheimers sygdom

2.9. Knoglehistomorfometri

Den valgte højre lårben (n=3/gruppe) blev fikseret i universaltissue fiksativ og derefter afkalket i en opløsning af 10 procent EDTA-2Na i 3 uger. De afkalkede prøver blev vasket, dehydreret med gradientethanol, indlejret med paraffinvoks og skåret i langsgående snit på 5 μm. Sektionerne blev farvet med hæmatoxylin og eosin(HE). Længdesnittene af lårbenet blev fotograferet. Knoglevævsstrukturerne i hver gruppe, især de trabekulære knoglestrukturer, blev observeret.

2.10. Biomekanisk test

De højre skinneben (n=4/gruppe) udvalgt tilfældigt blev vurderet til trepunktsbøjningstesten ved hjælp af en universel testmaskine (SHIMADZU, Japan). Diametrene af disse prøver blev målt med verniercaliper i området 2,16-2,38 mm (d). Prøven blev derefter placeret på to støttende tværstænger med en afstand på 25 mm (L) mellem de to skinner, og den fysiologiske krumning af prøven var opad. Ladningsstangen var placeret i midten af ​​prøven og faldt med en konstant hastighed på 1,5 mm/min, indtil prøven var knækket. Kraften (F) og forskydningsdata blev automatisk registreret i en computer, som var forbundet med testmaskinen, og belastnings-deformationskurven blev plottet samtidigt. Værdierne for maksimal belastning (N) og energiabsorption (mJ) blev registreret af materialetestsoftware TRAPEZIUM X på samme tid. Værdierne for maksimal spænding (MPa) blev beregnet i henhold til følgende formel: Spænding (σ)=bøjningsmoment (M)/Snitfaktor (Z) =(8 × L × F)/(π × d3).

2.11. Statistisk analyse

Resultaterne af modelgrupperne blev sammenlignet med Sham-gruppen, og resultaterne af de lægemiddelbehandlede grupper blev sammenlignet med OVX plus D-gruppen. Data blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis multiple sammenligningstest ved hjælp af Graph Pad Prism 5.0 software. Dataene blev udtrykt som middelværdi ± SD, og ​​P-værdier på mindre end 0.05 blev betragtet som statistisk signifikante.

3. Resultater

3.1. Kropsvægt

De ugentlige kropsvægte af rotter i hver gruppe gennem hele behandlingen på 8 uger blev vist i fig. 1. Sammenlignet med Sham-gruppen steg kropsvægtene for rotter i OVX plus D-gruppen, især med en signifikant forskel i de første fire uger(P < 0.05).="" efter="" at="" være="" blevet="" behandlet="" med="" ev="" og="" ech="" faldt="" kropsvægten="" af="" ​​rotter="" tydeligt="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen="" (p="">< 0.05,="" p=""><>

3.2. Evaluering af den kognitive evne

3.2.1. Evaluering af indlæringsevne i tilegnelsesfasen

De repræsentative svømmestier for rotterne i hver gruppe i erhvervelsesfasen på den 5. dag blev vist i fig. 2. Flugtlatensen for hver gruppe under erhvervelsesfasen på 5 dage blev anført i tabel 1. På den første dag var flugten latens mellem OVX plus D-gruppen og DPZ-gruppen, ACT-gruppen viste henholdsvis signifikant forskel (P < 0.05).="" fra="" den="" anden="" dag="" blev="" escape-latenstiden="" for="" sham-gruppen="" væsentligt="" forkortet,="" og="" den="" gennemsnitlige="" latens="" var="" meget="" lavere="" end="" for="" ovx="" plus="" d-gruppen.="" i="" dpz-gruppen="" faldt="" latensen="" signifikant="" (p="">< 0.05)="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen="" på="" den="" 3.="" dag.="" sammenlignet="" med="" sham-gruppen="" var="" latensen="" af="" ​​d="" og="" ovx="" plus="" d-grupper="" er="" åbenlyst="" forlænget="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.001)="" på="" den="" 4.="" dag.="" derudover,="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen,="" blev="" latensen="" af="" ​​ev,="" dpz="" og="" ech,="" act-grupper="" signifikant="" forkortet="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,01,="" p="">< 0,001).="" på="" den="" 5.="" dag="" var="" latensen="" for="" ovx="" plus="" d-gruppen="" stadig="" signifikant="" højere="" end="" den="" for="" sham-gruppen="" (p="">< 0,05),="" og="" latensen="" af="" ​​ev-="" og="" ech-grupperne="" blev="" tydeligvis="" forkortet="" (p="">< 0,05)="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="">

3.2.2. Evaluering af hukommelsesevne i sondeforsøget

De repræsentative svømmestier for rotterne fra hver gruppe i probeforsøget blev vist i fig. 3. Som vist i fig. 4 sammenlignet med Sham-gruppen, krydsningstider og svømmetid i målkvadranten af ​​OVX, D og OVX plus D-grupper faldt signifikant (P < 0.05,p="">< 0.01).="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen,="" er="" krydsningstiderne="" for="" ev,dpz="" og="" ech,="" act-grupper="" tydeligvis="" steget="" (p="">< {{10}}.05,="" p="">< 0.01)="" og="" tiden="" i="" målkvadranten="" af="" ev-="" og="" dpz-grupper="" steg="" også="" signifikant="" (p="">< 0,05,="" p=""><>

3.3. Biokemisk analyse af serum

Som vist i fig. 5A og B, sammenlignet med Sham-gruppen, steg aktiviteterne af BALP og TRAP i OVX- og OVX plus D-grupper signifikant (P < 0.001="" ),="" som="" var="" det="" typiske="" kendetegn="" ved="" high-turnover="" osteoporose="" forårsaget="" af="" ovariektomi.="" aktiviteterne="" af="" balp="" og="" trap="" i="" ev-,="" dpz-,="" ech-="" og="" act-grupper="" faldt="" tydeligvis="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen="" (p="">< 0.05,="" p="">< 0.01,="" p=""><>

Ovariektomi, intraperitoneal injektion af D-galactose og intragastrisk administration af AlCl3 kan forårsage oxidativ skade (Muthusami et al., 2{{10}}05; A. Prakash et al., 2 013). Som vist i Fig. 5C Ovariektomi kan intraperitoneal injektion af D-galactose og intragastrisk administration af AlCl3 forårsage oxidativ skade (Muthusami et al., 20{{20}}5; A. Prakash et al., 2013). Som vist i fig. 5C og D var SOD-aktiviteterne for OVX-, D- og OVX plus D-grupper signifikant lavere end for Sham-gruppen (P < 0,05,="" p="">< 0,001),="" og="" mda-indholdet="" af="" ovx,="" d="" og="" ovx="" plus="" d-grupper="" steg="" signifikant="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,001)="" sammenlignet="" med="" sham-gruppen.="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen,="" efter="" at="" være="" blevet="" behandlet="" med="" ev,="" dpz,="" ech="" og="" act,="" steg="" sod-aktiviteten="" signifikant="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,001),="" og="" mda-indholdet="" faldt="" til="" en="" vis="" grad,="" især="" i="" ev-gruppen="" (p=""><>

3.4. Biokemisk analyse af hippocampus

Som vist i fig. 6A var AChE-aktiviteten af ​​OVX plus D-gruppen tydeligvis højere end den for Sham-gruppen (P < 0.05),="" hvilket="" indikerede,="" at="" indlærings-="" og="" hukommelsesevnen="" af="" ovx="" plus="" d-gruppen="" kan="" reduceres="" med="" accelerationen="" af="" ​​hydrolyse="" af="" acetylcholin="" i="" hjernen.="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen="" faldt="" ache-aktiviteten="" i="" lægemiddelbehandlingsgrupper="" til="" en="" vis="" grad,="" især="" i="" ev-gruppen="" (p="">< 0.01).="" som="" vist="" i="" fig.="" 6b,="" sammenlignet="" med="" sham-gruppen,="" faldt="" chat-aktiviteterne="" for="" ovx-,="" d-="" og="" ovx="" plus="" d-grupper="" tydeligvis="" (p="">< {{10}}.01,="" p="">< 0,001),="" hvilket="" indikerede,="" at="" deres="" indlærings-="" og="" hukommelsesevner="" hos="" dem="" kunne="" påvirkes="" på="" grund="" af="" deres="" langsommere="" syntese="" af="" acetylcholin="" i="" hjernen.="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen="" steg="" chat-aktiviteterne="" for="" ev,="" dpz="" og="" ech,="" act-grupper="" signifikant="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,01,="" p=""><>

Den oxidative skade kan også forekomme i hippocampus (Dileket al., 2010; Yang et al., 2013). Som vist i Fig. 6C og D, sammenlignet med Sham-gruppen, faldt SOD-aktiviteterne for OVX, D og OVX plus D grupper signifikant (P < 0.01,="" p="">< 0.="" 001),="" og="" mda-indholdet="" steg="" naturligvis="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,001).="" efter="" at="" være="" blevet="" behandlet="" med="" ev,="" dpz,="" ech="" og="" act,="" steg="" sod-aktiviteten="" signifikant="" (p="">< 0,001),="" og="" mda-indholdet="" faldt="" signifikant="" (p="">< 0,001)="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="">

3.5. Analyse af hippocampus histomorfologi

Som vist i fig. 7A var neuronerne i hippocampus af Sham-gruppen ensartet farvet. I mellemtiden var neuronernes morfologiske træk tydelige med den åbenlyse nukleolus. Arrangementet af dem var også pænt og kompakt med et stort antal og intakt struktur. I OVX-, D- og OVX plus D-grupperne reduceredes antallet af neuroner i hippocampus signifikant sammenlignet med Sham-gruppen. Neuronerne var arrangeret uordentligt, og hulrummene blev udvidet. Især i D og OVX plus D grupper blev der fundet færre neuroner i hippocampus, og fordelingen af ​​dem var spredt. Den karyopynose og utydelige morfologiske træk ved neuroner og nekrotiske neuroner forekom også i D- og OVX plus D-grupperne. Som vist i fig. 7B efter lægemiddelinterventionen var antallet af neuroner i hippocampus af EV-, DPZ-, ECH- og ACT-grupper signifikant højere end i OVX plus D-gruppen. Samtidig var justeringen mellem neuroner relativt velordnet, og antallet af neuroner med karyopyknose og nekrose faldt også.

3.6. Uterus vådvægt og analyse af livmoderhistomorfologi og morfometri

Som vist i fig. 8 var uterus vådvægten af ​​OVX og OVX plus D-grupper signifikant lavere end den for Sham-gruppen (P < 0.05,p="">< 0.="" 01).="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen="" steg="" livmoderens="" våde="" vægte="" af="" ev-gruppen="" tydeligt="" (p="">< 0,01)="" under="" påvirkning="" af="" østradiolvalerat.="" derudover="" steg="" livmoderens="" våde="" vægte="" af="" dpz-gruppen="" og="" ech-gruppen="" også="" til="" en="" vis="">

Som vist i fig. 9A var livmoderen i Sham-gruppen et tykvægget muskulært organ, og uterusslimhindeepitelet var et enkeltlagssøjleepitel. Lamina propria var fordelt med uterineglands og blodkar. Det muskulære lag var sammensat af bundtede eller stykker af glat muskulatur, og muskelfiberen var tæt anbragt. I grupperne OVX og OVX plus D krympede livmoderen betydeligt med luminalstenose. Endometriet og muskellaget var betydeligt tyndere end det i Sham-gruppen. Derudover blev antallet af livmoderkirtler reduceret, og muskelfibrene var tynde. Som vist i fig. 9B, sammenlignet med OVX plus D-gruppen, blev livmoderens histomorfologi forbedret til en vis grad efter at være blevet behandlet med EV, DPZ, ECH og ACT. Især i EV-gruppen var livmoderen signifikant fuld, endometrium og muskellag var tydeligvis tykt. Desuden steg antallet af livmoderkirtler, og muskelfibrene blev udvidet.

Resultaterne af morfometrisk analyse af livmoderen i hver gruppe blev vist i fig. 10A–C. Sammenlignet med Sham-gruppen faldt uterindiameteren, tykkelsen af ​​uterus slimhindeepitel og antallet af livmoderkirtler i OVX- og OVX plus D-grupperne signifikant (P < 0.01,="" p="">< 0,001).="" efter="" at="" være="" blevet="" behandlet="" med="" ev,="" steg="" livmoderdiameteren,="" tykkelsen="" af="" ​​uterus="" slimhindeepitel="" og="" antallet="" af="" livmoderkirtler="" tydeligvis="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen="" (p="">< 0,001).="" derudover="" viste="" ech="" og="" act="" også="" tendensen="" til="" stigende="" uterindiameter,="" uterin="" slimhindeepiteltykkelse="" og="" antallet="" af="">

3.7. Mikro-CT analyse

Todimensionelle billeder af transektionen af ​​den distale femoralcancellous knogle blev opnået med Bruker DataViewer-software, som er vist i fig. 11A. Efter udført med CTvol-software blev tredimensionelle billeder af den trabekulære knogle i VOI-regionen af ​​den distalfemorale spongeknogle i hver gruppe vist i fig. 11B. Endvidere er den gennemsnitlige BMD, BV/TV, SMI, Tb. N, Tb. Sp, Tb.Th, BS/TV og Tb. Pf, som blev analyseret med CTAn-software, blev også vist i tabel 2 og tabel 3.

Som figurerne er vist ovenfor, sammenlignet med Sham-gruppen, faldt det trabekulære antal og det trabekulære område i OVX plus D-gruppen tydeligvis. I mellemtiden indikerede kvantificeringen af ​​forskellige trabekulære parametre også, at den gennemsnitlige BMD, BV/TV, Tb. N, Tb.Th, BS/TV faldt signifikant i OVX plus D-gruppen (P < {{0}}.05,="" p="">< 0,01)="" og="" smi,="" tb.="" sp,="" tb.="" pf="" for="" ovx="" plus="" d-gruppen="" steg="" tydeligvis="" (p="">< 0,01).="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="" d-gruppen="" blev="" den="" trabekulære="" mikroarkitektur="" til="" en="" vis="" grad="" forbedret="" efter="" at="" være="" blevet="" behandlet="" med="" ev="" og="">

3.8. Analyse af knoglehistomorfologi

De trabekulære strukturer af spongøs knogle i den distale femora i hver gruppe blev vist i fig. 12. Sham-gruppen havde mange trabekler, som var tykke og indbyrdes forbundet til et netværk. Sammenlignet med Shamgruppen var trabeklerne i OVX- og OVX plus D-grupperne signifikant reduceret og fortyndet. Især trabeklerne i OVX plus D-gruppen blev meget ødelagt, og de fleste af dem kunne ikke forbindes til et netværk. Derudover var trabeklerne i D-gruppen også tydeligvis fortyndede. Efter at være blevet behandlet med EV og ECH, steg trabeklerne signifikant, og de blev fortykket og retikuleret sammenlignet med OVX plus D-gruppen. De morfologiske træk ved EV-gruppen var tæt på dem hos Sham-gruppen. I mellemtiden blev de trabekulære strukturer af DPZ- og ACT-grupper også forbedret til en vis grad.

3.9. Biomekanisk analyse

Resultaterne af trepunktsbøjningstesten blev vist i tabel 4. Sammenlignet med Sham-gruppen blev den maksimale belastning og maksimale belastning signifikant reduceret (P < 0.05,="" p="">< 0,01)="" i="" ovx="" og="" ovx="" plus="" dgroups,="" og="" energioptagelsen="" faldt="" også="" meget.="" efter="" at="" være="" blevet="" behandlet="" med="" ev="" og="" ech="" steg="" den="" maksimale="" belastning,="" maksimal="" stress="" og="" energiabsorption="" til="" en="" vis="" grad="" sammenlignet="" med="" ovx="" plus="">

4. Diskussion

Den epidemiologiske undersøgelse af osteoporose afslørede, at antallet af kvindelige patienter var mere end mandlige patienter, og det forekom ofte hos ældre og postmenopausale kvinder (Chen et al., 2016). Osteoporose har alvorligt påvirket ældres helbred, og det er blevet en af ​​de alvorlige sociale problemer på verdensplan (Deal, 2009; Roy et al., 2011; Bessette et al., 2011). De epidemiologiske undersøgelser afAlzheimers sygdomhar vist, at forekomsten og udbredelsen afAlzheimers sygdomsteg eksponentielt efterhånden som alderen steg, især forekommende hos ældre over 65 år (Sosa Ortiz et al., 2012). Desuden var forekomsten af ​​AD signifikant højere hos kvinder sammenlignet med mænd (Mielke et al., 2014). Nylige skøn antydede, at næsten to tredjedele af de personer, der fik diagnosen ADAlzheimers sygdomvar kvinder (Hebert et al., 2013). Bemærkelsesværdigt nok har den globale udbredelse af AD lagt en betydelig byrde på samfundet (Reitzand Mayeux, 2014).

Undersøgelser er blevet rapporteret, at den vigtigste årsag til postmenopausal osteoporose var mangel på østrogen (Klein-Nulendet al., 2015). Det kunne signifikant accelerere knogleomsætningshastigheden og få knogleresorptionshastigheden til at overstige knogledannelseshastigheden, hvilket resulterer i tab af knoglemasse, fald i knoglemineraltæthed og fald i knoglestyrke (Tella og Gallagher, 2014). Desuden er det også blevet vist, at postmenopausale kvinder har en øget risiko for kognitiv svækkelse eller demens (Rocca et al., 2007). Nogle undersøgelser har vist, at østrogen spiller en afgørende rolle i behandlingen af ​​AD, som omfatter opretholdelse af hippocampus funktion under aldring (Han et al., 2013), forøgelse af cholinacetyltransferaseaktivitet i hippocampus (Gibbs og Aggarwal, 1998), reduktion af aggregeringen af ​​amyloid-beta (Nilsen et al., 2006).

Det var afgørende at vælge de anvendelige rottemodeller til undersøgelser af osteoporose ogAlzheimers sygdom. Den ovariektomi-inducerede osteoporosemodel er blevet bredt brugt i undersøgelser af osteoporose (Zhao et al., 2011; Liu et al., 2018). Selvom patogenesen af ​​AD er forskelligartet, har undersøgelser vist, at oxidativ stress og aluminiumeksponering var de vigtige årsager til AD (Xiao et al., 2011; Bhattacharjee et al., 2014). D-galactose er en slags reducerende sukker invivo. Når det var meget højere end det normale niveau i kroppen, kunne det oxideres af galactoseoxidase til aldehyderne, som ikke kunne metaboliseres yderligere og stort set kunne akkumuleres i hjernen, hvilket som følge heraf forårsagede oxidativ stress og apoptose af neurocytter (Cui et al., 2006). Aluminium kan nemt krydse blod-hjerne-barrieren og har tydelig neurotoksicitet for hjernen (D. Prakash et al., 2013). Det kan forårsage ekstracellulær aflejring af neuroner og inducere produktionen af ​​reaktive oxygenarter (ROS), som forårsager oxidativ stress og svækkelse i neuroner (Walton, 2013). Adskillige undersøgelser har vist, at behandlingen af ​​D-galactose kombineret med AlCl3-dyr, især gnavere, kan forringe deres indlærings- og hukommelsesevne betydeligt (Chiroma et al., 2018). Det kunne inducere ekspression og akkumulering af A 1-42 i hjernebarken og hippocampus (Yang et al., 2014). Derudover har undersøgelser også vist, at ovariektomi kombineret med en langvarig intraperitoneal injektion af D-galactose kan resultere i de patofysiologiske ændringer forbundet med Alzheimers sygdom, såsom synaptisk tab, svækkelse af astrocytter, intracellulær A-akkumulering og neurofibrillære sammenfiltringer, som kan fungere som en dobbelt skadesmodel for AD (Su et al., 2010).

I vores undersøgelse blev tre modelgrupper af henholdsvis OVX-gruppe, D-gruppe og OVX plus D-gruppe indstillet til at bekræfte, at metoden til ovariektomikirurgi kombineret med en intraperitoneal injektion af D-galactose og intragastrisk administration af AlCl3 bedre kunne resultere i de patologiske træk ved osteoporose ogAlzheimers sygdompå samme tid.

Flere metoder blev brugt til at evaluere modellen for osteoporose kombineret medAlzheimers sygdom. Indlæring og hukommelse er nogle af aktiviteterne på højt niveau i hjernen.Alzheimers sygdomkan forårsage forskellige grader af kognitiv svækkelse (Albert et al., 2011). Indlærings- og hukommelsestesten af ​​gnavere er en almindelig metode til at studere kognitiv adfærd og mekanismer inden for neurovidenskab (Kwon et al., 2011). Morris Water Maze (MWM) test blev brugt i vores undersøgelse til at evaluere lærings- og hukommelsesevnen hos rotter, som er blevet meget brugt i neurobiologi og neurofarmakologisk forskning af gnavere (Gacar et al., 2011). Resultaterne af MWM-testen viste, at escapelatensen for OVX plus D-gruppen steg signifikant, og krydsningstider og svømmetid i målkvadranten for OVX plus D-gruppen faldt tydeligt sammenlignet med Sham-gruppen, hvilket indikerede, at den kognitive evne hos rotter i OVX plus D-gruppen var alvorligt svækket. Thehippocampus, et hjerneområde, der er afgørende for indlæring og hukommelse, er særligt sårbart over for skader i de tidlige stadier af AD. (Mu og Gage, 2011). Den biokemiske analyse af hippocampus afslørede, at AChE-aktiviteten åbenlyst var højere, og ChAT-aktiviteten var meget lavere i OVX plus D-gruppen end i Sham-gruppen, hvilket indikerede, at indlærings- og hukommelsesevnen hos OVX plus D-gruppen kan være svækket på grund af faldet i acetylcholin i hjernen. Derudover kunne den oxidative skade også have påvirket hippocampus' normale funktioner på grund af faldet i SOD-aktivitet og stigning i MDA-indhold i OVX plus D-gruppen. Den histomorfologiske analyse af hippocampus viste, at antallet af neuroner reduceredes signifikant, og at neuronerne var arrangeret uordnet i OVX plus D-gruppen sammenlignet med sham-gruppen, hvilket indikerede, at neuronerne i hippocampus var blevet alvorligt svækket.

Dannelsen af ​​osteoporose blev vurderet ved serumbiokemi, mikro-CT, knoglehistomorfologi og biomekanisk test i vores undersøgelse. Aktiviteterne af BALP og TRAP i serum er det repræsentative indeks i knogledannelse og knogleresorption (Rufus et al., 2013). Sammenlignet med Sham-gruppen steg aktiviteterne af BALP og TRAP i OVX og OVX plus D-grupper signifikant, hvilket var de typiske træk ved high-turnover osteoporose forårsaget af ovariektomi. I mellemtiden opstod der også oxidativ skade hos rotterne i OVX plus D-gruppen på grund af faldet i SOD-aktivitet og stigning i MDA-indhold, hvilket yderligere accelererede osteoporoseprocessen. Mikro-CT er en slags teknik med funktionerne i non-invasiv billeddannelse kombineret med histologisk detektion af høj opløsning, der er særligt velegnet til knoglebilleddannelse og forskning af knogleparametre (Ito, 2011). Resultaterne af mikro-CT-analyse indikerede, at faldet i BMD, et stort tab af knoglemasse og ødelagt mikroarkitektur af trabekler blev vist i OVX plus D-gruppen sammenlignet med Sham-gruppen. Knoglehistomorfologien viste også, at trabeculae var signifikant ødelagt i OVX plus D-gruppen. Osteoporose kan øge risikoen for fraktur, og den biomekaniske knogletest kunne bruges til at påvise knoglestyrke (Mears et al., 2010). Trepunktsbøjningstesten af ​​skinnebenet viste, at knoglestyrken af ​​OVX plus D-gruppen faldt signifikant sammenlignet med Sham-gruppen. Derudover afslørede analysen af ​​uterus histomorfologi og morfometri, at livmoderen krympede signifikant, endometriet var tydeligvis tyndere, og antallet af uterinkirtler reduceret i OVX plus D-gruppen sammenlignet med sham-gruppen for manglen på østrogen.

Cistanche tubulosaer en velkendt tonic i traditionel kinesisk medicin, der har virkningerne af immunregulering, antioxidant, anti-aging, neurobeskyttelse og fremme af osteoblastvækst (Li et al.,2016). Echinacosid og acteosid er de vigtigste aktive bestanddele iCistanche tubulosa, og deres forskellige farmakologiske virkninger er værdige at blive undersøgt til bunds (Fu et al., 2018).

I vores nuværende eksperiment er virkningerne af echinacosid eller acteoside på rottemodellen for osteoporose kombineret medAlzheimers sygdom varyderligere studeret. Det viste tydelige virkninger på osteoporose og Alzheimers sygdom, især echinacosid. Resultaterne indikerede, at echinacosid signifikant kunne øge indlæring og hukommelsesevne og forbedre kognitiv dysfunktion ved at fremme syntesen af ​​acetylcholin og beskytte neuronerne i hippocampus. I mellemtiden kunne echinacosid og acteosid signifikant reducere knogleresorptionen ved at reducere aktiviteterne af BALP og TRAP. Ydermere kunne de øger også den gennemsnitlige knoglemineraltæthed og knoglestyrke ved at forhindre tab af knoglemasse og forbedre mikroarkitekturen af ​​trabekler. Derudover viste echinacosid og acteosid også tendensen til at forbedre livmoderens tilstand. Det er blevet rapporteret, at echinacosid og acteosid har en østrogenlignende effekt (Wang et al., 2014). Vores tidligere undersøgelse havde også vist, at som en ny slags phytoøstrogen kunne echinacosid effektivt forhindre osteoporose og hæmme knogleresorption efter ovariektomi hos rotter (Li et al., 2013). Ifølge disse resultater kan echinacoside eller acteosid træde i kraft via østrogensignalvejen eller anden vej forbundet med østrogen. I den følgende forskning vil flere doser af echinacosid eller acteosid blive sat for at afsløre dosis-effekt-forholdet, og de relevante signalveje vil blive yderligere undersøgt for at belyse de almindelige mekanismer for echinacosid eller acteosid onosteoporose kombineret medAlzheimers sygdom.

Cistanche tubulosatilAlzheimers sygdom

5. Konklusion

Rottemodellen af ​​osteoporose kombineret medAlzheimers sygdom vargennemførligt og med succes etableret i vores undersøgelse. I mellemtiden, echinacosid og acteosid fraCistanche tubulosahar vist de signifikante effekter af at forbedre indlærings- og hukommelsesevnen, regulere knoglemetabolismen, reducere den oxidative skade og beskytte neuronerne på denne samtidige model. Echinacosid og acteosid kunne være de potentielle kandidater med dobbelteffekter og give eksperimentelt bevis for yderligere undersøgelse af molekylære mekanismer i følgende forskning.

Forfatteres bidrag

Yi Chen skrev manuskriptet. Yi Chen, Ying-Qi Li og Jia-Yi Fang udførte eksperimenterne. Yi Chen analyserede dataene. Fei Li og PingLi designede undersøgelsen og reviderede manuskriptet.

Erklæring om konkurrerende interesse

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser i dette manuskript, og der er ingen væsentlig økonomisk støtte til dette arbejde, der kan påvirke dets resultat.

Fra: 'Etablering af den samtidige eksperimentelle model for osteoporose kombineret med Alzheimers sygdom hos rotter og de dobbelte virkninger af echinacosid og acteosid fra Cistanche tubulosa' af Yi Chena, et al.

---Journal of Ethnopharmacology 257 (2020) 112834