Total Glycosider Of Cistanche Deserticola fremmer neurologisk funktionsgendannelse ved at inducere neurovaskulær regenerering via Nrf- 2/Keap-1-vej hos MCAO/R-rotter-Ⅰ

INTRODUKTION

Slagtilfælde anses for at være en væsentlig årsag til dødsfald og handicap i verden. Næsten 87 % af alle slagtilfælde udløses af iskæmisk slagtilfælde. I øjeblikket er det mest effektive middel og det eneste FDA-godkendte lægemiddel, der bruges tilbehandling af iskæmisk slagtilfældeer rekombinant vævsplasminogenaktivator. Men en stor mængde af slagtilfældepatienter reagerer ikke på dette lægemiddel på grund af dets snævre terapeutiske tidsvindue og en alvorlig risiko for hæmoragiske komplikationer. En stor udfordring ved trombolytisk behandling er iskæmi/reperfusion (I/R) skade, som anses for at være en hovedårsag til hjerneskade og funktionsdestruktion. Reperfusion efter cerebral iskæmi øger risikoen for en hjerneblødning, mens den fører til neurovaskulær skade og producerer overdreven reaktive oxygenarter (ROS), som beskadiger blod-hjerne-barrieren. Adskillige undersøgelser har bekræftet, at forstyrrelsen af ​​BBB er en væsentlig årsag til patogenesen af ​​iskæmisk slagtilfælde.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL BEHANDLING ISkæmisk slagtilfælde PHGS75% ECH 30% ACT 12%

BBB består hovedsageligt af endotelceller, pericytter, astrocytter, neuroner og basalmembranerne. Kernekomponenterne i BBB er cerebrale mikrovaskulære endotelceller, der er forbundet med tætte forbindelser, og dermed begrænser eksogene molekyler ind i hjernen. De patologiske ændringer af tight junctions - især occludin, claudin-5 og zonula occludens-1 (ZO-1) - påvirker BBB-funktionen signifikant under et iskæmisk slagtilfælde, især barrierepermeabilitet. Under I/R-perioder er overdreven ROS en af ​​hovedfaktorerne, der fører til direkte skade på hjerneneuroner. ROS-overproduktion fører til nedbrydning af visse junctions og BBB-forstyrrelser, hvilket resulterer i, at eksogene molekyler kommer ind i hjernen gennem BBB, hvilket fører til forværring af hjerneskade. Derfor er beskyttelse af BBB med antioxidanter blevet betragtet som en potentiel måde at forhindre reperfusionsskade.

Udover nedbrydningen af ​​BBB kan I/R resultere i neurovaskulær skade og neuronal død. Under et slagtilfælde kan øget neuronal celledød skyldes oxidativt stress, og talrige undersøgelser har vist, at ROS forværrer sværhedsgraden af ​​slagtilfælde og neurologiske skader. Selvom kliniske forsøg ikke har fået tilfredsstillende resultater, er neurobeskyttelse stadig en lovende strategi til behandling af akut iskæmisk slagtilfælde. At finde effektive neurobeskyttelsesmidler til behandling af slagtilfælde er således en fordel for patienter med slagtilfælde.

Traditionel kinesisk medicin (TCM) tager foranstaltninger til at gribe ind mod kroppens indre ubalance. På grund af den komplekse patogenese af iskæmiske slagtilfælde spiller den multifaktorielle virkning af TCM og dets aktive bestanddele en kritisk rolle i behandlingen af ​​slagtilfælde.Cistanchedeserticola YC Ma, udbredt i tørre eller halvtørre områder i hele Mongoliet og det nordvestlige Kina, har været en meget brugt TCM-urt til behandling af forskellige sygdomme såsom glemsomhed og depression i mere end 1,000 år i Kina. Moderne farmakologiske undersøgelser indikerede, at råekstrakterne fra C. deserticola viste flere farmakologiske aktiviteter, som f.eks.forbedring af indlærings- og hukommelsesfunktion, neurobeskyttelse, immunitet, antioxidant-, anti-aldrings- og antitræthedseffekter. Kemisk analyse af C. deserticola viste, at dens hovedbestanddele omfatterphenylethanoid glycosider, iridoid glycosider, polysaccharider og oligosaccharider. De aktive komponenter af C. deserticola til hjernebeskyttelse er dog ikke særlig klare.

Den neurobeskyttende egenskab af C. deserticola indebærer dets terapeutiske potentiale i kognitivt relaterede sygdomme såsom slagtilfælde og depression, såvel som Alzheimers sygdom. Forskningen i virkningen af ​​C. deserticola på slagtilfælde, herunder dens aktive komponenter og virkningsmekanismer, er dog meget begrænset. I det nuværende arbejde undersøgte vi den beskyttende effekt af tre ekstrakter fra C. deserticola, totale glycosider (TG'er, phenylethanoid glycosider og andre glycosider), polysaccharider (PS'er) og oligosaccharider (OS'er) på cerebrale I/R-skader. Vores resultater kan bidrage til den nøjagtige kliniske anvendelse af C. deserticola og give et kandidatmiddel tiliskæmisk slagtilfældebehandling.

MATERIALER OG METODER

Kemikalier og reagenser

Stænglerne af Cistanche deserticola blev købt fra Alashan, Indre Mongoliet, og identificeret af en af ​​forfatterne (P.-F. Tu). TG'er, PS'er og OS'er blev fremstillet i overensstemmelse med vores tidligere rapporterede metode. Kvantitativ analyse af TG'er blev udført ved højtydende væskekromatografi (HPLC) som tidligere beskrevet, og dets kromatogram er vist i figur 1. Hovedkomponenterne i TG'er er echinacosid, tubulosid A, acteosid, isoacteosid og 2'-acetylacteosid; deres indhold er henholdsvis 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g og 12,045 mg/g. Indholdet af PS'er og OS'er er henholdsvis 69,42% og 65,24%, som bestemt ved henholdsvis HPLC og phenol-svovlsyreanalysen.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL BEHANDLING AF ISkæmisk slagtilfælde PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Standardreferencerne for echinacosid (A0282), tubulosid A (A0942), acteosid (A0280), isoacteosid (A0281) og 2'-acetylacteosid (A0943) blev købt fra Chengdu Must Biotechnology. Renheden af ​​alle standarder er mere end 98%. Nissl stain H&E kits blev købt hos Boster. Edaravone (T0407-1) ​​blev købt fra Target Mol (Shanghai, Kina). Kanin anti-rotte MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) og muse anti-rotte CD31 (ab24590) blev købt fra Abcam Inc. Rabbit anti-rotte Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) og Occludin (BS72035) blev købt fra Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) var kilden til kanin-anti-rotte Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) blev købt fra Proteintech Group, Inc. Sekundære antistoffer blev leveret af Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, Kina). Hoechst 33258 blev opnået fra Beyotime.

Dyr

Sprague-Dawley-rotter (han, der vejer 250-300 g) blev opnået fra Vital River Laboratory Animal Technology og anbragt i et airconditioneret rum holdt i en 12 timers lys/mørke-cyklus. Alle dyreforsøg blev udført af dyreforsøgsretningslinjerne ARRIVE og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Peking University Health Science Center.

Dyreforsøgsprotokoller

Rotterne blev udsat for MCAO/R, som tidligere beskrevet (Wang et al., 2018). Kort fortalt blev den venstre almindelige halspulsåre (CCA), den ydre halspulsåren (ECA) og den indre halspulsåren (ICA) blotlagt, og en 3-0 nylon monofilamentsutur blev indsat fra ECA'en ind i ICA, indtil den nåede midten cerebral arterie (MCA). Efter 1,5 timers MCA-okklusion blev reperfusion simuleret ved at fjerne filamentet. Under den kirurgiske procedure blev kropstemperaturen for alle rotter holdt på 37,0 grader. Medicin

Administration

Rotterne blev tilfældigt adskilt i seks grupper ved hjælp af SPSS-softwareversion 22.0 som beskrevet: normal gruppe (NOR); modelgruppe (MOD); edaravongruppe (positivt lægemiddel, 6 ml/kg, EDI); TG'er-gruppe (280 mg/kg, TG'er); PSs-gruppe (280 mg/kg, PSs) og OSs-gruppen (280 mg/kg, OSs). TG'er, PS'er og OS'er blev administreret en gang om dagen efter MCAO/R i 14 dage. NOR- og MOD-grupperne blev behandlet med normalt saltvand. Dyrenes antal er vist i tabel 1.

Måling af vægt og modificeret neurologisk deficit-score (mNSS)

Kropsvægten blev overvåget på den 14. dag ved hjælp af en ADVENTURE™ Digital Scale (OHAUS, New Jersey, USA). mNSS blev vurderet efter metoden beskrevet af FJ Wang (Wang et al., 2018), med mindre revisioner.

2, 3, 5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) farvning

Infarktvolumen blev målt som beskrevet tidligere. Kort sagt blev hjernerne opdelt i syv koronale blokke (2 mm). Disse sektioner blev farvet med 2% TTC ved 37 grader i 15 min. Infarktvolumen (%)=(ipsilateral iskæmisk hemisfærevolumen -kontralateral iskæmisk hemisfærevolumen)/kontralateral iskæmisk hemisfærevolumen × 100.

Nissl og H&E Farvning

Rotterne blev dybt bedøvet, og hele hjernen blev derefter hurtigt fjernet fra kraniet fikseret under anvendelse af 4% paraformaldehyd indlejret i paraffinvoks og snittet i skiver af 7 µm tykkelse. Sektionerne blev farvet med Nissl og H&E. I denne undersøgelse blev seks tilfældige 200 × 200 µm felter fanget i hver vævsprøve med et lysmikroskop. Antallet af Nissls lig blev talt med IPP-softwareversion 6.0.

Evans Blue Assay

Rotter blev injiceret med 2% EB efter MCAO/R. To timer senere blev rotterne bedøvet, og hele hjernen blev derefter hurtigt fjernet og homogeniseret i acetone. Supernatanterne blev analyseret ved 620 nm af en 800 TS absorbanslæser.

Måling af aktiviteterne af katalase (CAT), superoxiddismutase (SOD), malondialdehyd (MDA) og glutathionperoxidase (GSH-Px)

Alle serumprøver blev centrifugeret ved 4,000 x rpm i 15 minutter ved 4 grader og derefter analyseret for at påvise aktiviteterne af MDA, CAT, SOD og GSH-Px efter producentens instruktioner.

Western blotting-analyse

Hjernevæv (100 mg) opsamlet fra hver rotte blev homogeniseret og lyseret i RIPA-lysebuffer og derefter analyseret for at påvise proteinkoncentrationen under anvendelse af et BCA-kit. Vævs-totalproteiner blev fyldt på 10% SDS-PAGE-geler og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret under anvendelse af 5 % skummetmælk, derefter inkuberet natten over med primære antistoffer ved 4 grader. Membranen blev derefter inkuberet med et sekundært antistof. Western blot-analyse blev analyseret under anvendelse af Kodak Digital Imaging System.

Immunfluorescensanalyse

Immunfluorescensfarvning for CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 og Keap-1 blev udført. Primære antistoffer mod Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 og Keap-1 blev fortyndet til 1 :200 og 1:100, henholdsvis. De sekundære antistoffer af Alexa Flur 488 mus anti-kanin IgG og rhodamin (TRITC) gede anti-kanin IgG blev begge fortyndet til 1:200. Kernerne blev farvet af Hoechst 33258. Billeder blev optaget ved hjælp af Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA). Proteinekspressionen blev analyseret ved hjælp af IPP-softwareversion 6.0. Statistisk analyse

Alle data blev beskrevet som middel ± SD. SPSS-softwareversion 22.0 blev udført til statistisk analyse. Envejs ANOVA blev brugt ved sammenligning af forskellige grupper. P < 0.05 blev anset for at være den statistiske forskel.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL ANTI-ISKEMISK SYGDOM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RESULTATER

TG'er øger kropsvægten og reducerer hjerneskader hos MCAO/R-rotter

Efter 14 dages helbredelse med TG'er, PS'er, Oss og EDI blev kropsvægten, neurologiske underskud og infarktvolumener af I/R-rotter evalueret. Resultaterne viste, at kropsvægtene i MOD-gruppen var stærkt reduceret, mens de reducerede vægte i TG'er, PS'er og EDI-grupper blev øget (figur 2A). Neurologiske underskudsscore blev væsentligt sænket af EDI og TG'er (figur 2B). Hjerneskiverne i NOR-gruppens rotter var dybrøde, og der var ingen infarkter, mens rotterne i MOD-gruppen viste et stort ipsilateralt hjerneinfarkt. Efter TGs-behandling blev infarktvolumenerne signifikant reduceret (figur 2C, D). Behandlingen med PS'er og OS'er viste ingen tydelig effekt på ovenstående indekser. Ovenstående data viste, at TG'er markant kunne lindre den I/R-inducerede cerebrale skade, men PS'er og OS'er kunne ikke.

TG'er forbedrer histopatologiske skader hos MCAO/R-rotter

For at bestemme nogle af virkningerne af TG'er, PS'er og OS'er-behandlinger på histopatologisk skade, blev H&E-farvning udført for at afsløre patologisk skade. De histomorfologiske strukturer af hjerner i NOR-gruppen blev arrangeret regelmæssigt. Morfologiændringerne i TGs-grupperne var mindre end dem i MOD-gruppen. PS'er og OS'er-behandlingsgrupperne viste imidlertid ingen signifikant forbedring af morfologiændringerne (figur 3).

TG'er dæmper neuronal skade efter I/R-inducerede rotter

Nissl-farvning viste de histopatologiske ændringer af neuroner i penumbraen i det iskæmiske område. Som vist i figur 4 havde de normale neuroner en klar nukleolus og intakt struktur. I MOD-gruppen havde neuronerne forstørrede intercellulære rum. De nissl-kroppe forsvandt, krympede og dybt plettede. Disse ændringer blev dog sjældent observeret i EDI-, TGs- og PS-grupperne. Disse resultater illustrerede, at TG'er og PS'er kunne signifikantdæmpe iskæmi/reperfusionsinduceret neuronal skade.

TG'er dæmper BBB-afbrydelse efter I/R-behandlede rotter

Evans blue assay er en klassisk metode til at undersøge ændringen af ​​BBB permeabilitet. Eksperimentresultaterne viste, at øget Evans-blåt blev observeret i MOD-gruppen, mens der var signifikant nedsat Evans-blåt i TG'erne og EDI-behandlede rotter. Desuden var der ingen signifikant forskel mellem PS'er og OS'er terapigrupper (figur 5). Disse resultater antydede, at TG'er signifikant kunne dæmpe BBB-forstyrrelser.

TG'er fremmer angiogenese hos I/R-skadede rotter

Nyere undersøgelser viser, at angiogenese spiller en kritisk rolle i neurologisk funktionel genopretning og prognostiske resultater efter akut iskæmisk slagtilfælde (Yuen et al., 2015). For at evaluere virkningerne af TG'er, PS'er og OS'er på angiogenese blev CD31 og a-SMA brugt til at kvantificere kapillærtallene. Immunfluorescensfarvning viste, at MOD-gruppen forårsagede et bemærkelsesværdigt fald i udtryk for CD31 (figur 6A, B) og a-SMA (figur 6C, D) i penumbraen af ​​iskæmiske områder af I/R-rotter sammenlignet med de normale rotter . Dette resultat illustrerede, at I/R kunne forårsage vaskulær skade i cortex penumbra i iskæmiske hemisfærer. Imidlertid øgede TG'erne og EDI-behandlingen bemærkelsesværdigt kapillærtæthed, angiogenese og arteriogenese som indikeret af øgede udtryk for CD31 og a-SMA. Disse resultater tyder på, at TG'er kunne fremme angiogenese i den iskæmiske penumbra hos I/R-rotter, men PS'erne og OS'erne kunne ikke.

TG'er øger ekspressionen af ​​Tight Junction-proteiner i I/R-skadede rotter

BBB-forstyrrelser kan øge hjernens vandindhold og hævelse af væv, hvilket fører til hjerneskade. Tight junction-proteiner er vigtige strukturelle komponenter i BBB. For at teste, om TG'er, PS'er og OS'er behandling efter slagtilfælde kan påvirke BBB-integriteten, blev udtryk for ZO-1, claudin-5 og occludin udført ved immunfluorescensanalyse. Resultaterne indikerede, at udtrykkene af claudin-5, occludin og ZO-1 var synligt reduceret i MOD-gruppen. De steg dog væsentligt efter 14 dage efter dets administration. PS'er og OS'er-grupper viste ingen signifikante ændringer i disse proteinekspressioner (figur 7). Disse data indikerede, at TG'erne kan regulere tight junction-proteinekspressioner og sandsynligvis opretholde BBB-integritet efter I/R-skade.

TG'er øger Pericyte-dækningen på kapillærer hos I/R-skadede rotter

Pericytdækning på kapillærer spiller en afgørende rolle for at opretholde BBB-integritet. Således testede vi, om pericytdækning kunne øges ved TG'er, PS'er og OS'er behandling. Immunfluorescensintensitetsanalyseresultater viste, at både PDGFRb- og CD31-ekspressioner var dramatisk reduceret i MOD-gruppen. Administration af TG'er til I/R-rotterne genvandt eller øgede endda ekspressionsintensiteterne af PDGFRb og CD31 signifikant, men der blev ikke observeret nogen forskel i PS'er og OS'er-behandlingsgrupperne (figur 8). Behandling af TG'er kunne således øge pericytdækningen betydeligt. Disse resultater bekræftede yderligere, at TG'er kan opretholde integriteten af ​​BBB efter I/R.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FOREBYGGELSE AF ISÆMISK SLAG PHGS75% ECH 30% ACT 12%