Forbedring af top-down proteomik i hjernevæv med FAIMS del 2

Data Analyse

Proteoformidentifikation blev udført med TopPIC version 1.3.53 Indstillinger for TopPIC inkluderede et precursorvindue på 3 m/z (for at tage højde for isotopisk kappe), en massefejltolerance på 15 ppm, en max/min ukendt masseforskydning på 500 Da og et maksimum antal tilladte ukendte ændringer på 1.

I de senere år har flere og flere undersøgelser vist, at der er en tæt sammenhæng mellem proteinmorfologi og hukommelse. Proteiner er de mest basale molekyler i livsaktiviteter. De kan kontrollere cellernes livsaktiviteter og opretholde den normale funktion af den menneskelige krop. Undersøgelser har fundet ud af, at proteiners morfologi ikke kun spiller en vigtig rolle i cellelivsaktiviteter, men også har et uadskilleligt forhold til hukommelsesfunktionen i hjernen. Når først proteinernes morfologi ændres, vil det påvirke forbindelsen mellem neuroner og derved påvirke folks hukommelsesevne.

I de tidlige stadier af livet spiller ændringer i proteinmorfologi en afgørende rolle for hjernens udvikling og funktion. Hvis morfologien af ​​proteiner ikke er, som den burde være, vil det forårsage en række neurologiske problemer, som i sidste ende fører til hukommelsestab, kognitiv svækkelse og så videre.

Der er dog ingen grund til bekymring. Moderne medicinsk teknologi har givet folk mulighed for at justere proteiners morfologi gennem kosten for at forbedre deres hukommelse. En rig og varieret kost er rig på protein, men når du vælger protein, så prøv at vælge fødevarer med lavt fedtindhold, lavt kolesterolindhold og lavt kulhydratindhold for at undgå de negative virkninger af overdreven indtagelse på kroppen.

Kort sagt er proteinmorfologi og hukommelse uadskillelige. Vi bør være opmærksomme på en sund kost og et afbalanceret proteinindtag for at bevare et godt helbred og samtidig bevare god hukommelse. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche kan forbedre hukommelsen markant, fordi den har antioxidant-, anti-inflammatoriske og anti-aldringseffekter, som kan hjælpe med at reducere oxidation og inflammatoriske reaktioner i hjernen og derved beskytte sundheden for hjernen. nervesystemet. Derudover kan Cistanche også fremme væksten og reparationen af ​​nerveceller og derved forbedre forbindelsen og funktionen af ​​neurale netværk. Disse effekter kan hjælpe med at forbedre hukommelsen, indlæringsevnen og tænkehastigheden og kan også forhindre forekomsten af ​​kognitiv dysfunktion og neurodegenerative sygdomme.

Klik på Kend for at forbedre korttidshukommelsen

MS2-spektre blev søgt mod en database sammenkædet med indgange fra Homo sapiens Swiss-Prot (20.352), Swiss-Prot-splejsningsvarianter (22,000) og TrEMBL (54.436) samt almindelige kontaminanter. Identificerede proteoformer blev filtreret til en falsk opdagelsesrate (FDR) på 1% gennem TopPIC.

Nedstrøms dataanalyse blev udført i R-miljøet til statistisk beregning og figurgenerering.54 I nedstrømsanalyse blev proteoformer fra det samme gen med de samme start- og slutaminosyrer, som viste sig at være inden for ±5 Da, kombineret som en enkelt proteoform for at øge stringensen af vores opgaver.

Selvom 5Da-tærsklen er vilkårlig, kompenserede denne tilgang for forkert tildelte monoisotopiske toppe, tvetydighed i ukendte masseskift og andre artefaktuelle afvigelser. For at bestemme den relative standardafvigelse (RSD) af proteoformer inden for replikater, brugte vi "funktionsintensitet"-outputtet fra TopPIC.

Fragmenteringssekvensdækningskort og tilknyttede spektre blev genereret ved hjælp af LCMsSpectator-softwaren.55

Specifikke indstillinger for LCMsSpectator inkluderede en precursoriontolerance på 10 ppm, en produktionstolerance på10 ppm, en minimum S/N-tærskel på 1,5, en Pearson-korrelationstærskel på 0,7, en standardudjævning på 9 point, og en relativ intensitetstærskel for prækursorisotop på 0,1.

RESULTATER OG DISKUSSION

Tilføjelse af FAIMS øger kraftigt proteomdækningen

Cortexvævsprøven fra en patient diagnosticeret med Alzheimers blev behandlet efter arbejdsgangen, som vist i figur 1. Vi forsøgte først at analysere ydeevnen af ​​FAIMS på forskellige CV'er i sammenligning med dem uden FAIMS (benævnt "Ingen FAIMS").

Det er værd at huske på, at FAIMS-grænsefladen giver et beskedent tab af iontransmission, formentlig på grund af den længere ionvej gennem kilden.56 Derfor, for bedre at repræsentere typiske forhold og sikre retfærdige sammenligninger, blev "Ingen FAIMS"-dataene indsamlet ved hjælp af den samme prøve uden FAIMS-enheden er installeret.

Disse "Ingen FAIMS"-data blev indsamlet i tre eksemplarer og analyseret i henhold til arbejdsgangen, som vist i figur 1 med en top 6 DDA MS2-analyse. "Ingen FAIMS"-datasættene identificerede i gennemsnit 754 ± 35 proteoformer (figur 2A og tabel S1) og kollektivt identificerede 1073 unikke (ikke-redundante) proteoformer (figur 2B) afledt af 293 unikke gener (figur 2C), der dækker 29.359 aminosyrer på tværs af proteomet (figur 2D).

Den metriske "proteomdækning" (figur 2D) er defineret som ikke-redundante aminosyrer, der er dækket af hver proteoforms sekvens. I det væsentlige tager denne metrik højde for både længden og mangfoldigheden af ​​de identificerede proteoformer.

Vi anser dette for at være en mere afbalanceret metrisk sammenlignet med det rå antal proteoformer og gener, da det undgår skævheder mod mindre proteoformer. Selvom simple optællinger af proteoformer eller gener er intuitive, ser disse målinger ud til at være stærkt påvirket af korte proteolytiske fragmenter. FAIMS-datasættene blev indsamlet fra -50 til -20 CV scannet i trin på 5 V.

Hver af de resulterende 7 CV'er blev indsamlet i tre eksemplarer. Med hensyn til proteoformer og gener klarede FAIMS "Ingen FAIMS" for alle de testede CV'er inden for -50 til -30 CV-området (figur 2A-C).

For eksempel identificerede de tre datasæt ved -50 CV 1833 ± 17 proteoformer, en gennemsnitlig stigning på ~140% pr. kørsel sammenlignet med "Ingen FAIMS". Samlet identificerede disse tre datasæt ved -50 CV 2564 unikke proteoformer fra 530 unikke gener, der dækkede i alt 43.437 aminosyrer, en stigning på henholdsvis 95, 69 og 69% i forhold til de tre "NoFAIMS" datasæt (Figur 2B–D) og tabel S1).

Også selvom FAIMS ved -25V observerer færre unikke proteoformer og gener sammenlignet med "Ingen FAIMS", er proteoformene selv meget længere i gennemsnit. Når man overvejer proteoformlængde (Figur 2D), dækker −25 V-datasættene næsten lige så mange aminosyrer fra proteomet (28.398) i forhold til "No FAIMS" (29.359), hvilket gør det med kun halvt så mange proteoformer (Figur 2B) ).

Vi undersøgte også, om FAIMS kunne give en lige så robust og reproducerbar analyse sammenlignet med uden FAIMS. Vi vurderede kvantificeringsreproducerbarhed ved at beregne RSD (svarende til variationskoefficienten) for hver proteoforms funktionsintensitet, forudsat at proteoformen opfyldte kriteriet om at blive observeret på tværs af alle tre replikatdatasæt for hver CV-indstilling.

Fordi FAIMS- og "No FAIMS"-datasættene alle blev indsamlet fra en enkelt biologisk prøve, bør varians mellem replikaterne udelukkende tilskrives instrumentelle faktorer.

Boksplottet i figur 3 (såvel som individuelle histogrammer i figur S1) viser, hvordan fordelingen af ​​RSD'er sammenlignes mellem FAIMS- og "No FAIMS"-datasættene.

Baseret på median-RSD resulterede tilføjelsen af ​​FAIMS i lignende eller let forbedret kvantificeringskvalitet i forhold til "Ingen FAIMS". Forbedringen i RSD'er blandt lavere spændinger (-20 til -30 CV) kan være relateret til observationen af, at færre proteoformer transmitteres inden for dette område, hvilket giver højere kvalitet MS1-spektre og derfor bedre vurderinger af funktionsintensitet.

Desuden er det værd at bemærke, at RSD'erne bestemt ud fra disse replikater ligner tidligere top-down55 og bottom-up57,58 eksperimenter udført med lignende instrumentering.

Tilsammen viser disse data, at tilføjelsen af ​​FAIMS til TDP kraftigt øger proteoformidentifikationer uden at gå på kompromis med kvantificeringskvaliteten.

Vi undersøgte derefter overlapningen i identifikationer mellem CV'erne, hvilket kunne give det største ikke-redundante sæt observationer.

Ved at bruge overlapskoefficienter, defineret som skæringspunktet mellem to sæt divideret med det mindste af de to sæt, bestemte vi ligheden mellem hvert datasæt. Den samlede gennemsnitlige overlapningskoefficient for både proteoform- og genidentifikationer inden for hvert FAIMS CV var 0.76.

Dette kan sammenlignes med overlapskoefficienten fra "Ingen FAIMS"-datasæt (0.77), hvilket tyder på, at de tekniske replikater viser lignende reproducerbarhed. Et varmekort, der viser FAIMS-overlapningskoefficienterne for proteoforms og gener, er vist i henholdsvis figur 4 og S2.

Navnlig er overlapningen af ​​genidentifikationer på tværs af CV-rummet meget større i forhold til proteoformer, selvom det er særligt bemærkelsesværdigt, når man sammenligner de længste CV-afstande.

For eksempel er overlapningen mellem −50 og −20 CV 0,64 på genniveau og 0,06 på proteoformniveau. Dette var forventet, da hvert gen potentielt kan repræsenteres af flere proteoformer.

Figur 4 viser, at mens en 5−10 V forskel i CV frembringer overlapningskoefficienter for det meste over 0,5, producerer afstande større end 15 V større grader af ulighed og er derfor bedre placeret til at fange tilstrækkeligt forskellige sæt af proteoformer.

Med disse datasæt forfulgte vi derefter at bestemme, hvilke kombinationer af CV'er der er optimale til at opnå maksimal genidentifikation, proteoformidentifikation og sekvensdækning med begrænsninger på antallet af CV'er for hver kombination.

Først etablerede de optimale kombinationer for et vilkårligt antal CV'er fra 1 til 7 ved hjælp af metrikerne for unikke proteoformer, gener og proteomsekvensdækning (figur 5).

Ved at bruge kombinationer begrænset til tre CV'er som et eksempel, viser figur 5A, B, hvordan -35, -40 og -50 V er ideelle, hvis man ønsker at maksimere antallet af proteoformer eller gener.

Proteoformerne og generne identificeret i disse tre CV'er (ni datasæt) dækker 84% af de totalt unikke proteoformer og 92% af de samlede gener over hele sættet af 21 datasæt.

Når man vejer en proteoforms længde med sekvensdækning som metrik, er den ideelle kombination på -30, -40 og -50 CV, der dækker 88 % af de unikke aminosyrer fra alle 21 FAIMS-datasæt med kun et beskedent tab af proteoform og genidentifikationer ( 4221 proteoformer og 723 gener, figur 5C). Disse kombinationer inkluderer dog alle replikater og repræsenterer de maksimale identifikationer, der kunne opnås for en given kombination af CV'er. Derfor, for at demonstrere fordelen ved ekstern CV-stepping, besluttede vi at undersøge, hvilke tal der med rimelighed kunne opnås i gennemsnit med kun tre kørsler, hvor hver kørsel er forskelligt CV.

Ved at bruge -50, -40 og -30 V datasættene som et eksempel, bestemte vi de gennemsnitlige unikke proteoformer, unikke gener og proteomsekvensdækninger baseret på de 27 unikke kombinationer fra de tre forskellige replikater inden for hvert CV.

Baseret på denne analyse kunne vi opnå 2986 (±46) unikke proteoformer og 618 (±12) unikke gener, der dækker 64.534 (±1089) aminosyrer i gennemsnit. Sammenlignet med "No FAIMS" tredobbelte datasæt, som identificerede 1073 unikke proteoformer og 293 unikke gener, der dækker 29.359 aminosyrer, kunne ekstern CV-trin på -50, -40 og -30 V mere end fordoble hver metrik.

Ikke desto mindre vil den optimale kombination af CV'er sandsynligvis også afhænge af organismen og vævet, prøven er afledt af, de anvendte prøveforberedelsestrin samt enhver yderligere offline fraktionering implementeret før LC-MS-analyse.

Samlet set, når det tages sammen med overlapningsanalysen (figur 4), tyder det på, at 15 V eller større afstande mellem CV'er giver den mindste mængde overlap mellem proteoformer, mens 5-10 V adskillelse inden for -50 til -30 CV maksimerer gener, proteoformer og proteomer. sekvensdækning.

For yderligere at bestemme virkningen af ​​FAIMS på dybden af ​​proteomdækningen sammenlignede vi generne identificeret fra vores top-down datasæt med en typisk bottom-up analyse af den menneskelige hjerne.

Omfattende bottom-up-datasæt af humant hjernevæv gjorde det muligt for os at estimere overflod af 8528 proteiner ved hjælp af vægtet spektraltælling.59-61 Proteiner blev bundet ind i 10 forskellige overflodspercentiler baseret på spektraltællinger kompileret fra flere bottom-up-datasæt af den menneskelige hjerne.

Ved at krydsreference med vores top-down-datasæt var vi i stand til at bestemme, hvor generne og proteoformerne er afledt fra og rangeres i form af estimeret proteinoverflod (ved hjælp af datasæt-normaliserede spektraltællinger) i den menneskelige hjerne (figur 6).

Gener, der blev fundet i vores top-down-analyse, men ikke i bottom-up-referencesættet, blev gemt som "NA".

For more information:1950477648nn@gmail.com