Transkriptom- og lipidomprofil af humane mesenkymale stamceller med reduceret alderdom og øget evne til at differentiere trilineage efter lægemiddelbehandling

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

ABSTRAKT

Humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) er multi-potentielle celler, der er meget udbredt i celleterapi. Imidlertid begrænsede den ofte opståede alderdom og faldet i differentieringsevner de brede anvendelser af MSC. Adskillige strategier, såsom behandling af små molekyler, er blevet bredt undersøgt og brugt til at forbedre stammekarakteristika ved at omgå ældning, men de nøjagtige mekanismer for dem til at reducere ældning er ikke blevet fuldt ud undersøgt. I denne undersøgelse blev hMSC'er behandlet med rapamycin, oltipraz, metformin og C-vitamin i det angivne tidsrum, og disse celler blev udsat for senescence-evaluering og trilineage-differentiering. Desuden blev transkriptomiske og lipidomiske datasæt af hMSC'er efter lægemiddelbehandling analyseret for at fortolke biologiske veje, der er ansvarlige for deres anti-ældningseffekter. Selvom fire lægemidler udviste betydelige aktiviteter i at fremme MSC osteogen differentiering, er metformin det optimale lægemiddel til at fremme trilineage differentiering. GO-udtryk illustrerede, at lægemidlers anti-aldringseffekt hovedsageligt var forbundet med cellulær senescens, mitotiske og meioseprocesser. Biosyntese af phosphatidylcholiner (PC) og phosphatidylethanolamin (PE) blev hæmmet, mens produktionen af ​​phosphatidylinositoler (PI'er) og mættede fedtsyrer (SFA)/mono-umættede fedtsyrer (MUFA) omdannelse blev aktiveret. Mediumfrie fedtsyrer (FFA) blev øget i hMSC'er med forskellige anti-aldringsfænotyper. Derfor etablerede vi en omfattende metode til vurdering af lægemiddelintervention baseret på resultaterne af transkriptomik og lipidomik. Metoden kan bruges til at studere forskellige biologiske fænotyper ved lægemiddelintervention i MSC, hvilket vil udvide den kliniske anvendelse af hMSC'er.

Klik venligst her for at vide mere

INTRODUKTION

Aldring, en tidsafhængig proces, vil forårsage fysiologisk dysfunktion. Aldring er den primære risikofaktor for mange sygdomme, herunder kræft, neurodegenerative sygdomme og diabetes. Stamcelleudmattelse og cellulær senescens er et af de kendetegn, der bestemmer fysiologisk fænotype under aldring [1]. Humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) er multi-potentielle celler, der præsenteres i knoglemarv, fedtvæv, placenta, navlestreng, muskler og mange andre væv [2-6]. Under afstamningsspecifikt medium kan hMSC'er gennemgå differentiering til adipocyt, osteoblast og chondrocytter såvel som andre cellelinjer in vitro. Derfor spiller hMSC'er vigtige roller i regenerativ medicin og celleterapi. Imidlertid er den kliniske brug af MSC begrænset af ældningen under den længere dyrkning in vitro. hMSCs aldring var normalt forbundet med ændringen af ​​telomerlængde, celletæthed, proliferationspotentiale, tilineagedifferentieringspotentiale, epigenetik, mitokondriel funktion og sekretom [7]. Derfor berettiger overvindelse af MSC-aldring mere dybdegående undersøgelser for at udforske strategierne til at hæmme hMSC-ældning. Metformin (TAME) er det første lægemiddel, der blev godkendt i et klinisk forsøg til at forsinke aldring [8] og er også et FDA-godkendt førstelinjelægemiddel til behandling af type e 2 diabetes mellitus [9].cistanchDen pinefulde Nrf2-vej menes at være den underliggende mekanisme for metformin til at mediere levetidsforlængelse [10]. Oltipraz, et antischistosomalt middel, blev også brugt til at hæmme cancerprogression via NRF2-vejen i en gnavermodel[11, 12]. Det blev også rapporteret, at oltipraz udviste en anti-aldringseffekt ved at undertrykke antioxidanten NRF2-vejen [13]. Desuden blev rapamycin (Sirolimus) brugt til at belægge koronare stenter, forhindre afstødning af organtransplantationer og behandle lymfangioleiomyomatose [14]. Det blev rapporteret, at rapamycin kunne hæmme aktiveringen af ​​T-celler og B-celler gennem mTOR-hæmning [15], hvilket er blevet yderligere bekræftet af forværringen af ​​mangel på stamceller [16]. C-vitamin er et velkendt reduktionsmiddel og er blevet rapporteret at lindre aldring i Werner syndrom stamcellemodellen[17]. Men om de delte lignende veje til at udøve deres roller i anti-aldring og de specifikke mekanismer til at undertrykke cellulær aldring hos mennesker, er stadig uklart. Desuden blev transkriptomet og lipidomet for disse MSC behandlet af de fire lægemidler ikke fuldt ud undersøgt, hvilket tilskyndede os til at udføre nedenstående eksperimenter for at løse disse vigtige spørgsmål.

Cistanche kan anti-aging

I denne undersøgelse blev metformin, oltipraz, rapamycin og C-vitamin brugt til at behandle knoglemarvs-hMSC'er (BM-hMSC'er). For det første blev differentieringsfænotyper af hMSC'er efter behandling karakteriseret for at illustrere deres anti-aging potentialer. Transcriptomics og lipidomic analyse blev udført på de lægemiddelbehandlede celler. Bagefter blev GO-analyse baseret på transcriptomics-datasættet udført for at forankre signalbegivenhederne, der er ansvarlige for senescens og anti-aldringsaktiviteter. Metabolisk profilering og pathway-analyse blev udført, som illustrerer en fluktuation af lipidproduktionen under lægemiddelbehandling. Alt i alt har vi etableret et overordnet evalueringssystem for lægemiddelintervention på hMSCs senescens. Systemet kan bruges til at studere forskellige biologiske fænotyper ved lægemiddelintervention i MSC, hvilket vil udvide den kliniske anvendelse af hMSC'er.

RESULTATER

BM-hMSC udsættes for senescens efter lang tids dyrkning in vitro

BM-hMSC'er er multipotente stamceller med fælles egenskaber for selvfornyelse og differentiering til forskellige celletyper. Men med passagen stigende in vitro, bliver celler gradvist udsat for ældning og vil miste størstedelen af ​​deres differentieringsevner. Status for BM-hMSC'er blev analyseret ved forskellige passager (P2, P8, P13), og cellens tilstand blev værre, bevist ved opbremsningen af ​​celleproliferation, stigningen i dødsfald og forlængelsen af ​​morfologien (Figur 1A). Desuden blev trilineage differentieringsevnerne af P8 BM-hMSC'er også testet. Som vist i figur 1B, sammenlignet med det fra vores tidligere undersøgelser [18], er differentieringsevnerne af P8 BM-faldet, men kan stadig differentiere til osteoblaster, adipocytter og chondrocytter under induktionsmedium.cistanche AustralienIfølge in vitro MSC-ældningsmodellen som rapporteret [18], behandlede vi yderligere BM-hMSC'er med fire kandidatlægemidler, der sigtede mod at gribe ind i senescensen in vitro. Som vist i figur iC blev celler udpladet i en 24-brøndplade med en tæthed på 60 procent, og lægemidler blev tilsat til cellerne efter 48 timer. Supernatanten af ​​celler blev opsamlet hver tredje dag syv gange. På dag 21 efter lægemidlet

(Supplerende figur 1A). Oltipraz, rapamycin og C-vitamin kan effektivt forbedre differentieringspotentialet, som var direkte proportionalt med antagonismen af ​​senescens (Supplerende figur 1B). Interessant nok viste kun oltipraz en positiv effekt på adipocytdifferentieringsmedium (Supplerende figur 1C, 1D).cistanche fordele,Sammenfattende er oltipraz det bedste lægemiddel til at forbedre trilineage differentieringsevner, rapamycin og vitamin C kunne effektivt forbedre osteogent og chondrogen differentieringspotentiale, mens metformin kun udviser en begrænset positiv effekt på osteogen differentiering.

Transkriptomisk profil af lægemiddelbehandlede BM-hMSC'er I betragtning af, at alle fire lægemidler kunne modvirke ældning af BM-hMSC'er med forskellig effektivitet, forsøgte vi derefter at udforske de underliggende mekanismer for deres særskilte virkning ved at undersøge den transkriptomiske profil af BM-hMSC'er ved lægemiddelbehandling . Vi beregnede fold-ændringen af ​​genekspression mellem hvert lægemiddelkontrolpar. For hvert lægemiddelkontrolpar blev de differentielt udtrykte gener (DEG'er) med fold-ændring over 2 udvalgt, som indeholder både opregulerende og nedregulerende gener (Supplerende tabel 1). Vi fik 1758 gener i alt efter at have analyseret alle DEG'erne fra de lægemidler, der blev behandlet med BM-hMSC'er (Figur 3A). For at undersøge funktionerne af DEG'erne identificerer vi de berigede genontologi(GO) termer ("p<0.01) based="" on="" each="" drug's="" degs="" [19](supplementary="" table="" 2).="" these="" enriched="" go="" terms="" represent="" the="" functions="" influenced="" by="" the="" drugs.="" furthermore,="" we="" plot="" the="" venn="" diagram="" to="" study="" the="" similarity="" and="" specificity="" of="" the="" enriched="" go="" terms.="" as="" shown="" in="" figure="" 3b,="" although="" each="" drug="" has="" its="" unique="" regulated="" go="" terms,="" the="" drugs="" also="" share="" a="" common="" go="" which="" suggests="" that="" there="" are="" common="" functions="" influenced="" by="" all="" four="" drugs.="" these="" common="" go="" terms="" may="" associate="" with="" the="" effects="" of="" the="" drug="" on="" senescence="" alleviation="" and="" trilineage="" differentiation="">

Tolv almindelige GO-termer blev delt af fire lægemidler (Figur 3B, 3D), hvoraf hovedsageligt var beriget i negativ regulering af cellemotilitet (Figur 3E), positiv regulering af actomyosin strukturorganisation, regulering af cellulær proces og cellulær komponentorganisation, organisering af cytoskelet. , makromolekyle katabolisk proces, regulering af celleproliferation, protein katabolisk proces og lille GTPase-medieret signaltransduktion (figur 3C, 3E). Disse funktioner er tæt forbundet med celleskæbne, især alderdomsrelaterede fænotyper.

Efter at have analyseret de almindelige GO-termer mellem metformin og oltipraz fandt vi ud af, at de deler samme funktion som NRF2-agonisterne. Som vist i figur 3F blev funktionen af ​​cellecyklussen, makromolekylets kataboliske proces og nuklear kappeorganisation opreguleret. Desuden blev funktionen for komponentbevægelse, cellemigration/adhæsion og respons på vitamin E/organisk cyklisk forbindelse/lipid nedreguleret (figur 3G). Disse resultater indikerede i det hele taget, at metformin og oltipraz kan påvirke celledifferentieringsevner, celleskæbne og cellemetabolisme. Da oltipraz er det bedste lægemiddel til at forbedre trilineage differentieringsevner, søgte vi yderligere at identificere de specifikke veje, der ændres af oltipraz. Interessant nok var de berigede 85 GO-udtryk hovedsageligt relateret til cellulær senescens, cellecyklus, mitotisk og meioseproces, cellulær respons på lægemidler, vitamin, cAMP, DNA-skadestimulus, næringsstof og osmotisk stress (Supplerende figur 2A, 2B). Lipidomics-profil af lægemiddelbehandlede BM-hMSC'er For at undersøge den globale fluktuation af lipider med hensyn til BM-hMSC's osteogene differentiering ved lægemiddelbehandling, blev den LC-MS-baserede lipidomics-profileringsanalyse udført. I alt 139 lipidarter blev identificeret i cellulært lipidom, inklusive lysophosphatidylethanolaminer (LPE), 21 PE'er, 4 PE-O'er, 4 phosphatidylinositoler (PI), 5 phosphatidylseriner (PS), 8 Ceramider (Cer), 4 Cerys, 11 sphingomyeliner (SM), 6 diacylglycerider (DG), 18 triacylglycerider (DG), 18 TG) og 20 frie fedtsyrer (FFA) (figur 4A-4M). Ifølge clustering-stoffet udviste celler behandlet med oltipraz de største variationer af lipider, hvilket var i overensstemmelse med dets bedste effekt på lindring af celleældning og forbedring af trilineage-differentiering. I detaljer blev monophosphatidylglycerol-LPC'er øget i oltipraz-behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollen, hvorimod deres modstykker pc'er og PE'er blev nedreguleret (figur 4B, 4D, 4E). Niveauerne af PI'er og SFA'er er også forhøjede, mens niveauet af Ceres og MUFA'er blev reduceret (figur 4F, 4L, 4H, 4M). Disse resultater

Lipidomics- og transcriptomics-baseret pathway-analyse i lægemiddelbehandlede hMSC'er

For yderligere at undersøge de underliggende mekanismer til forbedring af trilineage-differentiering af oltipraz blev pathway-analyse udført baseret på de lipidomiske og transkriptomiske datasæt. Som vist i figur 5A var CDP-Diacylglycerol Synthase 1(CDS1) det eneste enzym, der var opreguleret i oltipraz-behandlede celler, hvilket kan være årsagen til at forårsage forhøjelse af PI'er og reduktion af pc'er. Imidlertid var den nedregulerede lecithin-cholesterol-acyltransferase (LCAT) og uændret lysophosphatidylcholinacyltransferase3 (LPCAT3) inkonsistente med de øgede LPC'er, hvilket tyder på, at de overdrevent producerede LPC'er muligvis ikke syntetiseres fra pc'er/Pes (figur 5A). Interessant nok kunne der observeres en åbenlys konvertering mellem SFA'er og MUFA'er (figur 5B). Stigningen i mættede fedtsyrer (SFA) og faldet i MUFA'er kan skyldes den nedregulerede stearoyl-CoA-desaturase (SCD). Dette layout har en tendens til at afsløre mekanismen for den nedsatte aktivitet af lipogenese efter behandling med oltipraz. Selvom oltipraz-behandling kunne reducere produktionen af ​​Ceres, blev konverteringerne medieret af biler ikke væsentligt ændret (figur 5C).

Globale profiler af lipidarter i hMSCs supernatant efter lægemiddelbehandling

Ydermere blev de lipidomiske ændringer i mediet karakteriseret for grundigt at undersøge lægemidlers indflydelse på hMSC'er. Som vist i supplerende tabel 3 viste klyngeanalyse, at lipiderne blev klassificeret i to klynger, dvs. størstedelen af ​​FFA'er og andre lipider (ikke-FFA'er).cistanche kolesterolSom vist i figur 6 udviste FFA'er i fire grupper tydelige ændringer ved forskellige behandlingsperioder. I modsætning hertil viste ikke-FFA'er små udsving i fire grupper (figur 6A-6D). FFA'erne var signifikant forhøjet på tidlige stadier i alle grupper (figur 6E-6H).cistanche deserticola bivirkningerDesuden steg FFA'er i celler induceret af metformin (figur 6E), oltipraz og C-vitaminbehandling hurtigt fra det 2. tidspunkt til det 3. tidspunkt. I cellerne behandlet med rapamycin blev FFA'er imidlertid forhøjet fra listen til det andet tidspunkt (figur 6F-6H). Interessant nok viste FFA'er i metforminbehandlede celler et større fald end i de andre tre grupper (figur 6E). Derefter kunne der ses en lille stigning i FFA'er i oltipraz- og vitamin C-behandlingsgruppen, mens FFA'er fra det 4. til det 5. tidspunkt viste et lille fald i metforminbehandlingsgruppen (figur 6E, 6F, 6H).

I rapamycin-behandlede celler blev niveauer af FFA'er grundlæggende opretholdt fra det 3. til det 5. tidspunkt. Specifikt, som vist i Supplerende Figur 3 og Supplerende Tabel 4, kunne ændringsmønstrene for FFA'er yderligere klassificeres i 8 klynger. Deri viste klynge 6, der hovedsageligt bestod af SFA'er, det samme layout som dem, der blev vist i oltipraz- og vitamin C-gruppen, mens klynge I grundlæggende var det samme som rapamycingruppen. Generelt blev medium-FFA'erne i alle grupper undtagen metformin globalt øget sammen med induceringen, hvilket tyder på sammenhængen mellem FFA'er i det interne kulturelle miljø og celleældning. Celler induceret af metformin og C-vitamin bidrog med en lignende indflydelse til SFA'erne i det indre miljø sammenlignet med rapamycininduktion (figur 6A, 6D, 6E, 6H).

Den generelle strategi til at studere anti-aging virkninger af lægemidler i hMSC'er

For at opsummere, som vist i figur 7, for at karakterisere anti-aldringseffekterne af fire lægemidler i hMSC'er, blev der udført en systematisk undersøgelse baseret på workshoppen bestående af fænotypekarakterisering, transkriptomik, cellelipidomics og medium lipidomic analyse. Oltipraz lindrede senescens og forbedrede trilineage-differentieringseffektivitet ved at fremme produktionen af ​​PI'er, hæmme biosyntesen af ​​PC'er/PE'er og blokere omdannelsen fra SFA til MUFA. GO-termer illustrerede også fænotypen forbundet med cellulær senescens, mitotisk og meioseproces, cellulær respons på DNA-skadestimulus, ammoniumion og oxygenniveauer. Interessant nok blev NRF2-vejen reguleret af både oltipraz og metformin for at fremme celledifferentiering i forskellige grader. I mellemtiden demonstrerede medium-lipidomics-layoutet de kritiske roller af medium FFA'er i MSC-differentiering i flere celletyper. Derfor giver den multidimensionelle strategi flere perspektiver til at fortolke forskellige effekter af lægemiddelintervention på hMSCs senescens. Denne metode kan bruges til at studere forskellige biologiske fænotyper ved lægemiddelintervention i MSC, hvilket vil udvide den kliniske anvendelse af hMSC'er.

DISKUSSION

Den nye coronavirus-sygdom 2019 (COVID-19) er vokset til at blive en global nødsituation for folkesundheden. I øjeblikket var der ingen specifikke lægemidler til at beskytte patienterne mod immunmodulerende virkninger. Det blev rapporteret, at anvendelsen af ​​MSC i COVID-19 alvorlige tilfælde forbedrer patienternes resultat ved at regulere kroppens inflammatoriske reaktion og fremme lungevævsreparation og -regenerering [20]. Imidlertid hæmmede hyppigt opstået senescens af hMSC'er under længere tids kultur in vitro den kliniske anvendelse af hMSC'er. I denne undersøgelse etablerer vi et in vitro-lægemiddelscreeningssystem baseret på BM-hMSCs senescensfænotype [21]. Mange undersøgelser udførte aldringsrelateret interventionsforskning for hMSC'er baseret på manipulation af TF'er [22-27] og anvendelse af forskellige lægemidler [10. 13,17,28,29]. Vi er imidlertid de første til grundigt at vurdere anti-aldringseffekten af ​​forskellige lægemidler på BM-hMSC'er ud fra perspektivet af SA- -gal aktivitet og differentieringseffektivitet. Rapamycin, oltipraz, metformin og C-vitamin er de fire traditionelle lægemidler, der først bruges til hMSCs aldringsintervention. Selvom alle de fire lægemidler modvirker BM-MSC-ældning, var de nøjagtige virkninger og underliggende mekanisme af de fire lægemidler til at fremme celledifferentiering forskellige. Endnu vigtigere er det, at vi også etablerer et overordnet evalueringssystem for lægemiddelintervention ved integreret analyse af transkriptomics og lipidomic profiler i cellesupernatanter og lysater. I detaljer blev transkriptomiske data fuldt ud analyseret i kombination med fænotypen af ​​stamceller efter lægemiddelbehandling for at udforske den ændrede vej og underliggende mekanismer påvirket af lægemiddelbehandling. Desuden blev lipidændringsmønsteret af celler behandlet med forskellige lægemidler på forskellige tidspunkter bestemt af LC-MS. Desuden blev lægemiddelspecifikke metaboliske veje og lægemiddelrelaterede lipidændringer analyseret og opsummeret gennem integration af data fra transkriptomik og lipidmetabonomisk.

Oltipraz er det bedste lægemiddel til at forbedre differentieringsevnen hos BM-hMSC'er blandt fire lægemidler. De DEG'er, der blev påvirket af oltipraz-behandling, var hovedsageligt beriget i cellulær alderdom, cellecyklus og cellulær respons på lægemidler, cAMP og så videre. Disse ændringer spiller kritiske roller i cellulær aldring. Oltipraz og metformin, Nrf2 pathway-hæmmerne, påvirkede imidlertid almindelige regulatoriske veje [30], som hovedsageligt berigede celledifferentieringsevner, celleskæbne og cellemetabolisme. Som en hæmmer af mTOR-vejen kunne rapamycin forhindre cellulær senescens [31, 32] Konsekvent fandt vi også ud af, at rapamycin spiller den bedste rolle i at fremme den osteogene differentiering, som hovedsageligt gennem regulering af fosfatholdige sammensatte metaboliske procesveje, cellulær komponentorganisation, cellekommunikation, signaltransduktion, makromolekylebiosynteseproces, cellulær proteinmetabolismeproces og skeletsystemudvikling. C-vitamin er et velkendt reduktionsmiddel, og det spiller den bedste rolle i at fremme celleproliferation sammenlignet med de tre andre lægemidler, men der var ingen signifikant effekt i forbedringen af ​​MSC's trilineage differentieringsevner. Disse fænotyper kan være forårsaget af responsen på cytokin/lipid/oxidativ stress og positiv regulering af katalytisk aktivitet (Supplerende figur 4).

Lipider har vist sig at spille uerstattelige roller i differentieringen af ​​stamceller [33]. Vi har tidligere fundet ud af, at stigningerne i membranglycerophospholipider inklusive PC'er og PE'er, et kendetegn for alderdom, blev observeret globalt i de gamle MSC'er [18]. I den aktuelle undersøgelse blev reduktionerne i PC'er og PE'er observeret i cellerne behandlet med oltipraz, som klarede sig bedst til at forsinke ældning af MSC'er. PC'er og PE'er er lipiderne med den højeste overflod i konstruktionen af ​​eukaryote membraner 34]. De øgede niveauer af PC'er og PE'er i sera er blevet vist hos ældre mennesker sammenlignet med yngre individer [34]. Interessant nok var PI'er, at minoritets-GPL'erne faldt i gamle MSC'er i vores tidligere observationer. I denne undersøgelse blev PI'er dramatisk forhøjet i alle inducerede celler. Mekanisk antydede pathway-analyse, at stigningerne i PI'er kan være forbundet med den aktiverede CDS1.CDS1-kinase har vist sig at deltage i reguleringen af ​​ROS-signalering og yderligere påvirke ekspressionen af ​​gener, der fungerede i oxidativ resistens [35]. En anden væsentligt blokeret metabolisk flux er omdannelsen fra SFA til MUFA medieret af SCD. Som et biobarometer for lipogenese er den aktiverede SFA/MUFA blevet observeret i en række sygdomme som cancer og ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD)[36,37] Lignende resultater er også observeret i gamle mus, hvilket afspejler den unormale metabolisme af lipider i leveren under aldring [38]. Samlet set kan vores strategi bruges i anti-aging lægemiddelscreening og molekylær mekanisme udforskning efter lægemiddelbehandling i stamceller og cancer. Ved at kombinere strategien med evalueringssystemet kan vi udføre overvågning i realtid baseret på stamcellers ældningsrelaterede status for at opdage nye lægemidler, som vil blive brugt i stamcelleterapier.

Denne artikel er hentet fra www.aging-us.com