Transposerbart element RNA-dysregulering i mutant KRAS(G12C) 3D lungekræftsfæroider

ABSTRAKT

Mutant KRAS regulerer transposable element (TE) RNA og interferon-stimuleret gen (ISG) ekspression, men det er stadig uklart, om forskellige mutationer i KRAS påvirker forskellige TE RNA'er i hele genomet. Vi analyserede transkriptomerne af 3D humane lungekræftsfæroider, der rummer KRAS(G12C)-mutationer for at bestemme landskabet af TE-RNA'er reguleret af mutant KRAS(G12C). Vi fandt ud af, at KRAS(G12C)-signalering er påkrævet for ekspressionen af ​​LINE- og LTR-afledte TE-RNA'er, der adskiller sig fra TE-RNA'er, der tidligere er vist at være reguleret af mutant KRAS(G12D) eller KRAS(G12V). Desuden opregulerer KRAS(G12C)-hæmning specifikt SINE-afledte TE-RNA'er fra den yngste Alu-underfamilie AluY. Vores resultater afslører, at TE RNA-dysregulering i KRAS-drevne lungekræftceller er mutationsafhængige, mens de også fremhæver en undergruppe af unge, Alu-afledte TE RNA'er, der aktiveres koordineret med medfødte immunitetsgener efter KRAS(G12C)-hæmning.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

INTRODUKTION

Transposable element (TE) RNA'er er tilbagevendende dysregulerede i forbindelse med cancer 1. I mutante KRAS lungecancerceller er KRAB zink-finger (KZNF) gener bredt nedreguleret, hvilket fører til den afvigende opregulering af TE RNA'er afledt af LINE, SINE og LTR-elementer 2,3. Ud over TE-RNA'er er lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er) også koordineret reguleret med RAS-signalgener 4, og deres ekspressionsmønstre ændres på samme måde i mange kræftformer 5-8. For TE RNA'er inducerer deres opregulering i cancer en tilstand af viral mimik, hvilket fører til den iboende aktivering af medfødte immunitetsgener såsom interferon-stimulerede gener (ISG'er) 3,9,10. Især Alu-familien af ​​SINE'er er en dominerende kilde til immunogene TE RNA'er 11, som er induceret af epigenetiske ændringer forårsaget af DNA-methyltransferase-hæmmere (DNMTi) eller mutant KRAS-medieret KZNF-hæmning 3,9,10.

For at undersøge, hvordan en almindelig mutation i KRAS påvirker TE RNA-landskabet i lungecancerceller, karakteriserede vi transkriptomerne af 3D-lungecancersfæroider, der rummer KRAS(G12C)-mutationer i nærvær eller fravær af mutant KRAS(G12C)-hæmmer 12. Vi viser at KRAS(G12C)-signalering er nødvendig for ekspressionen af ​​LINE- og LTR-afledte TE-RNA'er, mens KRAS(G12C)-hæmning specifikt opregulerer både SINE-afledte TE-RNA'er og en undergruppe af interferon (IFN)-relaterede gener. Vores resultater afslører det komplekse samspil mellem mutant KRAS-signalering og TE-dysregulering i lungekræftceller, hvor et defineret sæt af unge AluY-elementer opreguleres på en mutationsafhængig måde.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

RESULTATER

KRAS(G12C)-hæmning ændrer det kodende og ikke-kodende transkriptom

For at bestemme, hvordan onkogen KRAS(G12C)-signalering regulerer det kodende og ikke-kodende transkriptom, udførte vi RNA-sekventering (RNA-seq) på 3D-mutante KRAS(G12C) lungekræftsfæroider. Til RNA-seq brugte vi en fuldlængde protokol med 5' unikke molekylære identifikatorer (UMI'er) for at muliggøre præcis RNA-tælling, mens vi mindsker PCR-amplifikationsforstyrrelser 13 (figur 1A). Vi sammenlignede transkriptomerne af H358 lungecancersfæroider behandlet med KRAS(G12C)-hæmmeren ARS-1620 (ARS) med kontrolsfæroider (DMSO-behandlede) (Figur S1A) og så, at ARS-behandling reducerede niveauerne af fosforyleret ERK væsentligt (p-ERK) (figur S1B), hvilket indikerer, at ARS-behandling hæmmede nedstrøms KRAS(G12C)-signalering. Undertrykkelsen af ​​KRAS(G12C)-signalering ved ARS-behandling blev også bevist ved reduktioner i sfæroidstørrelse og cellelevedygtighed (figur S1C og S1D).

På RNA-niveau vurderede vi den relative overflod af forskellige biotyper og TE-superfamilier i ARS- eller DMSO-behandlede 3D-lungekræftsfæroider, som afslørede dynamiske ændringer i TE RNA-sammensætning efter KRAS(G12C)-hæmning (Figur 1B). Mens vi kun opdagede 32 % af GENCODE-annoterede proteinkodende gener og 15 % af lncRNA-gener, var 92-96 % af TE-superfamilier (92 % LTR, 95 % SINE, 96 % LINE) repræsenteret i vores UMI-mærkede RNA-seq-data, der afslører bred dysregulering af TE-RNA'er i det KRAS(G12C)-drevne transkriptom. Op til en fjerdedel af alle påviste RNA-molekyler i ARS-behandlede lungecancersfæroider stammede fra TE'er, hvilket indikerer, at TE-RNA'er repræsenterer en betragtelig del af transkriptionel produktion af mutante KRAS(G12C) lungekræftceller.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Vi bestemte derefter de signifikant differentielt udtrykte gener mellem ARS- og DMSO-behandlede 3D-lungecancersfæroider for at identificere biologiske processer, der blev reguleret af onkogen KRAS(G12C)-signalering. Lungekræftsfæroider med intakt KRAS(G12C)-signalering blev signifikant beriget for gener involveret i G2M-kontrolpunkt, E2F-mål, MYC-mål og mitotisk spindel (figur 1C). Efter KRAS(G12C)-hæmning udtrykte lungekræftsfæroider imidlertid signifikant højere niveauer af gener involveret i oxidationsphosphorylering, komplement og IFN alfa- og gamma-responserne (figur 1C), hvilket gav yderligere understøttende beviser for involvering af KRAS-signalering i reguleringen af IFN-relaterede gener 2,3.

KRAS(G12C)-hæmning inducerer koordineret ISG'er og unge AluY-elementer

For yderligere at belyse den iboende opregulering af ISG'er efter KRAS(G12C)-hæmning identificerede vi, hvilke gener og TE'er, der var signifikant differentielt udtrykt i henholdsvis hvert gensæt og TE-superfamilie. På tværs af både IFN alfa- og IFN-gamma-responsgener var det stærkest inducerede gen ved KRAS(G12C)-hæmning i lungecancersfæroider RTP4 (figur 2A), et receptor-transporterprotein, der negativt regulerer TBK1-signalering 14. Derudover MHC klasse I-komplekset gen beta-2-mikroglobulin (B2M), som er tilbagevendende inaktiveret i lungecancer 15, var også signifikant opreguleret i begge IFN-relaterede gensæt i ARS-behandlede lungecancersfæroider (figur 2A).

I betragtning af den direkte rolle for onkogen KRAS-signalering i TE RNA-regulering 3, undersøgte vi, hvilke underfamilier af TE RNA'er, der var afhængige af mutant KRAS(G12C). I lungekræftsfæroider med intakt KRAS(G12C)-signalering fandt vi, at LINE-underfamilierne L1M6B og L1PA12 var stærkt udtrykt og afhængige af KRAS(G12C), som det fremgår af deres nedregulering i lungekræftsfæroider behandlet med ARS (Figur 2B). Desuden, mens kun en enkelt DNA-underfamilie MER44D var afhængig af KRAS(G12C)-signalering, blev over et dusin LTR-underfamilier reguleret af mutant KRAS(G12C), inklusive MLT1A0-int, LTR51, MER50B og LTR1B0 (figur 2B). I modsætning hertil blev SINE-underfamilier alle signifikant opreguleret efter KRAS(G12C)-hæmning og koordineret induceret med specifikke ISG-gener (figur 2A) i lungekræftsfæroider. Disse SINE TE RNA'er var alle afledt af AluY-underfamilien (figur 2B), hvilket indikerer, at KRAS(G12C)-hæmning dysregulerer en specifik undergruppe af unge AluY-elementer.

KRAS(G12C)-hæmning nedregulerer lange ikke-kodende RNA'er

For yderligere at belyse virkningerne af KRAS(G12C)-hæmning på transkriptomet undersøgte vi alle signifikant differentielt udtrykte lncRNA'er i lungekræftsfæroider behandlet med ARS- eller DMSO-kontrol. Vi fandt, at et stort antal lncRNA'er var afhængige af KRAS(G12C)-signalering for deres ekspression, da mange af disse lncRNA'er var signifikant nedreguleret efter KRAS(G12C)-hæmning (figur 3A). Tre af disse nedregulerede lncRNA'er, AC114546.3, NCMAP-DT og AC073575.2, har ingen kendte funktioner, men overlapper i en antisense-orientering til henholdsvis de kodende gener ZNF770, RCAN3 og ERP29. Som en klasse af ikke-kodende RNA observerede vi bred nedregulering af lncRNA'er ved ARS-behandling i lungekræftsfæroider (figur 3B), hvilket indikerer, at mange lncRNA'er er afhængige af KRAS(G12C)-signalering for deres ekspression.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

DISKUSSION

Her viser vi, at onkogen KRAS(G12C)-signalering er påkrævet for ekspressionen af ​​specifikke TE-superfamilier, nemlig LINE- og LTR-elementer, såvel som en undergruppe af lncRNA'er, hvilket yderligere viser, hvordan RAS-signalering regulerer det ikke-kodende transkriptom 2-4. Vi brugte også en 3D-lungekræftsfæroidmodel til vores KRAS(G12C)-hæmmerforsøg, da 3D-modeller har vist sig mere trofast at rekapitulere in vivo-lægemiddelresponset sammenlignet med 2D-kulturmodeller 16. Desuden er vores anvendelse af en UMI-baseret fuld -længde RNA-seq-teknik 13 gav os mulighed for mere præcist at fange TE RNA-sammensætning og dynamik i vores lungekræftsfæroider ved at fjerne PCR-duplikater i vores RNA-seq-data.

Vores resultater stemmer overens med tidligere undersøgelser af KRAS(G12C)-hæmning, hvor IFN-alfa- og gamma-responsgener blev opreguleret i ARS-behandlede H358-lungecancerceller 17. Baseret på de kendte immunogene egenskaber af Alu-afledte RNA'er 11, tyder vores resultater på, at den specifikke opregulering af unge AluY-elementer efter KRAS(G12C)-hæmning er i det mindste delvist ansvarlig for den stærke opregulering af ISG'er i ARS-behandlede lungekræftsfæroider. Navnlig omfatter den betydelige berigelse af IFN-relaterede gener som reaktion på KRAS(G12C)-hæmmerbehandling ikke den yderligere opregulering af RNA-sensor-ISG'er såsom MDA-5, RIG-I eller PKR, som oprindeligt bliver opreguleret i lungeceller som reaktion på onkogen KRAS-signalering 2,3.

Vi har tidligere vist, at mutant KRAS-signalering alene er tilstrækkelig til at inducere TE RNA-opregulering i humane lungeceller, der er blevet transformeret in vitro 2,3, og vores resultater beskrevet her udvider disse observationer til lungekræftceller med en anden aktiverende KRAS-mutation. KRAS(G12D)- eller KRAS(G12V)-mutationer inducerer begge den signifikante opregulering af LTR12C-underfamilien i transformerede lungeceller 3, men vi så ikke signifikant berigelse af LTR12C-afledte TE-RNA'er i vores KRAS(G12C)-lungekræftsfæroider. I stedet så vi opregulering af LTR51, LTR1B0, LTR14B og LTR28B, hvilket tyder på, at forskellige gain-of-function mutationer i KRAS regulerer forskellige aspekter af TE RNA-transkriptomet.

Vores arbejde giver en omfattende vurdering af, hvordan det ikke-kodende/TE RNA-transkriptom dynamisk reagerer på KRAS(G12C)-hæmning. Fremtidige undersøgelser kan give ny indsigt i de potentielle roller af ikke-kodende/TE-RNA'er i mekanismer for KRAS(G12C)-hæmmerresistens. Endvidere kan TE-RNA'er, der udskilles fra cancerceller ved KRAS-hæmning, tjene som ekstracellulære RNA-biomarkører 2,3,5,18,19 for respons og/eller resistens over for KRAS-hæmmerterapier 20.

MATERIALER OG METODER

Cellelinjer

H358 lungecancercellelinjer indeholdende KRAS(G12C)-mutationen blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Sigma) ved 37 grader, 5% CO2 i en fugtig inkubator. Alle cellelinjer testede negative for mycoplasma. Cellelinjer blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC).

Cellelevedygtighedsassays

Til sfæroide-levedygtighedsassays blev 10,000 celler/brønd podet i rundbundede 96-brøndsplader med lav adhæsion og inkuberet ved 37 grader, 5 % CO2 i 24 timer. Derefter blev seriefortyndet ARS- 1620 eller DMSO tilsat til cellerne, og pladerne blev inkuberet under standardkulturbetingelser i 72 timer, hvor friske ARS- og DMSO-medier blev udskiftet dagligt. Cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af et Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability Assay-kit (Promega) i henhold til producentens protokol. Luminescenssignalet fra ARS-behandlede prøver blev normaliseret til DMSO-kontrol. Luminescens blev målt på en SpectraMax iD3 molekylær enhed.

RNA isolering

Samlet bulk-RNA blev isoleret fra ca. 100 H358-sfæroider (pr. betingelse) under anvendelse af Quick-RNA Mini-Prep-kit (Zymogen) i henhold til producentens protokol. RNA blev kvantificeret via NanoDrop-8000 spektrofotometer.

RNA-seq bibliotek præparation

En tilpasset Smart-seq3-protokol 13 blev brugt til at generere RNA-seq-biblioteker fra totalt RNA til at tælle og vurdere RNA-molekyler i fuld længde. Kort fortalt blev 1 0 ng af totalt RNA revers transskriberet under anvendelse af en stregkodet oligoDT-primer (125 nM) efterfulgt af skabelonskift med en stregkodet skabelon-switch-oligo (125 nM). Disse oligosekvenser tjente som primere til PCR-amplifikation. Nextera HT-kittet (Illumina) blev brugt til at konvertere cDNA-biblioteker til sekventeringsbiblioteker med tilføjelse af en UMI-specifik primer for at amplificere cDNA-enderne indeholdende molekylære stregkoder som beskrevet i Smart-seq3-protokollen. cDNA og bibliotekskvalitet blev vurderet ved hjælp af en Agilent bioanalyzer DNA højfølsomhedschip og kvantificeret ved hjælp af højsensitiv DNA assay på Qubit 3.0.

Vestlig blot

Ca. 100 H358-sfæroider (pr. tilstand) blev isoleret efter ARS- eller DMSO-behandling. Sfæroider blev derefter inkuberet på is i RIPA-buffer suppleret med proteaseinhibitor i 15 minutter. Lysater blev derefter centrifugeret ved 10,000 RCF i 10 minutter. Supernatanten blev derefter overført til et nyt rør til efterfølgende SDS-PAGE-prøveforberedelse i Laemmli-buffer, kogt i 5 minutter ved 95 C til en slutkoncentration på 1 mg/ml. SDS PAGE blev udført for at adskille protein efter størrelse efterfulgt af efterfølgende overførsel til en PVDF-membran. Membraner blev inkuberet med primære p-ERK (CST) og HSP90 (CST) antistoffer natten over ved 4 C. Sekundære antistoffer (Abcam) blev derefter inkuberet på 3 gange TBST vaskede membraner i blokerende buffer til efterfølgende billeddannelse.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

UMI deduplikation

Parrede illumina-aflæsninger blev adaptertrimmet ved hjælp af FastP 21 med standardindstillinger. UMI'er blev udtrukket fra læsningen og flyttet til læsenavnet ved hjælp af umi_værktøjer_udtræk fra UMI-værktøjspakken 22 med stregkodemønsteret sat til "NNNNNNNN". UMI-fjernede læsninger blev justeret mod HG38 ved hjælp af STAR-aligneren med GENCODE v38-annotationssættet. Justerede læsninger blev deduplikeret ved hjælp af "UMI-tools dedup" med standardindstillinger.

RNA-seq analyse

Alle fastq-filer blev trimmet med Trimmomatic 2 (0.38) 23, og de resulterende trimmede filer blev vurderet med FastQC 24 og derefter behandlet med følgende analytiske pipeline: Laks (1.3.0): pseudojustering af RNA -seq-læsninger udført med Salmon 25 ved hjælp af følgende argumenter: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 ved hjælp af et indeks oprettet fra GENCODE version 35 transcriptome fasta-filen ved hjælp af lokkesekvenser for at muliggøre selektiv justering. Et yderligere, TE-bevidst indeks blev oprettet på en lignende måde, men suppleret med sekvenser genereret fra UCSC Repeat Masker-sporet. DESeq2 (1.32.0): Lakseoutput blev importeret til et DESeq-objekt ved hjælp af tximport 26, og differentiel udtryksanalyse blev udført med standardargumenter 27. Alle resultater blev filtreret til at have padj < 0,05. Hvor tælledata blev brugt, blev det normaliseret på tværs af prøver ved hjælp af DESeq.

Gensætberigelsesanalyse

Differentielt udtrykte gener blev rangeret efter de krympede log2FoldChange-værdier genereret af DESeq2. Gensæt blev erhvervet ved hjælp af R-pakken msigdbr (7.4.1) og filtreret til kun at indeholde gensæt med 'Hallmark'-status. R-pakken fgsea (1.18.0) blev brugt til at generere Gene Set Enrichment estimater, som blev filtreret til resultater med justerede pværdier < 0.05.

REFERENCER

1. Burns, KH (2017). Transponerbare elementer i kræft. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.

2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Epigenomisk omprogrammering af gentagne ikke-kodende RNA'er og IFN-stimulerede gener af mutant KRAS. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.

3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L. ., et al. (2022). Mutant KRAS regulerer transposerbart element RNA og medfødt immunitet via KRAB zink-finger gener. Cellerapporter 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.

4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB, og Wold, BJ (2015). Enkeltcellet transkriptomanalyse afslører dynamiske ændringer i lncRNA-ekspression under omprogrammering. Cellestamcelle 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.

5. Reggiardo, RE, Maroli, SV og Kim, DH (2022). LncRNA biomarkører for inflammation og kræft. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.

6. Schmitt, AM og Chang, HY (2016). Lange ikke-kodende RNA'er i Cancer Pathways. Kræftcelle 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.

7. Rinn, JL og Chang, HY (2020). Lange ikke-kodende RNA'er: molekylære modaliteter til organismiske funktioner. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.

8. Slack, FJ og Chinnaiyan, AM (2019). Ikke-kodende RNA'ers rolle i onkologi. Celle 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.

9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. Snyder, A., et al. (2015). Hæmning af DNA-methylering forårsager et interferonrespons i kræft via dsRNA, herunder endogene retrovira. Celle 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.

10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J., et al. (2015). DNA-demethyleringsmidler retter sig mod kolorektale cancerceller ved at inducere viral mimik ved endogene transkriptioner. Celle 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.

11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S. ., et al. (2020). Epigenetisk terapi inducerer transkription af inverterede SINEs og ADAR1-afhængighed. Nature 588, 169-173. 10.1038/s41586-020-2844-1.

12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA og Shokat, KM (2013). K-Ras(G12C)-hæmmere styrer allosterisk GTP-affinitet og effektor-interaktioner. Nature 503, 548- 551. 10.1038/natur12796.

13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, og Sandberg, R. (2020). Enkeltcellet RNA-tælling ved allel- og isoformopløsning ved hjælp af Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10,1038/s41587-020- 0497-0.

14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020). RTP4 hæmmer IFN-I-respons og forbedrer eksperimentel cerebral malaria og neuropatologi. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.

15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G., et al. (2017). Genomisk profilering af patientafledte xenotransplantater til lungekræft identificerer B2M-inaktivering, der hæmmer immungenkendelse. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.

16. Sen, C., Freund, D. og Gomperts, BN (2022). Tredimensionelle modeller af lungen: fortid, nutid og fremtid: en minigennemgang. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero. -Clavijo, P., et al. (2022). Terapeutisk KRAS(G12C)-hæmning driver effektiv interferon-medieret antitumorimmunitet i immunogene lungecancere. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.

18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U., og Kim, DH (2022). Ekstracellulære RNA-signaturer af mutante KRAS(G12C) lungeadenokarcinomceller. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.

19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, og Demirci, U. (2021). Mod mikrofluidisk-baseret exosomisolering og påvisning til tumorterapi. Nano Today 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.

20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F. og Malek, S. (2021). RAS-målrettede behandlinger. Nat Rev Drug Discov. 10.1038/s41573-021-00220-6.

21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y. og Gu, J. (2018). fastp: en ultrahurtig alt-i-en FASTQ-forprocessor. Bioinformatics 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatik/bty560.

22. Smith, T., Heger, A. og Sudbery, I. (2017). UMI-værktøjer: modellering af sekventeringsfejl i Unique Molecular Identifiers for at forbedre kvantificeringsnøjagtigheden. Genome Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.

23. Bolger, AM, Lohse, M. og Usadel, B. (2014). Trimmomatic: en fleksibel trimmer til Illumina-sekvensdata. Bioinformatik 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatik/btu170.

24. Brown, J., Pirrung, M. og McCue, LA (2017). FQC Dashboard: integrerer FastQC-resultater i et webbaseret, interaktivt og udvideligt FASTQ kvalitetskontrolværktøj. Bioinformatik. 10.1093/bioinformatik/btx373.

25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, og Kingsford, C. (2017). Laks giver hurtig og bias-bevidst kvantificering af transskriptionsekspression. Nat Methods 14, 417-419. 10,1038/nmeth.4197.

26. Soneson, C., Love, MI og Robinson, MD (2015). Differentielle analyser for RNA-seq: estimater på transkriptniveau forbedrer inferenser på genniveau. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.

27. Love, MI, Huber, W. og Anders, S. (2014). Modereret estimering af foldændring og dispersion for RNA-seq-data med DESeq2. Genome Biol 15, 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8.

ANKENDELSER

Vi takker medlemmer af Kim Lab for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af midler fra Baskin School of Engineering (til DHK). DC blev støttet af en Predoctoral Fellowship Award fra Tobacco-Related Disease Research Program (T30DT0997), RER blev støttet af en F99/K00 NIDDK KUH Prædoctoral til Postdoc Fellow Transition Award fra National Institutes of Health (1F99DK{ {7}}), og VP blev støttet af en prædoctoral Fellowship Award fra Tobacco-Related Disease Research Program (T32DT4904).

FORFATTERS BIDRAG

DHK konceptualiseret forskning, DC og DHK designet forskning, DC, JL og GM udførte eksperimenter, RER og VP analyserede data, og DC og DHK skrev papiret med input fra forfatterne.

FIGURER

Figur 1. KRAS(G12C)-hæmning ændrer det kodende og ikke-kodende transkriptom A. Eksperimentel skematisk. B. Fordeling af tællinger tildelt til GENCODE kodende, lncRNA og TE/repeat superfamilier i ARS-behandlede (ars) eller DMSO-behandlede (dmso) lungecancer spheroid RNA-seq biblioteker, hvor hver kolonne repræsenterer et biologisk replikat. C. Signifikante gensætberigelsesanalyseresultater observeret i DMSO-behandlede (højre, positiv NES) eller ARS-behandlede (venstre, negativ NES) lungecancersfæroider ved anvendelse af differentielt udtrykte gener rangeret efter normaliseret berigelsesscore (NES).

Figur 2. KRAS(G12C)-hæmning inducerer koordineret ISG'er og unge AluY-elementer

A. Vulkanplot, der afbilder signifikant differentiel ekspression observeret i nøglegensæt mellem DMSO-behandlede (højre, positiv fold-ændring) eller ARS-behandlede (venstre, negativ fold-ændring) lungekræftsfæroider. B. Vulkanplot, der afbilder signifikant differentiel ekspression observeret i TE-superfamilier mellem DMSO-behandlede (højre, positiv foldændring) eller ARS-behandlede (venstre, negativ fold-ændring) lungekræftsfæroider.

Figur 3. KRAS(G12C)-hæmning nedregulerer lange ikke-kodende RNA'er

A. Vulkanplot af signifikant differentiel ekspression af GENCODE-proteinkodende RNA'er og lncRNA'er mellem DMSO-behandlede (højre, positiv fold-ændring) eller ARS-behandlede (venstre, negativ fold-ændring) lungekræftsfæroider. B. Boksplot af signifikant differentiel ekspression af GENCODE-proteinkodende RNA'er og lncRNA'er mellem DMSO-behandlede (top, positiv fold-ændring) eller ARS-behandlede (nederste, negativ fold-ændring) lungecancersfæroider (Wilcoxon).

SUPPLERENDE FIGUR

Figur S1.

A. H358 3D lungekræftsfæroider behandlet med ARS eller DMSO. B. Western blot for p-ERK og HSP90 under anvendelse af H358 3D lungecancersfæroider behandlet med ARS eller DMSO. C. Diametermålinger (i mikrometer) (venstre plot) og cellelevedygtighed (Cell Titer-Glo® luminescerende cellelevedygtighed i relative fluorescensenheder) (højre plot) af H358 3D lungecancersfæroider behandlet med ARS eller DMSO efter 3 eller 5 dages behandling (500 nM ARS-1620 eller DMSO). D. Diametermålinger (i mikrometer) af H358 3D-lungekræftsfæroider behandlet med forskellige koncentrationer af ARS-1620 (nM) i 7 dage.