Nye virkninger af kombinationsterapi gennem hæmning af caspase-1/Gasdermin D-induceret-pyroptose ved lupus nefritis

For flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang og Jin Lin

ABSTRAKT

Formål: Kombinationsbehandling med mycophenolatmofetil, tacrolimus og steroider er effektive til at opnå fuldstændig remission ilupus nefritis(LN). Kombinationsterapi nedregulerede entydigt caspase-1 sammenlignet med monoterapier, som kan spalte gasdermin D (GSDMD) og for nylig blev identificeret sompyroptosebøddel. Vi undersøgte derfor, om kombinationsterapi muliggjorde suppression af caspase-1/GSDMD-medieretpyroptosei LN (lupus nefritis).

Klik for at cistanche deserticola ma for nefritis

Metoder: Ekspression og aktivering af GSDMD blev påvist i nyreprøver af mennesker og mus med LN (lupus nefritis) under anvendelse af immunhistokemisk farvning og immunblotting. Primære podocytter isoleret fra MRLlpr-mus blev inkuberet med LPS plus ATP og forbehandlet med monoterapi eller kombinationsterapi. Hæmning af caspase-1/GSDMD-induceretpyroptoseved kombinationsterapi blev vurderet i MRLlpr-mus og humane prøver. Jeg blev undersøgt ved hjælp af et FAM caspase-1 kit og flowcytometri. Sammenhængen mellempyroptosei perifert blod, og det systemiske lupus erythematosus sygdomsaktivitetsindeks (SLEDAl) blev analyseret.

Resultater: Nyrevævsprøver fra LN (lupus nefritis) patienter og mus udviste stærkt øgede ekspressionsniveauer og spaltning af GSDMD. I dyrkede podocytter undertrykte kombinationsbehandling signifikant aktiveringen af ​​NLRP3 og caspase-1 og reducerede GSDMD N-terminale niveauer. Kombinationsterapi undertrykte sygdomsprogression gennem hæmning af caspase-1/GSDMD-medieretpyroptosei både mennesker og MRL/LPR-mus. Caspase-1/PI positive celleantal i perifert blod var positivt korreleret med SLE-DAl. LN (lupus nefritis) patienter med fuldstændig remission og delvis remission havde bemærkelsesværdigt reducerede caspase-1/PI-positive celleantal sammenlignet med baseline. Ac-FLTD-CMK, en GSDMD-afledt hæmmer, forhindrede udviklingen af ​​LN (lupus nefritis).

Konklusion: Kombinationsterapi undertrykte caspase-1/GSDMD-medieretpyroptosein vitro og in vivo og reduceret sygdomsprogression.

Nøgleord:lupus nefritis, pyroptose, caspase-1, gasdermin D, terapi

Behandlingsterapi tilpyroptose

INTRODUKTION

Lupus nefritis(LN) er nyrebetændelse, der opstår som følge af den autoimmune sygdom systemisk lupus erythematosus (SLE).LN (lupus nefritis) er en væsentlig manifestation hos patienter, der lider af SLE. Omkring 60 procent af patienterne udvikler denne tilstand, og cirka 20 procent udvikler sig til nyresygdom i slutstadiet (ESRD)(1). Kombinationsbehandling med mycophenolatmofetil (MMF), calcineurinhæmmere (CNI) og steroider giver komplementære virkninger og minimerer også toksicitet (2). Denne terapi anbefales som den indledende behandling for LN (lupus nefritis) og giver bedre effekt og mere fuldstændig remission sammenlignet med intravenøs cyclophosphamid (IVCY) og steroider (3-5).

For at undersøge de molekylære og cellulære mekanismer af kombinationsterapi blev omfattende transkriptomisk analyse anvendt i en murin model af LN (lupus nefritis). MRL/LPR-mus fik alene MMF, tacrolimus eller prednison som monoterapi eller triple-drug kombinationer. Profiler af ekspressionen af ​​gener i nyrerne hos mus med LN (lupus nefritis)afslørede potentielle mekanismer, der kan forklare de additive og synergistiske virkninger af kombinationsterapi sammenlignet med monoterapier. Et af 45 nedregulerede gener, der er unikt moduleret ved kombinationsterapi, er caspase-1 (6). Det aktiveres af inflammasomer, som er multiproteinoligomerer bestående af NLRP3, pro-caspase-1 og apoptose-associeret speck-like protein (ASC), med et integreret caspase-affinitetsdomæne. NLRP3/ASC/caspase-1-inflammasomet er blevet anerkendt som en vigtig bidragyder til patogenesen af ​​LN (lupus nefritis). NLRP3-inflammasomet driver autoinflammatoriske lidelser ved at aktivere caspase-1, hvilket initierer dannelsen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, f.eks. IL-1, som er kendt for at udløse podocytdysfunktion i LN(7-9).

Aktiv caspase-1 spalter gasdermin D(GSDMD) inden for koblingen af ​​dets N- og C-terminale domæner. Derefter letter det N-terminale domæne poredannelse i cellemembranen, stimulerer cellepyroptoseog cytokin IL-1 og IL-18 produktion(10). Nye undersøgelser har vist, at GSDMD-medieretpyroptosedeltager i udviklingen af ​​sygdomme, herunder autoimmun encephalomyelitis (11), multipel sklerose(12), alkoholisk hepatitis(13) og inflammatorisk tarmsygdom(14). Derudover har genetisk eller farmakologisk hæmning af caspase-1/GSDMD blevet påvist at beskytte nyrerne mod skader i murine modeller af diabetisk nyresygdom(15, 16) og også efter akut nyreskade(17-19). Imidlertid,pyroptosei LN (lupus nefritis)er stadig dårligt defineret til dato(20). Vi antog, at kombinationsterapi gav gavnlige effekter i LN (lupus nefritis)) ved at hæmmepyroptoseinduceret af caspase-1/GSDMD.

I denne undersøgelse blev aktiveringen af ​​caspase-1 og GSDMD i nyrevæv undersøgt samt virkningerne af kombinationsterapi på caspase-1/GSDMD-afhængigpyroptosehæmning i MRL/LPR-mus og patienter med LN (lupus nefritis). Potentielle sammenhænge afpyroptosemed SLE-sygdomsaktivitetsindekset (SLEDAI), og behandlingsresponserne blev også vurderet.

Behandling forpyroptose

MATERIALER OG METODER

Studiebefolkning

Studiekohorten bestod af patienter diagnosticeret ved biopsi med LN (lupusnefritis) Mindre end eller lig med 6 måneder før tilmelding. Patientens aldersinterval var 18-65 år, og alle opfyldte klassifikationskriterierne fra American College of Rheumatology for SLE (2l, 22) og International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (2003). Patienter blev rekrutteret fra Zhejiang University School of Medicine og Nanjing University School of Medicine, som havde proteinuri (Større end eller lig med 1,5 g/d) og serumkreatininkoncentrationer mindre end eller lig med 265,2 umol/L. Eksklusionskriterierne omfattede: en patient var tidligere blevet behandlet med høje doser methylprednisolon; biologiske lægemidler (målrettet mod specifikke patogene molekyler) eller kombinationsterapi; nuværende plasmaferese eller behandling med intravenøs globulin inden for 12 uger efter screening; unormale leverfunktioner; aktuelle aktive infektioner; og en ondartet tumor inden for 4 uger efter påbegyndelse af undersøgelsen. LN (lupusnefritis) patienter fik pulsbehandling med methylprednisolon i 3 dage i en dosis på 0,5 g/d. Når methylprednisolon-pulsbehandlingen var afsluttet, blev kombinationsgruppen med prednison (0,6 mg/kg/d), MMF (0,5 g, to doser/d) og tacrolimus (2 mg, to doser/d) blev givet i i alt 4 uger. Derefter blev doserne af prednison, som stadig var kombineret med MMF(0,5 g, to doser/d) og tacrolimus (2 mg, to doser/d), reduceret med 5 mg/d hver 2. uge indtil en vedligeholdelsesdosis på 10 mg/d blev opnået(4). Fuldstændig remission (CR) blev taget som en 24-h urinproteinkoncentration Mindre end eller lig med 0,4 g, fravær af aktive urinsedimenter, en serumalbuminkoncentration større end eller lig med 35 g/L og normalt kreatinin (23). Partiel remission (PR) blev taget som et større end eller lig med 50 procent fald i 24-h urinproteinkoncentration til mindre end eller lig med 3,5 g, en serumalbuminkoncentration på større end eller lig med 30 g/ L, og en normal eller mindre end eller lig med 25 procent stigning i serumkreatininkoncentrationen fra baseline. Vores Institutional Review Board godkendte undersøgelsen (nr. IIT20200410A), og alle patienter gav skriftligt samtykke før tilmelding.

Dyremodeller

MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) hunmus blev leveret af SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Shanghai, Kina), alle mus blev tilfældigt opdelt ved hjælp af en tilfældig talgenerator, 5 mus i hver gruppe og hvert bur . De blev behandlet oralt i en alder af 8 uger med en kombination af 0,5 mg/kg tacrolimus (MCE HY-13756), 50 mg/kg MMF (MCE HY-B0199) og 1 mg/ kg prednison(MCE HY-B0214) eller køretøj dagligt i i alt 8 uger som tidligere beskrevet(6). Ac-FLTD-CMK blev syntetiseret af MCE, og 10 mg/kg blev injiceret ip dagligt. Alle behandlinger blev blindet for deltagerne, der var ansvarlige for den følgende påvisning. Urinalbumin-til-kreatinin-forholdet (UACR) blev bestemt under anvendelse af Albuwell M og Creatinine Companion (Excell, Phil, USA). Nyreprøver blev fikseret i 4 procent paraformaldehyd før histologisk og immunhistokemisk farvning, og nyrebark blev ekstraheret til immunblottinganalyse. Brug af mus blev godkendt af vores institutionelle dyrepleje- og brugskomité (nr.2019-883).

Mus Glomeruli-isolering og Podocytkultur

Glomeruli blev oprenset fra nyrerne af 12-ugegamle C57 hun- og MRL/LPR-mus som beskrevet før(24). Bedøvede mus blev perfunderet med 37 grader C forvarmede magnetiske perler. Nyrerne blev fjernet og hakket på is til 1 mm³. Derefter blev nyrevævet fordøjet ved 37 grader med 1 mg/ml collagenase og 100 U/ml DNase I i 30 minutter, derefter filtreret to gange med 100-μm Falcon cellefiltre (431752, BD). Efter adskillige vaske med 4 graders HBSS-opløsning (H1025, Solarbio) og forsigtig centrifugering ved 200 g i 5 minutter, blev glomeruli-holdige perler opsamlet ved at bruge det magnetiske stativ (HY-K0200, MCE) og vasket med HBSS-opløsning tre gange. Isolerede glomeruli blev dyrket på type I collagen (C3867, Sigma-Aldrich) coatede dyrkede skåle i 5 procent CO, ved 37 grader ifølge metoden beskrevet af Jeffrey (25). Passage 2 podocytter blev anvendt i in vitro eksperimentet.PyroptoseInduktion, cytotoksicitet og IL-1-sekretionsdetektion

Podocytter fra MRL/LPR-mus blev primet med 1 mg/ml LPS (tell-pb5lps, InvivoGen) opløst i Opti-MEM i 4 timer, derefter efterfulgt af 5mM ATP(tlrlatpl, In Vivo-gen)-stimulering. Podocytter fra C57-mus blev adskilt som normal kontrol. Monoterapier tacrolimus（10μM）, MMF（luM） og prednison （10μM） eller kombineret terapi blev præ-inkuberet med cellerne i 1 time før LPS-priming. Cytotoksiciteten efter stimulering blev bestemt ved anvendelse af et cytotoksicitetsdetektionskit (11644793001, Roche) i henhold til producentens instruktioner. Supernatanten efter stimulering blev opsamlet og målt ved hjælp af IL-1 muse ELISA Kit (BMS6002, Invitrogen) i henhold til producentens instruktioner.

Antistoffer og reagenser

Caspase-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech)-niveauer blev vurderet i henhold til producentens instruktioner.Pyroptosei perifert blod blev målt ved hjælp af FAM FLICAMCaspase-1 Kit (Bio-Rad, USA) ved flowcytometri.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism(vers. 8.0), og dataene er angivet som middelværdier ± SD. To gruppesammenligninger blev udført ved hjælp af Students t-test og korrelationsanalyser ved brug af Pearsons korrelation. Tohalet s<0.05 was="" considered="" statistically="">

Behandling forpyroptose ilupus nefritis (LN)

RESULTATER

GSDMD-medieretPyroptoseEr aktiveret i nyrer påvirket af LN (lupusnefritis)

For at undersøge om GSDMD bidrog til patogenesen af ​​LN (lupusnefritis), testede vi først proteinekspressionsniveauet for GSDMD i nyreprøver taget fra LN (lupusnefritis) patienter. Immunhistokemisk analyse afslørede bemærkelsesværdigt øgede ekspressionsniveauer af GSDMD i nyrebiopsiprøver taget fra LN (lupusnefritis) patienter med type IV, V, I plus Vand IV plus V, og sammenlignet med raske forsøgspersoner. GSDMD blev universelt udtrykt i glomerulære podocytter, tubulære celler og infiltrerede interstitielle celler i LN (lupusnefritis) patienter. Området med positiv (røde pile) og negativ farvning (sorte pile) blev forstørret (figur 1A). Procentdelen af ​​GSDMD-positivt område i nyren blev derefter estimeret (figur 1B). Lignende resultater blev fundet i nyrerne hos MRL/LPR-mus og vildtypekontroller. Immunoblotting-analyse bekræftede stærkt øget ekspression og spaltning af GSDMD i nyreprøver af MRL/LPR-mus (figur 1C). GSDMD i glomerulære podocytter, tubulære celler og infiltrerede interstitielle celler var forhøjet i MRL/LPR-mus sammenlignet med kontrolmus (figur 1D). Disse data antydede, at GSDMD-medieret blev aktiveret i nyrevæv påvirket af LN (lupusnefritis).

FIGUR 1|GSDMD er stærkt forhøjet og spaltes i nyrerne hos patienter og mus, der er ramt af LN (lupus nefritis).

(A) Immunokemisk farvning af GSDMD i nyreprøver taget fra raske forsøgspersoner og LN (lupusnefritis) patienter, positiv (røde pile) og negativ farvning (sorte pile) var forstørrede.

(B) Kvantificering af GSDMD positive områder er vist i type III plus V, IV, IV plus V, V LN (lupusnefritis) patienter og raske forsøgspersoner.

(C) Immunoblotanalyse af fuldlængde, spaltet N-terminalt domæne og C-terminalt domæne GSDMD i nyrebarken fra tre par kontrol- og MRL/LPR-mus.

(D) Immunkemisk farvning af GSDMD i nyreprøver taget fra kontroller og MRL/LPR-mus.

*p < {{0}}.05,="" **p="">< 0.01.="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; FL, fuld længde; NT, N-terminalt domæne; CT, C-terminalt domæne.

Kombinationsbehandling undertrykker GSDMD-medieretPyroptoseAktivering i primære podocytter in vitro

At undersøge de hæmmende virkninger af kombinationsbehandling påpyroptose, anvendte vi LPS plus ATP-stimuleringsmetoden til at inducerepyroptosei podocytter fra MRL/LPR-mus, idet podocytter fra vildtype C57-mus tages som normal kontrol. Podocytter fra MRLlpr-mus blev primet i 4 timer med LPS og efterfølgende behandlet i 4 timer med ATP, en almindeligt anvendt stimulus til GSDMD-medieretpyroptoseaktivering(26). Sammenlignet med normal kontrol udviste podocytter efterfølgende pyroptotiske morfologiske træk, såsom cellehævelse og bobling. Forbehandling med kombinationsterapi forbedrede markant pyroptotiske morfologiske træk og cytotoksicitet (figur 2A). LPS plus ATP induceret podocytter cytotoksicitet. Til sammenligning reducerede kombineret terapi signifikant cytotoksiciteten og IL-1-sekretionen i supernatanten induceret af LPS plus ATP-stimulering (figur 2B, C). For yderligere at verificere aktiveringen af ​​GSDMD-medieretpyroptose, analyserede vi kanoniske inflammasomer og GSDMD-aktivering ved hjælp af immunblotting. I overensstemmelse med pyroptotiske morfologiske ændringer og cytotoksicitet aktiverede LPS plus ATP signifikant NLRP3, caspase-1 og spaltede GSDMD i podocytter (figur 2D). Kombinationsbehandling undertrykte markant aktiveringen af ​​NLRP3 og caspase-1 og reducerede niveauet af GSDMD N-terminal. Monoterapier med tacrolimus, MMF eller prednison undertrykte især LPS plus ATP cellecytotoksicitet og L-1-sekretion, men kombinationsterapi viste en mere signifikant hæmmende effekt på Caspase-1 og GSDMD. Disse resultater gav beviser, der understøttede det synspunkt, at kombinationsbehandling forbedrede GSDMD-medieretpyroptoseved at undertrykke aktiveringen af ​​NLRP3 og caspase-1.

FIGUR 2|Kombinationsbehandling forbedrer pyroptose i podocytter in vitro.

(A) Pyroptotiske træk blev udstillet i dyrkede primære podocytter efter inkubering med LPS plus ATP og forbehandlet med kombinationsbehandling. Pile indikerede celler, der udviser pyroptotisk-lignende træk.

(B) Supernatanter fra udfordrede celler blev analyseret for celledød som målt ved LDH-sekretion.

(C) Supernatanter fra de udfordrede celler blev analyseret for IL-1b-frigivelse.

(D) Immunoblotting-analyse af NLRP3, caspase-1, GSDMD-NT og ASC-ekspression efter tacrolimus, MMF, prednison eller kombinationsbehandling efter NLRP3-inflammasomaktivering.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0,001;="" ****p="">< 0,0001.="" ldh,="">

DSMO, dimethylsulfoxid, FK506, tacrolimus; MMF, mycophenolatmofetil; PNS, prednison; COM, kombinationsterapi; ASC, apoptose-associeret pletterlignende protein.

Kombinationsbehandling undertrykt caspase-1/GSDMD-induceretPyroptosei MRL/LPR-mus

Otte uger gamle MRL/LPR-mus fik en kombination af MMF, tacrolimus og prednison eller vehikelkontrol. I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse (6) blev der efter behandling i 8 uger ikke fundet forskel i dødelighed eller kropsvægt mellem vehikel- og kombinationsbehandlingsgrupperne. I modsætning til vehikelgruppen var kombinationsterapi meget effektiv til at forhindre proteinuri, glomerulosklerose og infiltration af nyre-interstitielle immunceller (Supplerende figur 1).

Dernæst undersøgte vi caspase-1- og GSDMD-ekspressionsniveauer i kombinationsterapi- og vehikelkontrolgrupper. Immunhistokemisk analyse afslørede, at den glomerulære og renale interstitielle caspase-1 og GSDMD-ekspression var markant reduceret i kombinationsterapigruppen (figur 3A). Immunoblotting-analysen fandt også en nedsat ekspression og spaltning af caspase-1 og GSDMD i nyrebarkene i kombinationsbehandlingsgruppen (figur 3B). Desuden blev caspase-1/propidiumiodid (PI) dobbeltpositive celler talt ved hjælp af flowcytometri og enpyroptoseFAM Caspase-1sæt. Resultaterne afslørede en markant reduktion i antallet af caspase-1*/PI' perifere blodceller i MRL/LPR-mus, der modtog kombinationsbehandlingen, sammenlignet med MRL/LPR-mus behandlet med vehikel. (Figur 3C,D). Derudover reducerede kombinationsbehandling også signifikant serum Ii-koncentrationen (figur 3E). Vi konkluderede således, at kombinationsbehandling undertrykte caspase-1/GSDMD-induceretpyroptosei nyrerne og blodcellerne i LN (lupusnefritis) mus.

FIGUR 3|Kombinationsbehandling svækket caspase-1/GSDMD-medieret pyroptose i MRL/LPR-mus.

(A) Immunkemisk farvning af GSDMD og caspase-1 i MRL/LPR mus nyreprøver. Sammenlignet med vehikelkontrollen var caspase-1 og GSDMD-ekspression markant hæmmet i kombinationsbehandlingsgruppen.

(B) Immunoblotanalyse af fuldlængde og spaltet GSDMD og caspase-1 i nyrebarkprøver fra MRL/LPR-mus; sammenligning af resultater fra vehikel- og kombinationsbehandlingsgrupperne.

(C) FACS for caspase-1/PI-dobbeltpositive celler i perifert blod fra MRL/LPR-mus, som fik eller ikke fik kombinationsbehandling.

(D) Kvantificering af caspase-1/PI-dobbeltpositive celler i perifert blod fra MRL/LPR-mus, der er givet eller ikke givet kombinationsbehandling.

(E) Kvantificering af serum IL{0}}b-koncentrationer i MRL/LPR-mus, der er givet eller ikke givet kombinationsbehandling. ####P < 0,0001.="" facs,="" fluorescensaktiveret="" cellesortering;="" ct,="">

Kombinationsterapi undertrykt caspase-1/GSDMD-induceretPyroptosei LN (lupusnefritis) Patienter

Mellem januar 2020 og juni 2020, 47 patienter med LN (lupusnefritis) blev tilmeldt og 43 gennemførte 24-ugers kombinationsbehandling. Grundlinjesygdommen og demografien for den tilmeldte kohorte er anført i supplerende tabel 1. Kvantificering af caspase-1/propidiumiodid (PI-dobbeltpositive celler blev udført hos patienter med LN (lupusnefritis) type III, IV, V, III plus V, IV plus V og hos raske kontroller ved hjælp af enpyroptoseFAM Caspase-1 kit og flowcytometri. Sammenlignet med de raske kontroller var antallet af caspase-1/PI-dobbeltpositive celler i perifert blod øget (figur 4A, B). Vi undersøgte også caspase-1/PI dobbeltpositive celler efter 24-ugers behandling og ved baseline. Efter 24-ugers induktionsbehandling var forekomsten af ​​CR og PR henholdsvis 39,5 procent (17/43) og 32,6 procent (14/43). De caspase-1/PI-dobbeltpositive celleantal i perifert blod fra CR- og PR-patienter var bemærkelsesværdigt reduceret sammenlignet med baseline (figur 4C). Vi identificerede også en sammenhæng mellem caspase-1 induceretpyroptoseog SLEDA; dataene viste tydeligt, at caspase-1/PI positive forhold i perifert blod var positivt korreleret med SLEDAI (figur 4D). Ac-FLTD-CMK, en GSDMD-afledt hæmmer, forhindrede udviklingen af ​​LN (lupusnefritis).

FIGUR 4|Kombinationsterapi svækkede caspase-1-medieret pyroptose hos LN-patienter (lupus nefritis).

(A) FACS af caspase-1/PI dobbeltpositive celler i perifert blod af LN (lupusnefritis) patienter behandlet med eller uden kombinationsbehandling.

(B) Kvantificering af caspase-1/PI dobbeltpositive celler i perifert blod af type III, IV, V, III plus V og IV plus V LN (lupusnefritis) patienter og raske forsøgspersoner.

(C) Kvantificering af caspase-1/PI dobbeltpositive celler i perifert blod af LN (lupusnefritis) patienter ved baseline, CR, PR og non-remission efter kombinationsbehandling.

(D) Korrelationsanalyse af caspase-1/PI dobbelt-positive celleforhold med SLE-DAI.

**p < 0.01.="" facs,="" fluorescensaktiveret="" cellesortering;="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; CR, fuldstændig remission; PR, delvis remission; SLE-DAI, systemisk lupus erythematosus sygdomsaktivitetsindeks.

En nylig undersøgelse viste, at GSDMDhmice udviklede øget nyre-C3- og IgG-aflejring, mere alvorlig nyreskade og øget dødelighed i en imiquimod-induceret model af SLE.17 For yderligere at afklare GSDMD's rolle i LN (lupusnefritis), blev MRL/LPR-mus behandlet med Ac-FLTD-CMK21 startende ved 8- uger gamle, med vehiklet som kontrollen. Efter 8-ugers behandling blev der ikke fundet nogen forskel i dødelighed eller kropsvægt mellem vehikel- og Ac-FLTD-CMK-behandlede gruppe. Sammenlignet med vehikelkontrolmusene havde Ac-FLTD-CMK-behandlede MRL/LPR-mus et lavere urinalbumin-kreatinin-forhold (figur 5A), en lavere serumkreatininkoncentration (figur 5B), reduceret glomerulosklerose (figur 5C) og CD3 , CD4 og CD68 positiv celleinfiltration (figur 5D). Immunhistokemi-resultater viste en reduceret ekspression af GSDMD (figur 5D) og undertrykt serum IL-1-sekretion bestemt ved ELISA (figur 5E). Samlet antydede dataene, at Ac-FLTD-CMK hæmmedepyroptosei nyrer påvirket af LN (lupusnefritis).

FIGUR 5|Ac-FLTD-CMK, en GSDMD-afledt hæmmer, forhindrede udviklingen af ​​LN (lupus nefritis).

(A) Urinalbumin-til-kreatinin-forholdet blev beregnet i MRL/LPR-mus givet eller ikke givet en GSDMD-hæmmer.

(B) Serumkreatinin i MRL/LPR-mus givet eller ikke givet en GSDMD-hæmmer.

(C) Repræsentative billeder af nyreprøver farvet med periodic acid-Schiff (PAS) og kvantificering af glomeruloskleroseprocent.

(D) Immunkemisk farvning af CD3, CD4, F4/80 og GSDMD. (E) Kvantificering af serum-IL-1b-koncentrationer i MRL/LPR-mus givet eller ikke givet en GSDMD-hæmmer.

Data er vist som middelværdi ± SEM. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

DISKUSSION

Kombinationsterapi er en lovende strategi på grund af højere CR og overordnede responsrater, kortere tid til remission og færre bivirkninger. Indtil nu var de underliggende molekylære mekanismer ved kombinationsterapi ikke kendt. For nylig behandlede Fu et al.(6) MRL/LPR-mus med monoterapier eller kombinationsterapi og udførte en omfattende transkriptomisk analyse på hele nyrer. Interessant nok fandt de, at kombinationsterapi, men ikke monoterapier specifikt og unikt undertrykte caspase-1-ekspression.

NLRP3/ASC/caspase-1-inflammasomet er nu anerkendt som en vigtig bidragyder til patogenesen af ​​LN (lupusnefritis). NLRP3-inflammasomer i podocytter aktiveres i lupus-tilbøjelige mus og også hos patienter med LN (lupusnefritis). Når NLRP3-inflammasomer blev undertrykt med en caspase-1-hæmmer, viste det sig, at proteinuri, renale histologiske læsioner og udslettelse af podocyt-fodprocessen blev forbedret hos lupus-tilbøjelige mus(8). Huang et al. (27) rapporterede, at NLRP3 blev udtrykt i tubulære celler af LN (lupusnefritis) klasse IV, og at NLRP3-aktivering var positivt korreleret med aktivitetsindeksscore for patienter med LN. Caspase-1 har vist sig at spille en afgørende rolle i lupus og vaskulær dysfunktion og er derfor et potentielt mål for nye terapeutiske interventioner(28). Nye eksperimentelle lægemidler såsom RIP3(29), P2X7-receptorantagonister(30), GSK-3-hæmmere (31) og en Nrf2-agonist (32) hæmmede udviklingen af ​​LN (lupusnefritis) i MRL/LPR-mus ved at modulere NLRP3/ASC/caspase-1-inflammasomaktiviteten, hvilket fremhæver vigtigheden og kritikaliteten af ​​NLRP3/ASC/caspase-1-inflammasomet i LN. Forhøjede serumkoncentrationer af IL-18 er korreleret med sygdommens sværhedsgrad og graden af ​​nyreskade/involvering hos SLE-patienter(33). Så vidt vi ved, ser det ud til, at gasdermin-familien kan være afgørende for udviklingen afpyroptose, men der har været mangel på beviser for tilstedeværelsen af ​​GSDMD/GSDME hos SLE-patienter.

Samlet set undersøgte vi aktiveringen og ekspressionen af ​​GSDMD i nyrebiopsiprøver taget fra LN (lupusnefritis) patienter og MRL/LPR-mus. GSDMD blev stærkt induceret og spaltet i glomerulære podocytter og tubulære celler og infiltrerede interstitielle celler. Efterfølgende fik MRL/LPR-mus en kombination af MMF, tacrolimus og prednison eller vehikel. Sammenlignet med vehikelkontrolgruppen var aktivering af caspase-1 og GSDMD reduceret i kombinationsbehandlingsgruppen. Graden afpyroptosei perifert blod var også meget lavere i LN (lupusnefritis) patienter efter administration af kombinationsterapi. I øvrigt,pyroptosei perifert blod var positivt korreleret med SLEDAI, hvilket antydede detpyroptosei perifert blod kunne fungere som en signifikant markør for SLE-aktivitet. Vi antog således, at kombinationsterapi kunne give gavnlige effekter i LN (lupusnefritis) ved at hæmmepyroptoseinduceret af caspase-1/GSDMD. Tidligere krystalstrukturundersøgelser af caspase-1 i et kompleks med Ac-FLTD-CMK afslørede mange enzym-inhibitor-interaktioner, der forhindrede GSDMD-genkendelse af caspase-1. Vi fandt dog ud af, at Ac-FLTD-CMK, der fungerer som en GSDMD-afledt hæmmer, hæmmedepyroptosei LN (lupusnefritis), som kan induceres af en anden mekanisme.

For nylig udviklede GSDMD-/-mus i en TLR7-induceret murin model af SLE(34) en større grad af nyreskade og øget dødelighed, hvilket oprindeligt antydede, at GSDMD-deletion ville have en beskyttende effekt og være forbundet med systemisk inflammation og produktion af autoantistoffer med tilhørende øget dødelighed. GSDMD-deficiente mus udvikler en mere fremtrædende aflejring af et glomerulært immunkompleks i nyreprøver og højere proteinuri sammenlignet med vildtype mus. Forøget sekretion af ekstracellulær HMGB1 blev også fundet i GSDMD-/lymfocytter, hvilket tyder på, at nekrose/pyroptoseopstod, da GSDMD var fraværende.

Caspase-1 udløsespyroptoseved GSDMD-spaltning. I modsætning hertil udløser caspase-1 i GSDMD-deficiente eller GSDMD-lave celler apoptose og derefter GSDME-afhængig sekundær nekrose ogpyroptose. Når GSDMD-aktivitet er fraværende efter terapi, kunne GSDME måske også skifte caspase-3-medieret apoptose tilpyroptose(35,36). Derudover var aktiveringen af ​​caspase-8 meget forbedret i makrofager, der var GSDMD-mangelfulde. Signifikant aktivering af caspase-8 blev også fundet i TLR7-induceret GSDMD-deficient LN (lupusnefritis) mus (34). I mangel af GSDMD er det således sandsynligt, at caspase-1 samarbejder med caspase-8 for at få caspase-3-GSDME-medieret apoptose til at skifte tilpyroptosei LN (lupusnefritis), en hypotese, der kræver yderligere eksperimentel undersøgelse.

Der er flere begrænsninger i den aktuelle undersøgelse. For det første, baseret på de nuværende data, bekræftede vi, at kombinationsterapi kunne undertrykkepyroptose, men andre behandlinger såsom dobbeltbehandling af steroider og MMF, steroider og tacrolimus eller anti-CD20-antistof kan også have sammenlignelige virkninger. For det andet er den nøjagtige molekylære mekanisme for inhiberingseffekt af kombinationsterapi på caspase-1 ikke godt udforsket. Sidst men ikke mindst observerer vi forholdet mellem caspase-1/PI-dobbeltpositive celler i perifert blod med SLE-DAI og ændringen før og efter kombinationsbehandling i en retrospektiv LN (lupusnefritis) patientkohorte. Den kliniske prædiktive værdi af caspase-1/PI dobbeltpositive celler for sygdomsaktivitet og behandlingsrespons skal undersøges yderligere i en større prospektiv kohorte.

Overordnet set identificerede vi, at kombinationsterapi bidrog til gavnlige virkninger ved at undertrykke caspase-1/GSDMD-induceretpyroptosei LN (lupusnefritis), som gav en ny indsigt i de involverede cellulære mekanismer. Faktisk undertrykte kombinationsterapi caspase-1 udtryk specifikt og unikt. Farmakologisk eller genetisk hæmning af NLRP3 og caspase-1 forbedrede nyrefunktionen og undertrykte autoimmunitet i LN (lupusnefritis). Den patofysiologiske rolle af caspase-1 i LN (lupusnefritis) er værdig til yderligere undersøgelse, og behandlinger rettet mod GSDMD hos patienter med LN (lupusnefritis) skal vurderes meget nøje.

Behandlingsmetode forpyroptose

REFERENCER

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.LupusNefritis: Aktuel opdatering.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Individualiseringsterapi iLupusNefritis. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS. Succesfuld behandling af klasse V plus IVLupusNefritisMed multitarget terapi. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al. Multitarget Therapy for Induction Treatment ofLupusNefritis: A Randomized Trial, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al. Multitarget Therapy for Maintenance Treaty ofLupusNefritis. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. Transkriptomisk analyse afdækker nye synergistiske mekanismer i kombinationsterapi forLupusNefritis. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.LupusNefritis: NLRP3 Inflammasom antænder podocytdysfunktion. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9