Entydig NMR-strukturbestemmelse af (plus)-catechin-laccase dimeriske reaktionsprodukter som potentielle markører for drue- og vinoxidation

For flere detaljer, kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt:( plus )-Catechin—laccaseoxidationdimere standarder blev hemi-syntetiseret under anvendelse af laccase fra Trametes. Versicolor er en vand-ethanol-opløsning ved pH 3,6. Otte fraktioner svarende til otte potentielle dimere oxidationsprodukter blev påvist. Fraktionsprofilerne blev sammenlignet med profiler opnået med to andre oxidoreduktaser:polyphenoloxidaseudvundet af druer og laccase fra Botrytis cinerea. Profilerne var meget ens, selvom nogle mindre forskelle antydede mulige uligheder i reaktiviteten af ​​disse enzymer. Fem fraktioner blev derefter isoleret og analyseret ved 1D og 2D NMR spektroskopi. Tilsætningen af ​​spor af cadmiumnitrat i prøverne opløst i acetone førte til fuldt opløste NMR-signaler af phenoliske protoner, hvilket muliggjorde en utvetydig strukturel bestemmelse af seks reaktionsprodukter, en af ​​fraktionerne indeholdende to enantiomerer. Disse produkter kan yderligere bruges som oxidationsmarkører til at undersøge deres tilstedeværelse og udvikling i vin under vinfremstilling og vinlagring.

Nøgleord: oxidationsmarkør;( plus )-catechin; phenoliske NMR-signaler; laccase; cadmiumnitrat; polyphenoloxidase

Klik for at få flere oplysninger

1. Introduktion

Polyfenolerer en familie af kemiske forbindelser, der er udbredt i naturen. De findes i betydelige mængder i te [1], kakao [2,3], blåbær [4], druer [5l og gærede produkter som vin [6]. Da de er primære oxidationsmål J7,8], udvikler polyfenolers kemiske strukturer sig konstant. Disse ændringer påvirker de organoleptiske egenskaber af mange typer fødevarer; de er ansvarlige for fænomener som bruning af mad [9] og modifikationer af vins sensoriske egenskaber [10,11. I enologi finder dette oxidationsfænomen sted i druer eller vine. Med hensyn til enzymatisk oxidation er de vigtigste enzymer, der er ansvarlige for brunfarvning, oxidoreduktaser, mere præcist,polyphenoloxidasefindes i druer og laccase produceret af Botrytis cinerea [12].

Enzymatiskoxidationforekommer hovedsageligt i druemost, men yderligere vinbruning kan skyldes kemiske oxidationsreaktioner |7,13]eller Botrytis cinerea laccase, der kan være meget stabil under vinlagring14. To enzymatiske oxidationsaktiviteter kan forekomme på phenoliske substrater: monophenoloxidaseaktivitet karakteriseret ved hydroxylering af en eksisterende hydroxylgruppe tilstødende position og diphenoloxidaseaktivitet svarende til oxidationen af ​​ortho-dihydroxybenzener til ortho-benzoquinoner.

Ifølge Nomenklaturkomiteen for International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) katalyseres disse enzymatiske aktiviteter af EC-1-klasse-enzymer svarende til oxidoreduktaser. Blandt dem er de tre hovedklasser af oxidoreduktaser, der katalyserer polyphenoloxidation, EC1.14.18.1 (monophenolmonooxygenase), EC1.11.1 (peroxidase/POD) og EC1.10.3 (oxidoreduktaser, der virker på diphenoler).

Denne sidste klasse er opdelt i forskellige underklasser, og to af dem virkede særligt interessante for denne undersøgelse: EC1.10.3.1 (polyphenoloxidase/PPO) og EC1.10.3.2 (laccase) (Se Supplerende Materialer Figur S1).

PPO, laccase og peroxidase er de oxidoreduktaser, der hovedsageligt er ansvarlige for brunfarvning under forarbejdning af druer [13]. Brunfarvning forårsaget af POD er ​​ubetydelig i frugter, men kan øge phenolnedbrydningen i kombination med PPO[15]. PPO er naturligt til stede i druer og er i stand til at katalysere oxidationen af ​​monophenoler til katekoler og af katekoler til brune pigmenter [8,13,16]. Laccaser, der forekommer i Botrytis-inficerede druer, har et bredere virkningsspektrum|17|da de kan katalysere oxidationen af ​​mange forskellige substrater. De vigtigste laccasers oxidationsmål forbliver 1-2 og 1-4 dihydroxybenzen.

I vin kan benzoquinon fremstillet ved oxidation (PPO eller laccaser) let gennemgå yderligere reaktioner afhængigt af deres redoxegenskaber og elektroniske affiniteter [15]. De kan enten fungere som elektrofiler og reagere med aminoderivater [18] eller fungere som oxidanter og reagere blandt andet med phenoliske substrater. Afhængigt af deres kemiske konformation (quinon eller semi-quinon), kan benzoquinon føre til forskellige oxidationsreaktionsprodukter. Ved en neutral pH vil (plus)-catechin blive oxideret til quinon på A-ring position C5 eller C7 og føre til dannelsen af ​​seks mulige dimere isomerer, hvilket indebærer en binding mellem B-ring position C2', C5' eller C6' på den øvre catechin-enhed og A-ringens position C6 eller C8 på den nederste enhed [19,20]. Dehydrodicatechin er et velkendt produkt af denne kobling [21]. Mærkningspositionerne for strukturerne er vist i figur 1. Under sure forhold kan semi-quinonformer også være til stede på B-ringen (position OH3'eller OH4') og føre til fire mulige dimere isomerer [20,22] med den øvre katekinenhed og A-ringen på den nederste enhed (position C6 eller C8). Enzymatisk oxidation af catechin blev undersøgt i tidligere undersøgelser [22,23], og de associerede oxidationsprodukter blev karakteriseret ved HPLC [24], dog mere sjældent isoleret og aldrig fuldstændig karakteriseret ved NMR.

Formålet med dette arbejde var først ved UHPLC-MS at sammenligne profilerne for dimere( plus )-catechinoxidationsprodukter i nærværelse af tre oxidoreduktaseekstrakter, dvs. PPO ekstraheret fra druer, laccase fra svampen Botrytis cinerea, der findes i botrytiserede søde vine [14] og laccase fra Trametes Versicolor.

Det andet formål var at hemisyntetisere og karakterisere strukturerne af nogle dimere oxidationsprodukter ved NMR-spektroskopi opnået med laccase fra Trametes Versicolor.

2. Resultater og diskussion

2.1. Sammenligning af dimeriske reaktionsprodukters profiler med tre forskellige oxydoreduktaser og(plus)-katekin

(plus)-Catechin blev først oxideret i nærværelse af laccase fra Trametes Versicolor ved pH3,6 i modelvinopløsningen. Efter adskillelse af den dimere fraktion fra resterende (plus)-catechin og andre polymerfraktioner blev otte hovedfraktioner opsamlet og analyseret ved UHPLC-UV-MS, noteret fra N1 til N8 i stigende retentionstid (tabel 1). Elektrospraymassespektrene i positiv modus viste iontoppe [M plus H] plus ved m/z 579 for N1 til N6, hypotetisk svarende til en dimer dannet af en enkeltbinding mellem to catechin-enheder, og [M plus H] plus ved m/577 for N7 og N8, hvilket hypotetisk antyder dannelsen af ​​en yderligere binding.

Disse otteoxidationfraktioner blev potentielt observeret efter den kemiske depolymerisering af en tanninfraktion i tidligere værker [25,26] og kunne muligvis være de samme som dem, der allerede er beskrevet af Guyot et al. [20], selvom de eksperimentelle forhold var lidt anderledes. Faktisk blev der i denne tidligere undersøgelse anvendt en rå PPO-ekstrakt ved pH 3 og 6 for at opnå otte fraktioner. I nærværende undersøgelse blev tre forskellige enzymer sammenlignet ved pH3,6 i modelvinopløsningen. Den komparative LC-MS-analyse af de vigtigste oxidationsfraktioner opnået med de tre forskellige enzymer (laccase fra Trametes Versicolor, lac-case fra Botrytis cinerea og polyphenoloxidase ekstraheret fra druer) er vist i tabel 2. For hver af de otte fraktioner, retentionstiderne var næsten identiske med de forskellige enzymer, og lignende m/z blev bestemt med MS-analysen. Disse resultater understøtter hypotesen om, at de samme fraktioner blev opnået for hvert enzym, indeholdende produkter med strukturer svarende til de hypoteser, Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano og Ros Barcel6 [27] udførte også en sammenlignende undersøgelse af (plus)-catechin-oxidationsprodukter med to forskellige enzymer: peroxidase og polyphenoloxidase, begge ekstraheret fra jordbær. De konkluderede, at produkterne opnået med de to enzymer var kvalitativt ens. En yderligere forbindelse ved navn N4' med m/z=578 Th og Rt=15.66 min blev observeret i forsøg med laccase fra Botrytis cinerea og ekstraheret PPO, men ikke med laccase fra Trametes Versicolor, hvilket tyder på mulige forskelle i reaktivitet for disse enzymer.

2.2. Undersøgelse og optimering af fysisk-kemiske parametre på 1H-NMR phenoliske og alifatiske OH-signaler

Den strukturelle karakterisering af procyanidindimerer kan opnås ved NMR-analyse. Især kan den præcise koblingsposition mellem enheder bestemmes ved hjælp af HMBC- og/eller ROESY-korrelationsspektre [28,29] (figur S2 og S3). I tilfælde af en ether-type(COC)-binding er tilskrivningen af ​​hydroxylsignalprotonerne nødvendig. Det kan også være afgørende i tilfælde af CC-bindinger, hvis nogle alifatiske eller aromatiske protoner overlapper, eller hvis nogle nøglekorrelationer mangler. Men selv i et aprotisk opløsningsmiddel optræder polyphenolernes hydroxylprotoner ofte som brede signaler, hvorfra der ikke kan opnås strukturel information [30]. Dette problem blev foreløbigt løst ved tilføjelse af spor af

Cd(NO3)2 i prøveopløsningerne. Faktisk skyldes 'H brede signaler fra OH-grupper den intermolekylære udveksling mellem disse OH-protoner og andre protoner i opløsningsmidlet eller det opløste stof. Ved at reducere intermolekylære bindinger kan tilstedeværelsen af ​​cadmiumnitrat i prøverne reducere disse udvekslinger og dermed forbedre skarpheden af ​​OH-protonsignaler.

2.2.1.Effekt af cadmiumtilsætning

Efter frysetørring blev de fem fraktioner N2, N3, N4, N6 og N8 solubiliseret i acetone-dg. Derefter blev 1D proton NMR-spektre erhvervet ved 25 grader før (figur 2A) og efter tilsætning af små mængder cadmium (figur 2B). I ren acetone-d. optrådte de phenoliske OH-protoner af alle fraktioner som brede toppe. Efter tilsætning af cadmium viste disse protoner højopløste signaler for fraktionerne N6 og N8, hvorimod for fraktionerne N2, N3 og N4 var signalerne kun lidt skarpere. Det skal også nævnes, at forøgelse af Cd-indholdet ikke havde nogen effekt på OH-signalopløsning, da der ikke blev observeret nogen skarphed eller bredhed af spidsliniebredden, når successive små mængder Cd blev tilsat til prøverne (data ikke vist).

Højt opløste phenoliske OH-signaler fra produkter N2, N3 og N4 blev opnået takket være yderligere tørring og resolubilisering (figur 2C, D).

Forskellen i adfærd ved Cd-tilsætning mellem fraktionerne kan forklares ved styrken af ​​molekylære interaktioner: stærkere i tilfælde af N2, N3 og N4 sammenlignet med N6 og N8, et yderligere trin er nødvendigt for at bryde disse bindinger.

Dette yderligere trin kan være nøgletrinet, når man bruger Cd til at opnå højt opløste phenoliske OH-signaler i enhver situation, uanset oprindelsen af ​​prøverne, syntesereaktionen eller de naturlige polyphenoliske produkter.

Et tidligere værk, der omhandler den entydige strukturelle karakterisering afpolyphenoldimerer ved hjælp af højt opløste OH-phenoliske NMR-signaler takket være tilsætning af cadmiumnitrat blev offentliggjort i 1996[30]. Så vidt vi ved, er der ikke publiceret noget andet forskningspapir, der bruger denne metode siden da. Andre undersøgelser blev efterfølgende foretaget for at nå dette mål, enten ved picrinsyredoserede tilsætninger [31] eller ved at bruge en lav optagelsestemperatur [32]. Dette kan forklares med det yderligere trin, der er nødvendigt for at få en afgørende effekt på OH-topskarphed med Cd-tilsætning, som beskrevet ovenfor. Imidlertid ser cadmium ud til at være af stor værdi, da højt opløste signaler kan opnås uden behov for at tilføje præcise mængder, i modsætning til picrinsyre eller NMR-spektra-opsamling ved lave temperaturer.

2.2.2. Temperaturens indvirkning

Et fald i temperaturen fra 25 grader C til 15 grader havde ingen indflydelse på skarpheden af ​​phenoliske OH- eller alifatiske OH-signaler. Ikke desto mindre tillod nedadgående skift af udskiftelige protontoppe os at adskille nogle overlappende phenoliske og alifatiske OH-signaler, hvilket gjorde deres identifikation mere indlysende (figur 3). Ved at sænke temperaturen blev protonudvekslingshastigheden reduceret, og man kunne forvente skarpere alifatiske OH-toppe [31]. Temperaturen på 15 grader er åbenbart ikke lav nok til at opnå velopløste alifatiske OH-signaler. Det tillod os imidlertid klart at identificere resonansen af ​​to alifatiske OH-protoner i prøver N3 og N6 og af en i prøve N8. Spektret af prøve N2 udviste også to OH alifatiske protonsignaler, som var mere skelnelige ved 25 grader C end ved 15 grader (figur 2E). I tilfældet med prøven N4 var signalerne fra alifatisk OH kun delvist synlige i spektre, uanset om temperaturen var sat til 25 grader eller til 15 grader C, på grund af vedvarende overlapning (figur 2E).

2.3. Strukturel karakterisering af de dimeriske standarder - NMR-spektrumanalyse

NMR-spektrene for fraktionerne N2, N3, N4, N6 og N8 viste, at oxidationsprodukterne var af høj renhed, eftersom signalintensiteterne af andre påviste forbindelser var mindre end 10 procent sammenlignet med disse produkters.

I alle spektre kan der skelnes mellem fire lH-kemiske skiftregioner, der er typiske for catechin-enheder (figur 2C): signaler fra de alifatiske protoner af pyranringe (C-ringe) findes i området fra 2,3 til 5.0 ppm, og de aromatiske signalprotoner fra resorcinolringe (A-ringe) og catecholringe (Bringer) fra henholdsvis 5,5 til 6,3 ppm og 6,3 til 7,1 ppm. OH-phenolsignalerne for både A- og B-ringe viste sig fra 7,1 til 10 ppm. NMR-spektrene for begge fraktioner viste tilstedeværelsen af ​​distinkte signalsæt af catechin-enheder i et konstant intensitetsforhold: to sæt signaler blev observeret i spektrene for fraktionerne N2, N3, N6 og N8 i overensstemmelse med tilstedeværelsen af ​​dimerer, og fire sæt i N4-spektrene, som kan svare til én tetramer, to dimerer eller en blanding af forskellige oligomerer, det vil sige én trimer plus én monomer. For at bestemme graden af ​​oligomerisering af produkterne til stede i fraktion N4 blev et 'H DOSY eksperiment udført under anvendelse af en blanding indeholdende alikvoter af både fraktion N4 og N2. Diffusionskoefficienterne for alle signaler viste lignende værdier (figur 4), hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​to dimerer af catechin i fraktion N4.

Takket være de fuldt opløste OH-phenol-signaler, som giver pålidelige kvantitative resultater, kan typen af ​​kobling mellem catechin-enhederne udledes direkte fra peak-overfladearealintegration. For begge fraktioner, N3 og N6, indikerede manglen på én OHphenol (der enten tilhører resorcinol eller en katekolring) og manglen på én aromatisk resorcinol-proton en interflavanisk binding (IFL) af ethertypen, hvilket indebærer en opposition i et A eller B-ring og en C6- eller C8-position i en A-ring. I tilfælde af prøve N2 manglede to aromatiske protoner, en af ​​en B-ring og en af ​​en A-ring, hvilket indebærer en CA-CB IFL. 1D 'H-spektret af fraktion N4 viste, at to protoner af B-ringen manglede, såvel som to protoner af A-ringen. Bindingerne mellem dimerenhederne i fraktion N4 er således begge CC-typer. Spektrene for fraktion N8 var ret forskellige fra de fire andre. Nogle signaler var typiske for catechin-enheder, hvor tre OH-phenoler, en aromatisk A-ring og en B-ringprotoner manglede, samt en alifatisk OH. På den anden side er nogle andre NMR-signaler atypiske for en catechin-enhed: methylen med afblindede 13C kemiske skift (~40 ppm) og en ketongruppe (~192 ppm).

Protonspinsystemerne af C-, A- og B-ringe blev bestemt ved anvendelse af både 'H 1D- og 1H 2D TOCSY-spektre (ikke vist). To ABMX C-ring spin-systemer (typisk for catechin) blev observeret i spektrene for fraktion N2, N3, N6 og N8, og fire for fraktion N4. I spektrene af fraktionerne N2, N3, N6 og N8 blev to metakoblede dubletter (J~2Hz) og en enkelt i den aromatiske A-ringregion tildelt henholdsvis A-ringprotonerne i den ikke-bundne catechin-enhed og til A-ringens restproton af den af ​​C6-eller C8-forbundne catechin-enhed. I spektrene af N4, på grund af tilstedeværelsen af ​​to dimerer, blev fire metakoblede dubletter og to singletter påvist og tildelt som beskrevet ovenfor. B-ringprotonsystemerne blev også let bestemt ud fra disse spektre og gjorde det muligt for os at identificere to ABM protonspinsystemer for dimererne af fraktionerne N3 og N6, hvorimod et ABM og et AB protonspinsystem blev påvist for dimer N2, og et ABM og et one AM proton spin-systemer til dimer N4. Dimeren N8 udviste kun ét ABM B-rings spin-system, der er typisk for en catechinmonomer.

2.3.1. Bestemmelse af A-ringpositionen af ​​IFL for dimererne af fraktion N2, N3, N4 og N6

Etableringen af ​​broen placeret på A-ringen af ​​dimerer (dvs. C6A- eller C8A-position) kræver tilskrivning af den resterende HA-proton af den CA-koblede catechin-enhed. Takket være de højt opløste phenoliske OH-signaler var et let udgangspunkt identifikationen af ​​de to OHphenol-protoner i de A-ringforbundne enheder, dvs. A-ringen, der

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm） som let kunne henføres til henholdsvis C7A og C8A. Når først C6A og C8A er tildelt, kan den resterende HA-proton direkte tilskrives HSQC-spektrene. Det blev således fundet, at denne resterende HA-proton var H6A for alle fraktioner N2, N3, N4, N6. IFL mellem catechin-enheder indebar således en C8A-position for alle dimerer.

2.3.2. Bestemmelse af B-ringens position for IFL

Dimerer af fraktionerne N2 og N4. Spektrene for fraktion N2 viste to forskellige typer B-ring protonspinsystemer: en AMX svarende til B-ringen af ​​den ikke-forbundne enhed og en AM med en koblingskonstant på ca. 8 Hz, karakteristisk for H6'B og H5' B af en C2'B-forbundet enhed. Forbindelsen mellem enhederne af N2-dimeren er således C2'B-C8A. NMR-spektrene for fraktion N4 viste også forskellige B-spinsystemer: to AMX, svarende til den ikke-forbundne B-ring, og to AXspin-systemer, der begge viser koblingskonstanter på ca. 2 Hz, som er karakteristiske for H2'B og H6' B-protoner af C5'B-forbundne enheder. Tilstedeværelsen af ​​langtrækkende'H/13C-korrelationer mellem H6'Band C8A, som blev observeret i HMBC-spektrene af de to dimerer, er i overensstemmelse med en C5/'B-C8A-binding (figur 5).

Dimerer af fraktion N3 og N6. Spektrene for fraktionerne N3 og N6 viste tilstedeværelsen af ​​to AMX B-ring protonsystemer og manglen på et OH-phenolsignal. Da alle OHA-phenol-protonerne i dimerenhederne blev identificeret (som beskrevet ovenfor), kan det manglende OH-phenoliske signal enten være det for OH3'B eller det for OH4'B.

OH-positionen (3'B eller 4'B) kan let bestemmes gennem ROE-korrelationer med henholdsvis H2'Bor H5'B eller ved at bruge HMBC-korrelationer med lang rækkevidde som illustreret i figur 5.

Tilskrivningen af ​​den resterende OH af B-ringene blev let udført under anvendelse af enten langrækkende HMBC- eller ROESY-korrelationer, som illustreret i figur 5. I tilfælde af dimer N3 blev der observeret en ROE-korrelation mellem H5'B og den resterende OH 'B af katekinenheden forbundet gennem dens B-ring. Denne OH blev således identificeret som OH4'B. I tilfælde af fraktion N6 blev den resterende OH'B tildelt OH3'B, eftersom en ROE-korrelation blev observeret mellem denne OH og H2'B. Langrækkende HMBC-korrelationer er i overensstemmelse med disse tilskrivninger. Bindingspositionerne af disse to dimerer blev derefter bestemt som følger: CO3'B-C8A og CO4'B-C8A for N3 og N6. henholdsvis.

Fraktion N8. Spektrumanalyse af dimeren N8 viste, at en enhed af denne dimer er catechinet med to bindingspositioner, en A-ringen, en ved C8A og den anden ved C-O7A-positionen, da protonerne H8A og OH7A er mangler. Den anden enhed af denne dimer udviste enestående spektrale træk, hvilket indikerer tabet af B-ringens aromaticitet og tilstedeværelsen af ​​flere bindingspositioner på både B- og C-ringe.

'H NMR-signalerne, der opstod fra B-ringen, var to dubletter ved 2,49 og 2,71 ppm, der udviste en geminal kobling på ~15 Hz (12,03 ppm), typisk for en methylengruppe og en singlet ved 6,38 ppm, der stammer fra en ethylenisk proton. Da disse methylen- og ethylenprotoner ikke var koblet, er de sandsynligvis i positionerne 2'B og 5'B. HIMBC-spektret viste alle korrelationer, hvilket muliggjorde nøjagtige tilskrivninger af disse B-ring-carbonatomer, som illustreret i figur 5. H2C-værdien af ​​denne enhed gav tre korrelationer med B-ring-carbonatomer: den ene er methylen-carbonet ved ~45 ppm, som således blev tilskrevet C2'B, og de resterende to, med carbonatomer, der resonerede ved ~90 ppm og ~162 ppm, som kan tildeles C1'B og C6'B.H5'B gav kun stærke 3J-korrelationer med to kvaternære carbonatomer i denne B-ring : den ene er det kulstof, der tidligere er tildelt C3'B (~95 ppm), og den anden, som gav resonans ved ~90 ppm, kunne således tilskrives C1'B. Kulstoffet ved ~162 ppm blev derefter udledt til at være C6'B.

Tilstedeværelsen af ​​en alifatisk OH (~5,8 ppm) ved C3'B-positionen (~95 ppm) blev bestemt gennem dens ROE-korrelation med begge H2'B-protoner. Ydermere gav OH3/B HMBC-korrelation med et kvaternært kulstof ved ~192,5 ppm, karakteristisk for en ketongruppe i C4'B-positionen.

Afskærmningen af ​​denne C1'B på ca. 40 ppm er i overensstemmelse med et tab af B-ringens aromaticitet. Endvidere er manglen på OH ved C7A-positionen af ​​den anden enhed i overensstemmelse med en etherbinding C1'BO-C7A.

NMR-dataene viste, at C-ringen af ​​denne enhed ikke har nogen OH3C. Tilstedeværelsen af ​​en C3C-O-C3'B-binding er i overensstemmelse med afskærmningen af ​​C3C på ca. 1,5 ppm såvel som det kemiske skift af C3'B, som er typisk for hemiketal-carbon (95 ppm).

Alt i alt giver NMR-spektraldataene os mulighed for at konkludere, at denne dimer svarer til dehydrocatechin A beskrevet tidligere af Winges et al.[33] og derefter af Guyot et al.[20].

Strukturerne af de seks dimere forbindelser bestemt ved disse NMR-analyser er vist i figur 6, hvor N2, N3, N6 og N8 er rene produkter, og N4 er en blanding af to isomerer.

3. Materialer og metoder

3.1.Kemikalier

(plus)-Catechin hydrat Større end eller lig med 98 procent; laccase fra Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); natriumphosphat dibasisk dihydrat Større end eller lig med 98 procent; citronsyre (ACS-reagens, cadmiumnitrat-tetrahydrat 99,997 procent; myresyre og Amberlite XAD7HP blev opnået fra Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, USA). Acetone-dg blev købt fra Euriso-top (Saarbrüicken, Tyskland) og trifluoreddikesyre syre (TFA) fra Roth Labo (Karlsruhe, Tyskland). Vand LC-MS, acetonitril LC-MS(ACN) og methanol LC-MS (MeOH) var alle fra VWR (Radnor, PA, USA).

3.2. Forberedelse af modelvinopløsningen

Modelvinopløsningen var en ethanol/vand-opløsning (12/88;o/o) med 0,033 M vinsyre, justeret til pH 3,6 med NaOH 1 M [34].

3.3. Rå vindrue PPO ekstrakter

PPO-ekstraktet blev fremstillet som beskrevet tidligere af Singleton et al.[35]. Frosne druer blev først blandet i en acetatbuffer (1,5 M, pH 5; 10 gL-I ascorbinsyre). Blandingen blev derefter filtreret og centrifugeret (3000 g; 10 min). Remanensen blev til sidst vasket med acetone (80 procent) og lufttørret.

3.4.Laccase fra Botrytis Cinerea

Laccase fra Botrytis cinerea blev opnået som beskrevet af Quijada-Morin et al.[36]. Den blev produceret fra VA612-stammen (samlet i 2005 i en vingård i Hautvillers, Champagne, Frankrig, fra Pinot Noir-kultivaren). Kort fortalt blev kulturer på fast maltgærmedium efterladt i en uge ved 24 grader under blåt lys. Sporerne blev derefter skrabet og inokuleret i en 500 mL Erlenmeyer-kolbe indeholdende 125 mL dyrkningsmedium (4{{30}} gL-1glucose, 7 gL{{10}}glycerol, 0,5 g·L-1L-histidin,0,1 g:L-1 CuSO,1,8gL-1 NaNO3,0,5g:L -1 KCl,0,5gL-1 CaCl2·H2O,0,05g:L-1 FeSO4.7H2O,1,0g L-1KH2PO4 og 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Efter 3 dages inkubation og 2 dages vækst i det samme tidligere medium blev gallussyre (2 gL-1) tilsat til forkulturerne. Efter 5 dage blev det flydende medium filtreret, og supernatanten blev underkastet tangentiel filtrering i et Quixstand-filtreringssystem (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) udstyret med en 30 kDa-molekylvægt afskåret membranen. Koncentratet blev til sidst underkastet en diafiltrering mod destilleret vand, og kun de fraktioner, der udviste oxidantaktivitet mod ABTS, blev holdt (-80 grad).

3.5.Oxidationsprocedure

En laccaseopløsning (1 gL-1) i phosphat-citratbuffer blev tidligere fremstillet og tilsat til en 6g.L-1( plus )-catechinopløsning (modelvin) for at opnå en slutkoncentration af laccase på { {6}}.3 gL-1. Den opnåede opløsning blev derefter langsomt omrørt (180 rpm) ved stuetemperatur i 2 timer. Koncentrationerne var tidligere optimeret, og eksperimentet blev udført i tre eksemplarer.

3.6. Reaktionsstop på Resin Amberlite XAD7HP

En amber lite søjle blev konditioneret med ethanol (absolut) og skyllet med to søjlevolumener milli-O-vand. Det tidligere laccase/(plus)-catechin reaktionsmedium blev dryppet på søjlen og først elueret med to søjlevolumener milli-Qwater [37]. Søjlen blev derefter elueret med ethanol, indtil den opsamlede fraktion var ufarvet. Kun ethanolfraktioner blev opbevaret, inddampet og lyofiliseret. Pulveret blev opbevaret ved -80 grad indtil det blev brugt.

3.7. Oprensningsprocedure for den dimere fraktion ved hjælp af flashkromatografi

Det lyofiliserede pulver blev først oprenset under anvendelse af et flashkromatografisystem puriflash430 udstyret med en UV-detektor indstillet til 280 nm og en Puriflash-diol 50 um f0025-søjle. Den binære mobile fase bestod af acetonitril (opløsningsmiddel A) og methanol (opløsningsmiddel B), begge forsuret med 0,1 procent TFA. En række injektioner blev udført ved en konstant strømningshastighed på 20 ml·min-1 under anvendelse af følgende gradient: 100 procent A i 4,4 minutter; 0-10 procent B i 10 min; 10 procent B i 5 min; 10-90 procent B i 5 min; 90 procent B i 3 min; 90-10 procent B i 2 min; 10 procent B i 10 min. Injektionsvolumenet var 1 ml (300 mg frysetørret pulver opløst i 1 ml opløsningsmiddel A). Tre distinkte fraktioner blev opsamlet hver gang. Den første svarede til resterende (plus)-catechin, og den tredje var en blanding af højmolekylære polyphenoler. Den anden eluerede fraktion, der indeholdt en blanding af dimere oxidationsprodukter, blev inddampet og lyofiliseret før det andet oprensningstrin.

3.8. Oprensningsprocedure for oxidationsprodukter fra den dimere fraktion under anvendelse af et semi-præparationskromatografisk system

Fraktionen indeholdende dimere oxidationsprodukter blev oprenset under anvendelse af et semi-præparativt Bio-Rad NGC 10 mellemtrykskromatografisystem udstyret med en omvendt fase Varian Dynamax C18 Microsorb-søjle (250 × 21,2 mm; 3 um). Den binære mobile fase bestod af milli-O-vand (opløsningsmiddel A) og 80 procent acetonitril, 20 procent Milli-Q-vand (opløsningsmiddel B), begge forsuret med 0,05 procent TFA. En række injektioner (300 μL) af det frysetørrede pulver (20 mg opløst i 200 µl opløsningsmiddel A og 100 µl ACN) blev udført under følgende elueringsbetingelser: 100 procent A i 4 minutter; 0-35 procent B på 46 min;35-100 procent B på 2 min; 100 procent B i 5 min. Otte distinkte fraktioner blev opsamlet hver gang, svarende til rene UPLC-signaler ved 280 nm. Hver fraktion blev inddampet og lyofiliseret før NMR-analyse.

3.9. Prøveforberedelse til NMR-analyse

Ca. 1 mg af hvert lyofiliseret pulver vægtet i Eppendorf-rør blev opløst i 500 μL acetone-dg. Derefter blev ~10 uL af en koncentreret opløsning af cadmiumnitrat i acetone-d tilsat til prøverne, og de resulterende opløsninger blev overført til 5 mm NMR-rør til NMR-analyse. Et yderligere trin blev udført for nogle prøver: efter solubilisering af de frysetørrede pulvere i acetone-dg i nærværelse af spor af cadmium, blev prøverne inddampet til tørhed og derefter re-solubiliseret i acetone-d uden yderligere tilsætning af Cd.

3.10.Instrumentspecifikationer

UPLC-MS analyse. Reaktionerne blev overvåget under anvendelse af to UPLC-MS-systemer. Den første blev brugt til præcist at identificere produkters retentionstid ved hjælp af en lang gradientmetode. dvs. Waters omvendt fase ultra-højtydende væskekromatografi koblet til massespektrometri (UHPLC-MS). Væskekromatografisystemet var en Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) udstyret med en fotodiodearraydetektor. Vi brugte en Acquity UPLC HSS T3-søjle (1,8 um, 2,1 × 150 mm). Søjletemperaturen var 25 grader. Den binære mobile fase bestod af 0,1 procent myresyre i vand (opløsningsmiddel A) og acetonitril (opløsningsmiddel B). Adskillelsen blev udført ved en konstant strømningshastighed på 0.25mL·min-1, under anvendelse af følgende gradient: 8-11 procent B i 2 min; 11 procent B i 8 min; 11-25 procent B i 15 min;25-55 procent Bin 5 min;55-99 procent Bin 1 min;99 procent B i 4 min;99-8 procent Bin1 min;8 procent B i 4 min. Injektionsvolumenet var 5 μL. Massespektrometeret var en Waters Acquity QDa elektrosprayionisering (ESI) simpel quadrupol (Waters, Milford, MA, USA). Kapillarspændingen blev sat til 0,8 kV. Massespektrene blev opnået over et masseområde på 200-900 Tynd den positive ion-tilstand.

Det andet UHPLC-MS-system, der blev brugt til hurtig verifikation under oprensningstrinene, var det samme som tidligere beskrevet med en Acquity UHPLC HSS T3-søjle (1,8 μm, 2,1×100 mm） opvarmet ved 38 grader. Adskillelsen blev udført ved en konstant strømningshastighed på 0,55 mL·min-1 under anvendelse af følgende hurtige gradient:0.1-40 procent B i 5 minutter; 40-99 procent B på 2 min; 99 procent B i 1 min; 99-0,1 procent B på 1 min. Injektionsvolumenet var 2 μL. Massespektrometeret var en Bruker Amazon X elektrosprayionisering (ESI) ionfælde (Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland). Kapillærspændingen blev indstillet til -5,5 kV. Massespektrene blev erhvervet over et masseområde på 50-2000 Tynd den positive ion-tilstand.

Alle UPLC-MS-analyser blev udført i tre eksemplarer.

NMR-instrumentering. Alle NMR-spektrene blev optaget på et Agilent DD{{0}} MHz-spektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), der fungerede ved 500,05 og 125,74 MHz for proton- og carbon-13-kerner, henholdsvis ved brug af en 5 mm indirekte detektionssonde udstyret med en gradientspole.1D'H og 13C,2Dhomonuclear1H TOCSY og ROESY, og heteronukleære lH/13C HSQC og HMBCeksperimenter blev udført ved brug af klassiske pulssekvenser og analyseret ved hjælp af både VNMRJ4.2 og 14Re2Nova. .1 (Mestrelab Research, Spanien) software. DOSY-målinger blev indhentet og behandlet som tidligere beskrevet 38]. Optagelsesparametrene for DgcsteSL-pulssekvensen var som følger: diffusionsforsinkelsestiden og gradientimpulsbredden blev indstillet til henholdsvis 50 ms og 2 ms, gradientstyrken (g) blev øget i 16 trin med ens g2-afstand fra 0,3 til 2 ms. 32G·cm-I. Efter fasekorrektion blev 2D DOSY-spektre konstrueret ud fra tophøjdemålingen ved hjælp af VNMRJ4.2-software.

Alle spektre blev refereret til opløsningsmiddel-acetone-dg-signalerne ('H-restsignal ved 2,05 ppm og 13C-signal ved 29,92 ppm).

4 konklusioner

Virkningen af ​​tre forskellige oxidoreduktaser (polyphenoloxidase ekstraheret fra druer, laccase fra Botrytis cinerea og laccase fra Trametes Versicolor) på (plus)-catechin blev undersøgt, og LC-UV-MS resulterende profiler var meget ens, selvom nogle mindre forskelle antydede mulige uligheder i reaktiviteten af ​​disse enzymer.

Strukturerne af seks catechin-laccase-oxidationsprodukter (ved hjælp af laccase fra Trametes Versicolor) blev opnået på basis af specifikke NMR-signaturer (fire rene produkter, dvs. N2, N3, N6 og N8, og N4, svarende til en blanding af to isomerer). Den fuldstændige tilskrivning af phenoliske OH-signaler var mulig takket være tilsætningen af ​​cadmiumnitrat med en prøveforberedelsesprocedure, der tillod den utvetydige tilskrivning af bindingerne mellem catechin-enhederne for nogle af forbindelserne af interesse. Denne procedure vil i høj grad forenkle NMR-analyse af polyphenolblandinger, enten syntetiseret eller ekstraheret fra naturlige produkter.

Standarderne opnået i dette arbejde kan blive brugt i fremtiden som oxidationsmarkører til at undersøge deres tilstedeværelse og udvikling under druemodning og vinlagring. Udover catechin kan andre polyphenolforbindelser, herunder flavonoider og ikke-flavonoider, også anvendes som substrater for laccase for at opnå yderligere nye standarder.

Forkortelser

NMR: kernemagnetisk resonans,

Cd: cadmium,

TOCSY: total korrelationsspektroskopi,

ROESY: Nuklear Overhauser-effektspektroskopi med roterende ramme,

HSQC: heteronukleært enkeltkvantekorrelationseksperiment,

HMBC:heteronuclear multi-band connectivity,

DOSY: diffusionsordnet spektroskopi.

Referencer

1. Khan, N.; Mukhtar, H. Te-polyfenoler til sundhedsfremme. Life Sci. 2007, 81, 519-533. [CrossRef]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Karakterisering af New Flavan-3-Ol-derivater i fermenterede kakaobønner. Food Chem. 2018, 259, 207-212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polyfenoler fra kakao og vaskulær sundhed - en kritisk gennemgang. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290-4309. [CrossRef]

4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Koncentrationer af polyfenoler fra blåbærresterekstrakt ved hjælp af nanofiltrering. Food Bioprod. Behandle. 2017, 106, 91-101. [CrossRef]

5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Karakterisering af polyphenoler og evaluering af antioxidantkapacitet i druepresserester i CV. Malbec. Food Chem. 2015, 178, 172-178. [CrossRef]

6. Saucier, C. Hvordan udvikler vinpolyfenoler sig under vinlagring? Cerevisia 2010, 35, 11-15. [CrossRef]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Oxidationsmekanismer, der forekommer i vine. Food Res. Int. 2011, 44, 1115-1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL Oxygen med phenoler og relaterede reaktioner i moste, vine og modelsystemer: observationer og praktiske implikationer. Er. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69-77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Madbruning som en polyphenolreaktion. Fremskridt inden for fødevareforskning; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, red.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 1971; Bind 19, s. 75–145. [CrossRef]

10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Udvikling af phenoliske forbindelser og astringens under ældning af rødvin: Effekt af ilteksponering før og efter aftapning. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618-1627. [CrossRef] [PubMed]