Karkirurgipatienter med forhøjede neutrofil-til-lymfocytforhold har nedreguleret neutrofil komplement RNA-ekspression

Forhøjet neutrofil-til-lymfocyt-forhold (NLR) hos patienter, der gennemgår elektiv vaskulær kirurgi (EVS), har øget dødelighed uafhængigt af perioperative kirurgiske resultater. For at forstå, hvorfor høj NLR er forbundet med højere dødelighed, undersøgte vi neutrofil- og lymfocyttranskriptomekspression hos patienter, der gennemgår EVS. Blodprøver blev indsamlet fra patienter, der gennemgår EVS, og raske donorer til NLR-beregning. RNA-prøver blev isoleret fra patienternes neutrofiler og lymfocytter og opdelt i NLR_Lav (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Introduktion

Kardiovaskulær sygdom (CVD) er en førende dødsårsag på verdensplan. Det skyldes i høj grad åreforkalkning og åreforkalkning, der ud over individuel genetik og kost medieres af inflammatoriske og immunmekanismer.1-3 For nylig er det differentielle leukocyttal (neutrofiler og lymfocytter) kommet i fokus. at forudsige kardiovaskulære (CV) resultater. Forholdet mellem det absolutte neutrofil-til-lymfocyttal (NLR) er blevet anerkendt som en forudsigelse for total dødelighed i adskillige små undersøgelser af akutte koronarinterventioner,4-6 hypertension,7,8 og hjertesvigt.9

Tabel 1. Kliniske karakteristika for patienter med elektiv karkirurgi undersøgt ved RNA-seq.

Tidligere undersøgelser har også vist, at NLR er en prædiktor for langsigtede resultater hos patienter med perifer vaskulær sygdom.10-13 Vores retrospektive undersøgelser af patientpopulationer for karkirurgi understøtter denne konklusion. I 1 undersøgelse af 108 patienter med elektiv endovaskulær abdominal abdominal aortaaneurisme-reparation var der ingen forskel i den 30-dag postoperative mortalitet mellem en NLR på<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 patienter, 42,6 % risiko for slagtilfælde) end dem med en NLR på<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] NLR-grupper).16 Patienter med en lavere præoperativ NLR opnåede signifikant større amputationsfri overlevelse ved 4-års opfølgningen (lav NLR 65,5 %, middel NLR, 37,5 % og høj NLR, 17,6 % [P < 0,0001]).16

I denne undersøgelse udførte vi RNA-sekventering (RNA-seq) af neutrofiler og lymfocytter fra patienter, der kvalificerede sig til elektiv vaskulær kirurgi (EVS) reparation for at bestemme potentielle mekanismer for forhøjet NLR. Studierne undersøgte, om der er et molekylært grundlag for forhøjet NLR. Vores undersøgelser afslører, at patienter med forhøjet NLR, som havde EVS-reparation, er kendetegnet ved meget signifikant nedregulering af immunoglobulin- og komplementgener i neutrofiler.

cistanche fordele-styrker immunsystemet

Metoder

Patienter

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL), rygestatus, statinbehandling, en anamnese med kronisk obstruktiv lungesygdom, cancer, kronisk nyresygdom, koronararteriesygdom (CAD), perifer arteriel sygdom, cerebrovaskulær sygdom og kronisk hjertesvigt. Alle patienter havde en fuldstændig blodtælling med differentieret antal hvide blodlegemer. Patienterne blev opdelt i lav NLR (NLR_Lav [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Blodadskillelse

Fuldblod (20 ml pr. patient) blev opsamlet i 10 ml vacutainer-rør antikoaguleret med EDTA, og blodet blev adskilt inden for en time efter opsamling. Neutrofil- og lymfocytcellepopulationer blev hver isoleret fra 8 ml blod ved hjælp af EasySep direkte humane celleisoleringskit (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) og Big Easy EasySep-magneten (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) i henhold til producentens protokoller. Magneten blev afkølet på is før, og blodcellerne og reagenserne blev forsigtigt blandet ved at vende røret om i modsætning til pipettering. Reagensforholdene blev også justeret på følgende måde for at optimere genvinding: 400 ml antistofblanding, 400 ml magnetiske perler og 4 ml fosfatbufret saltvand blev tilsat til blodet før den første separation, efterfulgt af 200 ml antistof blanding og 400 ml perler før den anden adskillelse og 200 ml perler før den tredje og sidste adskillelse. En lille alikvot på 200 ml blev taget fra de endelige genvindingsvolumener til celletælling og præparation af objektglas. Resten af ​​genvindingsvolumenet blev centrifugeret ved 1000 omdrejninger pr. minut i 7 minutter for at pelletere cellerne.

Figur 1. Helt transkriptom af RNA fra neutrofiler og lymfocytter indsamlet fra patienter med NLR, høj (NLR_Høj), lav (NLR_Lav) eller kontrol (NLR_kontrol) . Bogstavkoden "N" eller "L" i prøvenavnet betyder, at enten neutrofiler eller lymfocytter var kilden til RNA'et. Der var 6 patienter inden for hver kategori. Blå=reduceret udtryksniveau; rødt=højt udtryksniveau.

Celletælling og klargøring af objektglas

Celler resuspenderet i phosphatbufret saltvand blev yderligere alikvoteret, blandet med trypanblåt og manuelt talt ved anvendelse af et hæmocytometer. Typisk blev 9 × 106 til 15 × 106 neutrofiler og 3 × 106 til 10 × 106 lymfocytter isoleret pr. prøve. Objektglas af de isolerede celler blev fremstillet ved anvendelse af en cytocentrifuge, centrifugeret ved 600 omdrejninger pr. minut i 3 minutter og derefter farvet med Wright-Giemsa-farve. Renheden af ​​hver cellepopulation blev bestemt ved manuel tælling, hvor mindst 1000 celler blev skelnet pr. objektglas. Den gennemsnitlige renhed af neutrofil- og lymfocytseparationerne ved celletælling var henholdsvis 98,3 % og 96,2 %. Flowcytometri blev udført på 1 prøvepar af neutrofiler og lymfocytter og indikerede henholdsvis 90,6 % og 92,2 % renhed. De andre celler i neutrofilpræparatet blev nedbrudt i lymfocytter (4%), monocytter (2%), eosinofiler (2,3%) og basofiler (0,3%). I lymfocytpræparatet var de andre celler neutrofiler (1,2%), monocytter (1,4%), eosinofiler (1,2%) og basofiler (1,8%). Bulk RNA-seq data fra alle individuelle prøver blev også brugt til at bestemme omfanget af monocytkontamination i cellepræparaterne ved at bestemme, om neutrofiler eller lymfocytter fra NLR_Høj eller NLR_Lavprøver havde signifikant øget CD14 , CD68, CD83 eller CD163. Uafhængigt blev RNA-seq-dataene indtastet for at estimere andelen af ​​immun- og cancerceller (EPIC), et program designet til at estimere andelen af ​​immun- og cancerceller i bulk-genekspressionsdata.17 Den anvendte referenceprofil blev leveret af EPIC for blodcirkulerende immunceller og indeholder profilen for B-celler, CD4- og CD8-T-celler, monocytter, neutrofiler og naturlige dræberceller. Det rapporterede output er givet som cellefraktioner pr. prøve.

Figur 2. Signifikant differentielt udtrykte gener fra neutrofiler og lymfocytter. (A) Antallet af signifikant differentielt udtrykte gener i neutrofiler (blå) og lymfocytter (orange). (B) Det primære komponentanalyseplot af signifikant differentielt udtrykte gener i neutrofiler (grøn og lilla) og lymfocytter (rød og blå) i NLR_Høj (cirkler) og NLR_Lav (firkanter). (C) Et varmekort over signifikant differentielt udtrykte gener fra NLR_Høj vs NLR_Lav neutrofil RNA. (D) Et varmekort over signifikant differentielt udtrykte gener fra NLR_Høj vs NLR_Lavt lymfocyt-RNA.

RNA-seq og statistisk analyse

Detaljerede metoder til RNA-ekstraktion og sekventering er præsenteret i de supplerende metoder. Sekvenslæsninger blev vurderet for kvalitet, og adapteren blev trimmet ved hjælp af TrimGalore! (Babraham Institute), et indpakningsscript til FastQC og CutAdapt. Aflæsninger, der bestod kvalitetskontrol, blev justeret til det humane referencegenom GRCh38 ved hjælp af STAR aligner-softwaren. De justerede læsninger blev behandlet ved hjælp af Cufflinks version 2.2.1 til differentiel ekspressionsanalyse ved brug af GENCODE-genannotationen for GRCh38, og gen-niveau ekspressionsdata blev rapporteret i fragmenter pr. kilobase-transkript pr. million læsninger kortlagt.18 Signifikant differentielt udtrykte gener blev identificeret ved hjælp af en falsk opdagelsesrate cutoff P værdi på<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Resultater

Patientkarakteristika

Seks par af patientprøver blev valgt ud af 7 NLR_Høj og 9 NLR_Lav baseret på den højeste kvalitet af RNA'et i parret vurderet ved RNA-integritetsnummeret (RIN) (tabel 1) ). Seks kontroller fra 8 raske donorer blev også undersøgt. Hos patienterne inkluderet i undersøgelsen var middelværdien ± standardafvigelse NLR for NLR_Høj 4,37 ± 0.66 vs. for NLR_Lav, 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Den gennemsnitlige ± standardafvigelse af alder for patienterne var 61,0 ± 17,0 år for NLR_Høj og 64,5 ± 7,5 år for NLR_Lav (P= .68). Alle undtagen 1 patient havde aortaaneurismesygdom, 9 var thorax/thoracoabdominale, og 2 var abdominale. Begge patienter med abdominal aortaaneurisme var i NLR-_lav-gruppen. Elleve ud af de 12 patienter havde en historie med hypertension. Fire ud af 6 patienter i både NLR_Høj eller NLR_lave grupper havde en anamnese med lipidabnormiteter. Fire patienter i NLR_Høj og 3 patienter i NLR_lave grupper var tidligere rygere. En patient i NLR_lavgruppen var en aktiv ryger. Fem patienter i NLR_Høj og 4 i NLR_lave grupper fik statiner. Kun 3 patienter i begge grupper var diabetikere. En patient i hver gruppe havde en historie med CAD, og ​​2 patienter i NLR_lav-gruppen havde perifer arteriesygdom.

Figur 3. RNA-seq-dataene i denne undersøgelse blev brugt som et uafhængigt middel til at bestemme anden cellekontamination i neutrofil- og lymfocytpræparaterne. Kun data fra neutrofilerne vises. En EPIC-analyse blev udført for at estimere andelen af ​​immun- og cancerceller i bulk-genekspressionsdata. Denne analyse gav procentdelen af ​​neutrofiler, monocytter, B-celler, CD4 T-celler, CD8 T-celler, naturlige dræberceller (NK) og andre celler i neutrofilpræparatet.

Helt transkriptom

Vi observerede globale forskelle i hele transkriptomet, når vi sammenlignede genekspressionsprofiler mellem neutrofiler og lymfocytter (figur 1). Dette fund var ikke overraskende, da celletypespecifik genekspression tidligere er blevet karakteriseret som forskellig.19 I neutrofilsektionen på tværs af patienterne i NLR_Høj, NLR_Lav og NLR{{ 4}}Kontrolgrupper, der var mange gener opregulerede, som tydeligvis ikke var opregulerede i lymfocytsektionen og omvendt. På hele transkriptomniveauet var de cellespecifikke forskelle mellem neutrofiler og lymfocytter distinkte og dominerende uanset NLR eller om en patient eller kontrol. Men ved nærmere undersøgelse begyndte forskelle at vise sig. Et plot for hovedkomponentanalyse viste, at NLR_Kontrol for enten neutrofiler eller lymfocytter overlappede med NLR_Høj og NLR_Lav i begge celler (Supplerende figur 1). Undersøgelser søgte derefter at finde yderligere forskelle mellem NLR_Høj og NLR_lave grupper i de signifikant differentielt udtrykte gener. Det blev observeret, at 900 (74,5 %) signifikant differentielt udtrykte gener blev observeret i neutrofiler i NLR_Høj vs NLR_Lav grupper (figur 2A). Til sammenligning havde lymfocytter kun 190 (15,7%) signifikant differentielt udtrykte gener. Et hovedkomponentanalyseplot af NLR_Høje gener vs NLR_Lav gener i neutrofiler og lymfocytter afslørede, at gruppen af ​​NLR_Høj vs NLR_Lav gener i neutrofiler adskilte sig i 2 forskellige områder, hvorimod NLR_Høj og NLR_Lav lymfocyt gener overlappede (figur 2B). Igen, som med hele transkriptomdataene, overlappede NLR_Kontrol med NRL_Høj og NLR_Lav signifikant differentielt udtrykte gener i både neutrofiler og lymfocytter (supplerende figur 2). De fleste af de signifikant differentielt udtrykte gener i NLR_Højt af neutrofiler blev nedreguleret fra NLR_Low (Figur 2C). Et lignende, men meget lavere antal gener blev nedreguleret i NLR_Højt af lymfocytter end det for neutrofiler (figur 2D). Disse data antydede, at NLR-niveauer for det meste var forbundet med ændret genekspression i neutrofiler. Desuden skulle den sammenlignes med patienter fra dens sygdomsgruppe NLR_Lav, ikke NLR-kontrol, fordi den førstnævnte gruppe klart adskilte sig fra NLR_Høj men ikke NLR_kontrol ( figur 2B; supplerende figur 2).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Før undersøgelse af den differentielle ekspression af gener og gensætberigelse, karakteriserede yderligere undersøgelser graden af ​​monocytkontamination i neutrofilpræparatet. Ved at bruge RNA-seq-dataene observerede vi, at ekspressionen af ​​monocytmarkørerne CD14, CD68, CD83 og CD163 i NLR_Høj vs NLR_lave neutrofiler eller lymfocytpræparater ikke var signifikant forskellige. EPIC-analysen af ​​de neutrofile RNA-seq-data viste, at ikke-immune celler ("andre celler") og CD4 T-celler var de vigtigste kontaminanter i neutrofilpræparaterne (figur 3). Bortset fra NLR{{10}}Lav-CD4-T-celler og B-celler var ingen af ​​de andre kontaminerende celler signifikant forskellige i NLR-_lave neutrofiler vs. NLR-_høje neutrofiler . I neutrofilpræparatet var monocytkontamination ved EPIC-analyse kun 0.17 % ± 0.05 % for NLR_Lav vs. 0,1 % ± 0,033 % for NLR_Høje forberedelser (P=.12). Denne værdi indikerer, at monocytkontamination var en størrelsesorden lavere, når den blev bestemt ved RNA-seq-dataanalyse vs flowcytometri.

Figur 4. Scatter-bobleplot af signifikant udtrykte GO-gensætkategorier for biologiske processer mellem NLR_Høj og NLR_Lav. Forholdet mellem k:K på abscissen er antallet af gener, der udtrykkes signifikant differentielt (k) sammenlignet med det samlede antal gener i kategorien (K). Ordinaten er betydningen af ​​berigelsen udtrykt som log (P-værdi). (A) GO-gensæt afledt af neutrofil RNA-seq, der sammenligner NLR_Høj med NLR_Lav. (B) GO-gensæt afledt af lymfocyt-RNA-seq. Gensæt i nederste venstre hjørne af begge plots er de mindst signifikante. Gensæt i øverste højre hjørne af begge plots er de mest betydningsfulde.

Figur 4 (fortsat)

For at undersøge arten af ​​de differentielt udtrykte gener udførte vi en GSEA med Gene Ontology (GO) kategorier for biologiske processer ved at bruge de signifikant differentielt udtrykte gensæt mellem NLR_Høj og NLR_Lav. Resultaterne er vist i scatter boble plots (figur 4). Opdeling af gensæt i øverste højre hjørne af hvert af plottene viser (1) en høj procentdel af generne i gensættene, som er væsentligt ændret og (2) en høj grad af betydning for berigelsen af ​​gensættet. I vores prøve viste scatter-boble-plottene berigelsen af ​​både komplement- og humoral respons GO-kategorier uafhængigt for både neutrofiler og lymfocytterne. I neutrofiler var gensættene for den klassiske vej for komplementaktivering, regulering af proteinaktiveringskaskade og humoral immunrespons medieret af cirkulerende immunglobulin de mest signifikante med den højeste procentdel af gensætmedlemmer signifikant ændret (figur 4A). Uafhængigt blev de identiske gensæt i lymfocytter også observeret at have et højt forhold mellem signifikant ændrede gener og en grad af betydning som i neutrofilundersøgelserne (figur 4B).

Tabel 2. Immunologisk gensæt i neutrofiler og lymfocytter

Tabel 2 viser de mest signifikant ændrede immunologiske gensæt i neutrofiler (tabel 2, panel A) og lymfocytter (tabel 2, panel B). Denne undersøgelse sammenlignede genekspression i neutrofiler eller lymfocytter mellem NLR_høje prøver og NLR_lave prøver. Sunde NLR_Kontrolprøver blev ikke sammenlignet, da deres ekspressionsniveauer overlappede med NLR_Høj og NLR_lave patientprøver i både hele transkriptomet og signifikant differentielt udtrykte gensæt. Derudover blev de raske NLR_kontrolprøver ikke matchet med hensyn til alder, sygdom og kirurgisk tilstand (supplerende figur 1 og 2). I både neutrofiler (tabel 2) og lymfocytter (tabel 2) viste dataene, at ekspressionen af ​​gensæt relateret til immunsystemet var meget signifikant forskellig, når NLR_Høj blev sammenlignet med NLR_lav . På RNA-seq har hver celletype de samme resultater som den anden celletype. I begge paneler maksimeredes signifikansniveauer af de store gensæt ved P < 1E-24. Disse data var meget signifikante, uanset om neutrofilen eller lymfocytten blev undersøgt. For at fokusere på det meget signifikante indholdsområde i denne RNA-seq undersøgelse blev signifikant differentielt udtrykt immunoglobulingenekspression undersøgt. For det første viste et hovedkomponentanalyseplot af neutrofilgenerne, at for NLR_Høj vs NLR_Lav blev de signifikant differentielt udtrykte immunoglobulingener adskilt i 2 grupper (supplerende figur 3A). Alternativt overlappede lymfocytgener af NLR_Høj vs NLR_Lav (supplerende figur 3A). Dernæst blev et kombineret varmekort over immunrelateret genekspression mellem NLR_Høj med NLR_Lav sammenlignet i neutrofiler og lymfocytter (figur 5). Overordnet set, når hele varmekortet undersøges, er der tydelig nedregulering af hele genfamilien af ​​immunoglobulingener i den neutrofile NLR_Høj gruppe sammenlignet med den for NLR_Lav. De fleste gener (69/156, 44%) var immunoglobulinrelaterede. Kun 12 af 156 (7,7%) gener var komplement-relaterede: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD og CD59. I lymfocytgruppen var der også nedregulering af hovedsagelig immunoglobulingener i NLR_Høj kategori.

Komplementgensæt i neutrofiler og lymfocytter er beskrevet detaljeret i tabel 3. I både neutrofiler (tabel 3) og lymfocytter (tabel 3) var ekspressionen af ​​gener i 3 gensæt relateret til komplementsystemet meget signifikant forskellige (P < 1E{{ 5}}), når NLR_Høje stikprøver blev sammenlignet med NLR_lave stikprøver. Denne observation var den samme, uanset om sammenligningen var mellem RNA fra neutrofiler eller lymfocytter. De 3 gensæt inkluderer komplementaktivering, komplementaktivering klassisk vej og regulering af komplementaktivering. Et hovedkomponentanalyseplot af de neutrofile gener viste igen, at for NLR_Høj vs NLR_Lav blev de signifikant differentielt udtrykte komplementgener adskilt i 2 grupper (supplerende figur 3B). Alternativt overlapper lymfocytgenerne af NLR_Høj vs NLR_Lav (supplerende figur 3B).

Figur 5. Varmekort over signifikant differentielt udtrykte gener i immunglobulingensættet i neutrofiler (venstre) og lymfocytter (højre). De gener, der er anført til højre for hvert varmekort, er medlemmer af immunoglobulinet

Et varmekort over neutrofiler og lymfocytekspression af et komplement-relateret gensæt, der sammenligner NLR_Høj med NLR_Lav er vist i figur 6. I neutrofilerne blev et enormt antal gener nedreguleret i NLR_Høj befolkning. I dette gensæt, svarende til immunoglobulingensættene, var de fleste gener (69/ 86, 80%) immunoglobulin-relaterede. Kun 12 af 86 (14 %) var komplementkomponent- og regulatorgener (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH og CFD). I lymfocytgruppen generelt var der færre udtryk af komplementgener, og immunoglobulingener var lidt mere nedregulerede i NLR_Høj-gruppen. Fordi der er en større forståelse af generne i komplementsystemet sammenlignet med generne i immunoglobulinsystemerne, blev opmærksomheden fokuseret på komplementsystemet som en potentiel kandidat for målgener relateret til høj og lav NLR. Et sammensat varmekort, der sammenligner NLR_Høj med NLR_Lav, der viser ekspressionen af ​​komplementsystemet og relaterede gener i både neutrofil- og lymfocytprøver (figur 7). For det meste er lymfocytten ikke et reservoircellesystem for komplementsystemet. De fleste komplementgener er ikke opreguleret i lymfocytter. Kun C1S, CR2, C5, C8G, C5 og CFB var til stede med en forskel i ekspression mellem NLR_Høj og NLR_lave lymfocytter (figur 7). CD81 i lymfocytter er et B-celle tetraspanin. C1S- og C8G-ekspressioner ser ud til at være signifikant højere i lymfocyt-NLR_Høj end dem for lymfocyt-NLR_Lavt, svarende til KLKB1, genet for plasma-prekallikrein.

I neutrofiler viste NLR_Høj derimod nedregulering af komplementkomponentgener C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 og C3AR1 og deres komplementregulatoriske (hæmmende) gener CD59, CFB og CFI . Kun C2- og CFD-gener blev opreguleret i NLR_Høj_N-patienter. CD59 og C9 er relativt opreguleret i neutrofil NLR_Lav_N sammenlignet med dem i NLR_Høj_N. FGFR4 er en vækstfaktorreceptor. CFH var til stede, men syntes ikke at være påvirket af neutrofil NLR_Høj eller NLR_Lav. Det er mere udtrykt i lymfocytter.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Diskussion

NLR på det differentielle leukocyttal er blevet en meget brugt, simpel markør til at genkende potentielle skadelige udfald i en lang række lidelser, herunder CVD, solide tumorer og inflammatoriske lidelser såsom systemisk lupus erythematosus og systemisk sklerose. I vores egne retrospektive undersøgelser af patienter med aterosklerotisk CVD observerede vi, at patienter med en høj NLR har en højere sendødelighed efter elektiv reparation af aortaaneurisme, en højere sene slagtilfælde/dødsrate efter profylaktisk carotis-endarterektomi og en nedsat amputationsfri overlevelse efter elektiv femoral-popliteal revaskularisering, hvis deres NLR er forhøjet.14-16 De nuværende undersøgelser blev indledt for at finde et mekanistisk grundlag for høj NLR. lymfom, multiple solide tumorer og inflammatoriske lidelser såsom systemisk lupus erythematosus og systemisk sklerose. I vores egne retrospektive undersøgelser af patienter med aterosklerotisk CVD observerede vi, at patienter med en høj NLR har en højere sendødelighed efter elektiv reparation af aortaaneurisme, en højere sene slagtilfælde/dødsrate efter profylaktisk carotis-endarterektomi og en nedsat amputationsfri overlevelse efter elektiv femoral-popliteal revaskularisering, hvis deres NLR er forhøjet.14-16 De nuværende undersøgelser blev indledt for at finde et mekanistisk grundlag for høj NLR.

Tabel 3. Komplement gensæt i neutrofiler og lymfocytter

For at udvikle en uvildig tilgang til mekanismen/mekanismerne for differentielle virkninger af NLR på CV-resultater udførte vi RNA-seq på både neutrofiler og lymfocytter fra de samme patienter. Til denne undersøgelse blev alle patienter med aortasygdom prospektivt samlet og grupperet i NLR-kategorier efter deres resultater. De sidste 6 prøver i hver af de 2 celletyper blev udvalgt efter det højeste niveau af deres RIN i det forberedte RNA fra de parrede neutrofile og lymfocytprøver uden hensyntagen til køn, alder eller tidligere medicinske tilstande. Som det kan ses i tabel 1, var patienterne i NLR_Høj og NLR_lave grupper ret ens og skelnes kun af deres NLR.

Kvaliteten af ​​det RNA, der blev brugt i denne undersøgelse, er vist af RIN og den fuldstændige adskillelse af genekspressionsmønsteret mellem neutrofiler og lymfocytter i alle indsamlede patientgrupper (høj NLR, lav NLR og kontroller) (figur 1). Et plot af hovedkomponentanalyse viser, at NLR_kontroldata var irrelevante i denne undersøgelse, fordi patienternes NLR overlappede med NLR_Høj og NLR_lav i patienternes neutrofil- og lymfocytpopulationer . GSEA-analysen gav stor indsigt i, hvilke gensæt der blev beriget i GO-gensættene af biologiske processer, og scatter-boble-plottet viste tydeligt dette ved at plotte log-signifikansen mod forholdet mellem antallet af gener ændret over det samlede antal gener i gensættene. Når de blev gennemgået, var de gensæt, der adskiller sig fra hele listen, dem i humoral (immunoglobulin) immunitet og komplementsystem (tabel 2 og 3) baseret på forhold og statistisk signifikans i en upartisk opdagelsestilgang.

Det store antal involverede humorale immunitetsimmunoglobulingener er vanskeligt at arbejde med, fordi vigtige forskelle mellem disse gener ikke er velkendte. Alternativt ved man meget mere om komplementsystemet, og fokus på det klassiske komplementsystem, der aktiveres af immunglobulin, er et genkendeligt mål for inflammation og sygdom relateret til immunglobuliner. Vores data tyder på, at de klassiske komplementkomponentgener C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 og flere regulatoriske gener (CD59, CFB CFI og CFH) er nedreguleret i neutrofiler hos patienter med høj NLR (figur 7). Disse resultater er slående af 3 grunde. For det første er de involverede gener dem, der for det meste hører til den klassiske komplementvej. For det andet er disse komplementgener hos patienter med høj NLR for det meste nedreguleret sammenlignet med patienter med lav NLR. Til sidst udtrykkes mere F12 i neutrofiler fra NLR_Høj end dem fra NLR_lave prøver. Enzymatiske former af proteinproduktet af F12 (faktor XII [FXII]) aktiverer den klassiske vej for komplement og neutrofiler.20 I modsætning hertil er PLG, genet for plasminogen og aktivator af FXII, nedreguleret i lymfocytter og neutrofiler fra patienter inden for NLR{ {21}}Høj, hvilket tyder på, at FXII-aktivering i sig selv kan være en regulator af komplementaktivering.

Derudover har det vist sig, at det klassiske komplementsystem er involveret i accelereret CVD. Komplementkomponent 1q (C1q) er den initiale faktor for komplementbanen, som har en vigtig rolle i både det medfødte og erhvervede immunsystem.21 C1q har vist sig at have dobbeltroller, positive og negative effekter på åreforkalkning.22 I den klassiske komplement-vej, C1q har en beskyttende rolle i tidlig aterosklerose ved at regulere makrofag molekylært signal gennem en komplement-uafhængig vej, modulere optagelsen af ​​atherogent lipoprotein, mediere apoptotiske celler og eliminering af cellerester.23,24 En nylig undersøgelse af Jia et al23 indikerer, at reduceret serum C1q er forbundet med CAD. En anden undersøgelse af Guo et al24 indikerer, at øget C1q-aktivitet er forbundet med CAD. Endelig tyder nyere undersøgelser på, at patienter med diabetes med nedsat C1q har forkortet overlevelse.25 Disse data indikerer, at undersøgelse af komplementsystemet kan være vigtig for at forstå den inflammationsmedierede patogenese af CVD.

Figur 6. Varmekort over signifikant differentielt udtrykte gener i komplementgensættet i neutrofiler (til venstre) og lymfocytter (til højre). Generne anført til højre for hvert varmekort er medlemmer af komplementgensættet. RNA'et er fra neutrofiler eller lymfocytter indsamlet fra patienter med høj (NLR_Høj) eller lav (NLR_Lav) NLR. Seks individuelle prøver fra NLR_Høj sammenlignes med 6 individuelle prøver fra NLR_Lav fra både neutrofiler og lymfocytter.

Figur 7. Sammensat varmekort over komplement og relaterede gener fra neutrofil eller lymfocyt NLR_Høj eller NLR_Lav. I hver kategori blev det sammensatte varmekort udarbejdet ud fra 6 individuelle RNA-seq prøver fra hver celletype.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Selvom lipidsænkning ikke havde nogen indvirkning på NLR, sænkede anti-inflammatorisk behandling med canakinumab, en interleukin 1-hæmmer NLR (P < 0,0001).26 Disse data tyder på, at NLR kan være en markør for hjerte-kar-sygdomme uafhængig af lipider og indflydelse af statiner. Denne ad hoc-analyse af flere prospektive randomiserede forsøg tyder på, at NLR kan være en uafhængig risikofaktor for dødelighed i CVD.

Der er nogle begrænsninger i denne undersøgelse. Vores neutrofilpræparater havde 4 % lymfocyt- og 2 % monocytkontamination ved flowcytometri. Fordi neutrofilerne ikke er kendt for at syntetisere immunoglobulin, kan ændringerne i neutrofilimmunoglobingenet være fra kontaminerende B-celler. På EPIC-analysen var der en signifikant stigning i B-cellekontamineringen af ​​NLR-Low prøverne. Denne observation tyder på, at en stigning i niveauet af immunoglobulingener i NLR_Lavt neutrofile prøver kan opstå fra B-cellekontamination. Således kan reducerede immunoglobulingener i NLR_Høje prøver skyldes øgede B-celler i NLR_lave prøver og ikke nødvendigvis reducerede immunoglobulingenniveauer i NLR_høje prøver. Ligeledes vides neutrofiler ikke at være komplementproducerende celler. To procent kontaminering med monocytter kunne være kilden til komplementgenerne. Ved hjælp af RNA-seq-dataene observerede vi imidlertid, at der ikke er nogen signifikant forskel i monocytkontamination af neutrofilpræparaterne mellem NLR_Lav og NLR_Høj. Ydermere viser udførelse af en EPIC-analyse af RNA-seq-dataene, at monocytkontamination var<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Sammenfattende er hovedfundet i denne undersøgelse, at i høje NLR-tilstande er mange komplementerende komponentgener og nogle af deres regulatorer nedreguleret i neutrofiler. Det er uklart med hensyn til den overordnede betydning og aktiveringstilstand af de identificerede nedregulerede komplementgener. Fordi komplementgensættene er slående reduceret, spekulerer vi i, at personer med NLR_Høj og forkortet postoperativ overlevelse har et tab af vigtige CV-beskyttende mekanismer leveret af komplementsystemerne. Denne vurdering skal undersøges prospektivt i kliniske undersøgelser for den eller de underliggende mekanismer for dette resultat.

Referencer

1. Ross R. Aterosklerose – en inflammatorisk sygdom. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

2. Getz GS. Tematisk gennemgangsserie: immunsystemet og aterogenese. Immunfunktion i aterogenese. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Immunsystemet ved åreforkalkning. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.

4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. Nytten af ​​et forhøjet neutrofil-lymfocytforhold til at forudsige langtidsdødelighed efter perkutan koronar intervention. Am J Cardiol. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Forbindelse mellem indlæggelse neutrofil til lymfocyt ratio og resultater hos patienter med akut koronar syndrom. Am J Cardiol. 2008;102(6):653-657.

6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH, et al. Præoperativ neutrofil-lymfocyt-forhold og resultat fra koronararterie-bypass-transplantation. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik T, Balta S, et al. Sammenlignende virkninger af nebivolol og metoprolol på røde blodlegemers distributionsbredde og neutrofil/lymfocytforhold hos patienter med nyligt diagnosticeret essentiel hypertension. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.

8. Karaman M, Balta S, Ay SA, et al. De sammenlignende virkninger af valsartan og amlodipin på vWf-niveauer og N/L-forhold hos patienter med nyligt diagnosticeret hypertension. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, et al. Anvendelighed af neutrofil til lymfocytforhold til at forudsige langsigtede resultater ved akut dekompenseret hjertesvigt. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-438.

10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. Neutrofil lymfocytforhold i perifer vaskulær sygdom: en gennemgang. Ekspert Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. Neutrofil-lymfocytforhold forudsiger overlevelse på mellemlang sigt efter elektiv større vaskulær kirurgi: en tværsnitsundersøgelse. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. Neutrofil til lymfocyt-forhold forudsiger perioperativ mortalitet efter åben elektiv reparation af abdominale aortaaneurismer. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. Neutrofil-lymfocytforhold forudsiger sygdommens sværhedsgrad og udfald efter underekstremitetsprocedurer. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.

14. King AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. Forhøjet neutrofil-lymfocytforhold forudsiger dødelighed efter elektiv endovaskulær aneurismereparation. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.

15. King AH, Kim AH, Kwan S, et al. Et forhøjet neutrofil-til-lymfocyt-forhold er forbundet med dårligere resultater efter carotis-endarterektomi hos asymptomatiske patienter. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.

16. King AH, Kwan S, Schmaier AH, et al. Et forhøjet neutrofil-til-lymfocyt-forhold er forbundet med nedsat amputationsfri overlevelse efter femoropopliteal perkutan revaskularisering. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Samtidig opregning af cancer- og immuncelletyper fra bulk tumorgenekspressionsdata. Elife. 2017;6:e26476.

18. Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Differentiel gen- og transkriptekspressionsanalyse af RNA-seq eksperimenter med TopHat og manchetknapper. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.

19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Celletypespecifikke genekspressionsprofiler af leukocytter i humant perifert blod. BMC Genomics. 2006;7:115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL, et al. Faktor XII og uPAR opregulerer neutrofile funktioner for at påvirke sårheling. J Clin Invest. 2018;128(3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, Sang-VM. Komplement og dets rolle i medfødte og adaptive immunresponser. Cell Res. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Komplement i åreforkalkning: ven eller fjende? J Thromb Haemost. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Y, Wen W, Yang Y, et al. Den kliniske rolle af kombineret serum C1q og hsCRP i forudsigelse af koronararteriesygdom. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Serumkomplement C1q-aktivitet er forbundet med obstruktiv koronararteriesygdom. Front Cardiovasc Med. 2021;8:618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A, et al. Nytten af ​​komplement C1q til at forudsige 10-års dødelighed hos mænd med diabetes mellitus henvist til koronar angiografi. Am J Cardiol. 2018;122(1):33-38.

26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM, et al. Neutrofil-lymfocytforholdet og hændelige aterosklerotiske hændelser: analyser fra fem nutidige randomiserede forsøg. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.