Totale glykosider af Cistanche Deserticola fremmer neurologisk funktionsgendannelse ved at inducere neurovaskulær regenerering

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* og Yong Jiang1*

Baggrund:Den traditionelle kinesiske medicin Cistanche deserticola er blevet rapporteret at være gyldig for hjerte-kar- og cerebrovaskulære sygdomme. Dets aktive komponenter til beskyttelse af iskæmisk slagtilfælde er imidlertid ikke klare. Vi havde til formål at udforske de aktive komponenter af C. deserticola mod iskæmisk slagtilfælde såvel som dets potentielle mekanismer.

Metoder:Vi undersøgte de hjernebeskyttende virkninger af ekstrakter fra C. deserticola, totale glycosider (TG'er), polysaccharider (PS'er) og oligosaccharider (OS'er) i en rottemodel af okklusion-reperfusion i den midterste cerebrale arterie (MCAO/R). 2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-farvning blev brugt til at vurdere hjerneinfarktvolumenet, og Evansblue-assay blev anvendt til at vurdere blod-hjernebarrierens (BBB) ​​permeabilitet. Derefter udtrykkes CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin,Keap-1 og Nrf{{13 }} blev analyseret ved hjælp af western blotting eller immunfluorescens, og aktiviteterne MDA, SOD, CAT og GSH-Px blev analyseret ved hjælp af kits.

Resultater:TGs-behandling reducerede bemærkelsesværdigt neurologiske deficit-score og infarktvolumener, fremmede angiogenese og neural remodellering og opretholdt effektivt blod-hjerne-barriere-integriteten sammenlignet med modelgruppen. Desuden reducerede TG signifikant MDA-niveauer og øgede antioxidantaktiviteter (SOD, CAT og GSH-Px) i hjerner. I mellemtiden nedregulerede TG'er bemærkelsesværdigt Keep-1-ekspression og lettede Nrf-2-kernetranslokation. Tværtimod blev der ikke observeret nogen beskyttende virkninger for PS'er og OS'er grupper.

Konklusion:TG'er er de vigtigste aktive komponenter i C. deserticola mod MCAO/R-induceret cerebral skade, og beskyttelsen sker hovedsageligt via Nrf-2/Keap-1-vejen.

Nøgleord:Cistanche deserticola,cerebral skade, totale glykosider, polysaccharider, oligosaccharider, Nrf-2/Keap-1-vej

cistanche amazon deserticola

INTRODUKTION

Slagtilfælde anses for at være en væsentlig årsag til død og handicap i verden (Donnan et al., 2008). Næsten 87 procent af alle slagtilfælde udløses af iskæmisk slagtilfælde (Ovbiagele og Nguyen-Huynh, 2011). I øjeblikket er det mest effektive middel og det eneste FDA-godkendte lægemiddel, der anvendes til behandling af iskæmisk slagtilfælde, rekombinant vævsplasminogenaktivator. Et stort antal apopleksipatienter reagerer imidlertid ikke på dette lægemiddel på grund af dets snævre terapeutiske tidsvindue og en alvorlig risiko for hæmoragiske komplikationer (Lee et al., 2012; Schellinger og Kohrmann, 2014). En stor udfordring ved trombolytisk behandling er iskæmi/reperfusion (I/R) skade, som anses for at være hovedårsagen til hjerneskade og funktionsdestruktion. Reperfusion efter cerebral iskæmi øger risikoen for en hjerneblødning, samtidig med at det fører til neurovaskulær skade og producerer overdreven aktive oxygenarter (ROS), som beskadiger blod-hjernebarrieren (Alluri et al., 2015). En række undersøgelser har bekræftet, at forstyrrelsen af ​​BBB er en væsentlig årsag til patogenesen af ​​iskæmisk slagtilfælde (Cao et al., 2016b).

BBB består hovedsageligt af endotelceller, pericytter, astrocytter, neuroner og basalmembraner. Kernekomponenterne i BBB er cerebrale mikrovaskulære endotelceller, der er forbundet med tætte forbindelser, hvilket begrænser eksogene molekyler ind i hjernen. De patologiske ændringer af tightjunctions – især occludin, claudin-5 og zonulaoccludens-1 (ZO-1) – påvirker BBB-funktionen signifikant under et iskæmisk slagtilfælde, især barrierepermeabiliteten (Liuet al., 2014) ; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). I I/R-perioder er overdreven ROS en af ​​hovedfaktorerne, der fører til direkte skade på hjerneneuroner (Ding et al., 2014). ROS-overproduktion fører til nedbrydning af visse junctions og BBB-forstyrrelser, hvilket resulterer i, at eksogene molekyler centrerer hjernen gennem BBB, hvilket fører til forværring af hjerneskade (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Derfor er beskyttelse af BBB med antioxidanter blevet betragtet som en potentiel måde at forhindre reperfusionsskade.

Udover nedbrydningen af ​​BBB kan I/R resultere i inneurovaskulær skade og neuronal død (Jung et al., 2010). Under et slagtilfælde kan øget neuronal celledød skyldes oxidativt stress (Chi et al., 2018) og adskillige undersøgelser har vist, at ROS forværrer slagtilfælde og neurologiske skader (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Selvom kliniske forsøg ikke har fået tilfredsstillende resultater, er neurobeskyttelse stadig en lovende strategi til behandling af akut iskæmisk slagtilfælde (Moretti et al., 2015). Derfor er det en fordel for patienter med slagtilfælde at finde effektive neurobeskyttende lægemidler til behandling af slagtilfælde.

Traditionel kinesisk medicin (TCM) træffer foranstaltninger for at gribe ind mod kroppens indre ubalance (Gaire, 2018). På grund af den komplekse patogenese af iskæmiske slagtilfælde spiller den multifaktorielle virkning af TCM og dets aktive bestanddele en kritisk rolle i behandlingen af ​​slagtilfælde. Cistanche deserticola YC Ma, udbredt i tørre eller halvtørre områder i hele Mongoliet og det nordvestlige Kina, har været en meget brugt TCM-urt til behandling af forskellige sygdomme såsom glemsomhed og depression i mere end 1,000 år i Kina. Moderne farmakologiske undersøgelser viste, at de rå ekstrakter fra C. deserticola viste adskillige farmakologiske aktiviteter, såsom forbedring af indlærings- og hukommelsesfunktion, neurobeskyttelse, forbedring af immunitet, antioxidant, anti-aldring og antitræthedseffekter (Ko og Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Kemisk analyse af C. deserticola viste, at dens hovedbestanddele omfatter phenylethanoidglycosider, iridoidglycosider, polysaccharider og oligosaccharider (Jiang og Tu, 2009). De aktive komponenter af C. deserticola til hjernebeskyttelse er dog ikke særlig klare.

C. deserticolas neurobeskyttende egenskab indebærer dets terapeutiske potentiale i kognitivt relaterede sygdomme såsom slagtilfælde og depression samt Alzheimers sygdom (Wang et al., 2017). Forskning i virkningen af ​​C. deserticola-anfald, herunder dets aktive komponenter og virkningsmekanismer, er dog meget begrænset. I det nuværende arbejde undersøgte vi den beskyttende effekt af tre ekstrakter fra C. deserticola, totale glycosider (TG'er, phenylethanoid glycosider og andre glycosider), polysaccharider (PS'er) og oligosaccharider (OS'er) på cerebralI/R-skader. Vores resultater kan bidrage til den nøjagtige kliniske anvendelse af C. deserticola og give en kandidat til behandling af iskæmisk slagtilfælde.

Cistanche har therapeutisk potentialeved kognitivt relaterede sygdomme som slagtilfælde og depression,samt Alzheimers sygdom.

MATERIALER OG METODER

Kemikalier og reagenser

Stænglerne af Cistanche deserticola blev købt fra Alashan, Indre Mongoliet, og identificeret af en af ​​forfatterne (P.-F. Tu).TG'er, PS'er og OS'er blev fremstillet i overensstemmelse med vores tidligere rapporterede metode (Gao et al., 2015) . Kvantitativ analyse af TG'er blev udført ved højtydende væskekromatografi (HPLC) som tidligere beskrevet (Li et al, 2019), og dets kromatogram er vist i figur 1. Hovedkomponenterne i TG'er er echinacosid, tubulosid A, acteosid, isoacteosid og 2'- acetylacteosid; deres indhold er henholdsvis 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g og 12,045 mg/g. Indholdet af PS'er og OS'er er henholdsvis 69,42 procent og 65,24 procent, som bestemt ved HPLC og phenol-svovlsyreanalysen, henholdsvis (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).

Standardreferencerne for echinacosid (A0282), tubulosideA (A0942), acteosid (A0280), isoacteosid (A0281) og 2'-acetylacteosid (A0943) blev købt fra Chengdu MustBiotechnology (Sichuan, Kina). Renheden af ​​alle standarder er mere end 98 procent. Nissl-farve H&E-sæt blev købt fra Boster (Wuhan, Kina). Edaravone (T0407-1) ​​blev købt fra TargetMol (Shanghai, Kina). Kanin anti-rotte MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) og museanti-rotte CD31 (ab24590) blev købt fra Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Kanin-anti-rotte Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) og Occludin (BS72035) blev købt fra Bioworld Technology (Nanjing, Kina). Cell SignalingTechnology Inc. (Boston, MA, USA) var kilden til rabbitanti-rotte Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) blev købt fra Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA). Sekundære antistoffer blev leveret af Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Beijing, Kina). Hoechst 33258 blev opnået fra Beyotime (Jiangsu, Kina).

FIGUR 1|HPLC-chromatogrammerne for TG'erne (A) og standardreferencerne (B).

Dyr

Sprague-Dawley-rotter (han, der vejer 250-300 g) blev opnået fra Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, Kina) og anbragt i et airconditioneret rum holdt på en 12 timers lys/mørkecyklus. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyreforskning ARRIVE (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) og godkendt af InstitutionalAnimal Care and Use Committee ved Peking University HealthScience Center (LA2019123).

Dyreforsøgsprotokoller

Rotterne blev udsat for MCAO/R, som tidligere beskrevet (Wang et al., 2018). Kort fortalt blev den venstre almindelige halspulsåre (CCA), den eksterne halspulsåren (ECA) og den indre halspulsåren (ICA) blotlagt, og en 3-0 nylon monofilamentsutur blev indsat fra ECA ind i ICA, indtil den nåede den midterste cerebrale arterie ( MCA). Efter 1,5 timers MCA-okklusion blev reperfusion simuleret ved at fjerne filamentet. Under den kirurgiske procedure blev kropstemperaturen for alle rotter holdt på 37,0 grader.

Lægemiddeladministration

Rotterne blev tilfældigt adskilt i seks grupper ved hjælp af SPSSsoftware version 22.0 som beskrevet (Jiang et al., 2014): normalgruppe (NOR); modelgruppe (MOD); edaeavone gruppe (positivt lægemiddel, 6 ml/kg, EDI); TG'er-gruppe (280 mg/kg, TG'er); PSs-gruppe (280 mg/kg, PSs) og OSs-gruppen (280 mg/kg, OSs). TG'er, PS'er og OS'er blev administreret ig en gang om dagen efter MCAO/R i 14 dage. NOR- og MOD-grupperne blev behandlet med normal saltvand. Dyrenes antal er vist i tabel 1.

TABEL 1|Antal dyr for forskellige forsøgsgrupper og forskellige parametre ved 14 dage efter administration.

Måling af vægt og modificeret neurologisk underskudsscore (mNSS)

Kropsvægten blev overvåget på den 14. dag ved hjælp af en ADVENTURE™ Digital Scale (OHAUS, New Jersey, USA). NSS blev vurderet i henhold til metoden beskrevet af FJ Wang (Wang et al., 2018), med mindre revisioner.

2, 3, 5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)-farvning

Infarktvolumen blev målt som tidligere beskrevet (Wanget al., 2015). Kort fortalt blev hjernerne opdelt i syv koronale blokke med lige store afstande (2 mm). Disse sektioner blev farvet med 2 procent TTC (Coolaber, Beijing, Kina) ved 37 grader i 15 min. Infarktvolumen ( procent )=(ipsilateral iskæmisk hemisfærevolumen-kontralateral iskæmisk hemisfærevolumen)/kontralateraliskæmisk hemisfærevolumen × 100.

Nissl og H&E Farvning

Rotterne blev dybt bedøvet, og hele hjernen blev derefter hurtigt fjernet fra kraniet og fikseret under anvendelse af 4 procent paraformaldehyd og indlejret i paraffinvoks og snittet i skiver med en tykkelse på 7 µm. Sektionerne blev farvet med Nissl og H&E. I denne undersøgelse blev seks tilfældige 200 × 200 µm felter fanget i hver vævsprøve med et lysmikroskop. Antallet af Nissls lig blev talt med IPPsoftware version 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA).

Evans Blue Assay

Rotter blev injiceret med 2 procent EB (Coolaber Science & TechnologyCo., LTD) efter MCAO/R. To timer senere blev rotterne bedøvet, og hele hjernen blev derefter hurtigt fjernet og homogeniseret i acetone. Supernatanterne blev analyseret ved 620 nm af en 800 TS absorbanslæser (BioTek, USA).

Måling af aktiviteterne af Catalase (CAT), Superoxid Dismutase (SOD), Malondialdehyd (MDA) og GlutathionePeroxidase (GSH-Px)

Alle serumprøver blev centrifugeret ved 4,000 x rpm i 15 minutter ved 4 grader og derefter analyseret for at detektere aktiviteterne af MDA, CAT, SOD og GSH-Px efter producentens instruktioner (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. , Kina).

Western blotting-analyse

Hjernevæv (100 mg) opsamlet fra hver rotte blev homogeniseret og lyseret i RIPA-lysebuffer og derefter analyseret for at påvise proteinkoncentrationen under anvendelse af et BCA-kit (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.). Vævs-totalproteiner blev sat på 10 procent SDS-PAGE-geler og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret under anvendelse af 5 procent skummetmælk og derefter inkuberet natten over med primære antistoffer ved 4 grader. Membranen blev derefter inkuberet med et sekundært antistof. Western blot-analyse blev analyseret under anvendelse af Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Kina).

Immunfluorescensanalyse

Immunfluorescensfarvning for CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 ogKeap-1 blev udført. Primære antistoffer mod Nrf-2,CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN,PSD95, MAP-2 og Keap-1 blev fortyndet til 1:20henholdsvis 0 og 1:100. De sekundære antistoffer af Alexa Flur 488 museanti-kanin IgG og rhodamin (TRITC) gede anti-kanin IgG blev begge fortyndet til 1:200. Kernerne blev farvet af Hoechst 33258. Billeder blev optaget ved hjælp af Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA). Proteinekspressionen blev analyseret ved hjælp af IPP-softwareversion 6.0.

Statistisk analyse

Alle data blev beskrevet som middel ± SD. SPSS-softwareversion 22.0blev udført til statistisk analyse. Envejs ANOVA blev brugt ved sammenligning af forskellige grupper. P < 0.05="" blev="" anset="" for="" at="" være="" den="" statistiske="">

cistanche bodybuilding neurobeskyttelse

RESULTATER

TG'er øger kropsvægten og reducerer hjerneskader hos MCAO/R-rotter

Efter 14 dages helbredelse med TG'er, PS'er, Oss og EDI blev kropsvægten, neurologiske underskud og infarktvolumener af I/R-rotter evalueret. Resultaterne viste, at kropsvægtene i MOD-gruppen var stærkt reduceret, mens de reducerede vægte i TG'er, PS'er og EDI-grupper tydeligvis blev øget (Figur 2A). Neurologiske underskudsscore blev væsentligt sænket af EDI og TG'er (Figur 2B). Hjerneskiverne i NOR-gruppens rotter var dybrøde, og der var ingen infarkter, mens rotterne i MOD-gruppen viste et stort ipsilateralt hjerneinfarkt. Efter TGs-behandling blev infarktvolumenet signifikant reduceret (figur 2C, D). Behandlingen med PS'er og OS'er viste ingen tydelig effekt på ovenstående indekser. Ovenstående data viste, at TGs markant kunne lindre den I/R-inducerede cerebrale skade, men PSsand OSs kunne ikke.

FIGUR 2|TG'er reducerer hjerneskaden induceret af forbigående fokal cerebral iskæmi.

TG'er forbedrer histopatologiske skader i MCAO/R-rotter

For at bestemme nogle af virkningerne af TG'er, PS'er og OS-behandling på histopatologiske skader, blev H&E-farvning udført for at afsløre patologisk skade. De histomorfologiske strukturer af hjerner i NOR-gruppen blev arrangeret regelmæssigt. Morfologiændringerne i TGs-grupperne var mindre end dem i MOD-gruppen. Imidlertid viste PS'erne og OS'erne behandlingsgrupper ingen signifikant forbedring af morfologiændringerne (figur 3).

TG'er dæmper neuronal skade efter I/R-inducerede rotter

Nissl-farvning viste de histopatologiske ændringer af neuroner i penumbraen i det iskæmiske område. Som vist i figur 4 havde normalneuronerne en klar nukleolus og intakt struktur. I MOD-gruppen havde neuronerne forstørrede intercellulære rum. Nissekropperne var forsvundet, indskrumpet og dybt farvede. Disse ændringer blev dog sjældent observeret i EDI-, TGs- og PSs-grupperne. Disse resultater illustrerede, at TGs og PSs signifikant kunne svække iskæmi/reperfusion-induceret neuronal skade.

TG'er dæmper BBB-afbrydelse efter I/R-behandlede rotter

Evans blue assay er en klassisk metode til at undersøge ændringen af ​​BBB-permeabilitet. Eksperimentresultaterne viste, at øget Evans-blå blev observeret i MOD-gruppen, mens der var et signifikant fald i Evans-blåt i TG'erne og EDI-behandlede rotter. Desuden var der ingen signifikant forskel mellem PS'er og OS'er terapigrupper (figur 5). Disse resultater tydede på, at TG'er signifikant kunne dæmpe BBB-forstyrrelser.

FIGUR 3|TG'er forbedrer histopatologisk skade hos MCAO/R-rotter.

TG'er fremmer angiogenese hos I/R-skadede rotter

Nyere undersøgelser viser, at angiogenese spiller en kritisk rolle, internologisk funktionel genopretning og prognostisk udfald efter akut iskæmisk slagtilfælde (Yuen et al., 2015). For at evaluere virkningerne af TG'er, PS'er og OS'er på angiogenese blev CD31 og a-SMA brugt til at kvantificere kapillærtallene. Immunfluorescensfarvning viste, at MOD-gruppen forårsagede et bemærkelsesværdigt fald i udtryk for CD31 (figur 6A, B) og a-SMA (figur 6C, D) i penumbraen af ​​iskæmiske områder af I/Rrotter sammenlignet med de normale rotter. Dette resultat illustrerede, at I/R kunne forårsage vaskulær skade i cortex penumbra af iskæmiske hemisfærer. Imidlertid øgede TG'erne og EDI-behandlingen markant kapillærtæthed, angiogenese og arteriogenese som indikeret ved øget udtryk af CD31 og a-SMA. Disse resultater tyder på, at TG'er kunne fremme angiogenese i den iskæmiske penumbra hos I/R-rotter, men PSsand OS'erne kunne ikke.

TG'er øger ekspressionen af ​​Tight JunctionProteins i I/R-skadede rotter

BBB-forstyrrelser kan øge hjernens vandindhold og hævelse af væv, hvilket fører til hjerneskade. Tight junction-proteiner er vigtige strukturelle komponenter i BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). For at teste, om TG'er, PS'er og OS-behandling efter slagtilfælde kan påvirke BBB-integriteten, blev udtryk for ZO-1, claudin-5 og occludin udført ved immunfluorescensanalyse. Resultaterne viste, at udtryk for claudin-5, occludin og ZO-1 var synligt reduceret i MOD-gruppen. Imidlertid var de væsentligt forøget efter 14 dages TGs-administration. PS'er og OSs-grupper viste ingen signifikante ændringer i disse proteinudtryk (figur 7). Disse data indikerede, at TG'erne kan regulere tight junction-proteinekspressioner og sandsynligvis opretholde BBB-integritet efter I/R-skade.

TG'er øger pericytedækning på kapillærer hos I/R-skadede rotter

Pericytdækning på kapillærer spiller en afgørende rolle i at opretholdeBBB-integritet (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Således testede vi, om pericytdækning kunne øges ved TG'er, PS'er og OS'er behandling. Immunfluorescensintensitetsanalyseresultater viste, at både PDGFRb- og CD31-ekspressioner var dramatisk faldet i MOD-gruppen. Administration af TG til I/R-rotterne genvandt eller øgede endda ekspressionsintensiteterne af PDGFRb og CD31 signifikant, men der blev observeret nodifference i PS'er og OS'er-behandlingsgrupperne (figur 8). Behandling af TG'er kunne således øge pericytdækningen betydeligt. Disse resultater bekræftede yderligere, at TG'er kan bevare integriteten af ​​BBB efter I/R.

TG'er fremmer neural ombygning hos I/RI-skadede rotter

Ifølge talrige undersøgelser kan neurogenese efter et slagtilfælde signifikant forbedre funktionel restitution (Grefkes og Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Synaptophysin (SYN), postsynaptisk densitet 95 (PSD-95)-proteiner og mikrotubuli-associeret protein 2 (MAP-2) blev brugt som markører for at undersøge neuronal plasticitet i den iskæmiske penumbra i cortex. For at vurdere virkningerne af TG'er, PS'er og OS-behandling på neurogenese i I/R-skadede rotter, blev der udført immunfluorescens og western blot for SYN-, PSD95- og MAP-2-ekspressioner. Som vist i figur 9 og 10 faldt SYN-, PSD95- og MAP-2-ekspressionsniveauerne i I/R-rotter efter 14 dages reperfusion sammenlignet med NOR-rotterne, mens TG'erne og PS'erne kunne opregulere deres ekspressionsniveauer betydeligt. . OSs-gruppen havde ingen signifikant ændring sammenlignet med MOD-gruppen. Dataene indikerede, at TG'erne og PS'erne var i stand til dramatisk at fremme neural ombygning efter I/R-skade.

TGs Alter Nrf-2 og bevarer-1 udtryk i I/R skadede rotter

Oxidativ stress er en hovedpatogen mekanisme ved I/R-skade (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Undersøgelserne bekræftede, at Nrf-2 er en mesterregulator af antioxidative responser (Thompson et al.,2015). For at undersøge Nrf-2- og Keap-1-medierede oxidative reaktioner efter I/R-skade, evaluerede vi den cytoplasmatiske ekspression samt nuklear translokation af Keap-1. I mellemtiden er ekspressionen af ​​Nrf{{7 }} i I/R-skadede rottes hjernevæv blev også analyseret (figur 10 og 11). Ifølge immunfluorescensanalysen blev Nrf-2 hovedsageligt lokaliseret ved cytoplasmaet i NOR-gruppen. I TGs-gruppen var ekspressionen af ​​Nrf-2 i cytoplasmatisk lokalisering nedreguleret, men opreguleret i kernen, og der blev også observeret nedsat Keap-1-ekspression. Dataene viste, at hjernebeskyttelsen af ​​TG'er kunne være forbundet med moduleringen af ​​Nrf-2 og Keap-1.

FIGUR 4|TG'er dæmper neuronal skade efter I/R-behandlede rotter.

TG'er dæmper hjernevævsoxidativ stress hos I/R-skadede rotter

For at bekræfte de antioxidative virkninger af TG'er blev aktiviteterne af SOD, CAT, GSH-Px og MDA evalueret i I/R-skadede rotter. I figur 12 var indholdet af MDA markant øget i MOD-gruppen, og samtidig var aktiviteterne af SOD, CAT og GSH-Px faldet sammenlignet med de normale rotter. Omvendt førte TGs-behandling til et signifikant fald. i indholdet af MDA og en stigning i aktiviteterne for SOD, CAT og GSH-Px. Disse resultater bekræftede yderligere antioxidationsaktiviteten af ​​TG'er.

DISKUSSION

Mange undersøgelser tyder på, at TCM C. deserticola har omfattende biologiske aktiviteter, f.eks. styrkelse af evnen til at lære, hukommelse og immunitet (Dong et al., 2007; Jiang og Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia et al., 2018 ). Imidlertid er de aktive komponenter af C. deserticola til neurobeskyttelse forbliver uklar. Det nuværende arbejde sigter mod at screene de aktive komponenter fra C. deserticolaagainst iskæmisk slagtilfælde på MCAO/R-modellen. Tre ekstrakter fra C. deserticola (TG'er, PS'er og OS'er) blev brugt til at evaluere deres virkninger på MCAO/R-rotter, såvel som mulige mekanismer.

Slagtilfælde er en almindelig akut cerebrovaskulær sygdom. Epidemiologiske undersøgelser viser, at slagtilfælde er mere almindeligt hos mænd end hos kvinder (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik og Bushnell, 2017). I vores eksperiment blev hanrotter således adopteret til testene. Vores resultater viste, at I/R-induktion accelererede oxidativt stress og infarktvolumen, hvilket bryder BBB og førte til nerve- og cerebrovaskulær skade. Efter screening blev TG'er fundet at reducere infarktvolumen og fremme neuralremodellering og angiogenese. Desuden blev TG'er observeret for at opretholde BBB-integritet efter I/R-skade. Tværtimod medfører PS'er og OS'er ingen væsentlig lindring af I/R-skade. Således betragtes TG'er som den vigtigste aktive fraktion af C. deserticola forneuroprotection, potentielt gennem fremme af neuralremodellering, angiogenese og BBB-integritet via aktivering af Nrf-2/Keap-1-vejen.

FIGUR 5|TG'er dæmper BBB-forstyrrelser efter I/R-skade.

Flere beviser tyder på, at etableringen af ​​en effektiv kollateral cirkulation er væsentlig vigtig for at undgå dannelsen af ​​infarkt og iskæmisk penumbra, og er en kritisk behandling på et tidligt stadium af iskæmisk slagtilfælde (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Proliferationen af ​​vaskulære endotelceller og glatte muskelceller efter iskæmisk infarkt bestemmer etableringen af ​​kollateral cirkulation. Imidlertid har iskæmimodellerne et fælles fænomen - det vil sige, oxidativt stress eksisterede i vid udstrækning i hjernens mikrovaskulatur. Undersøgelsesdata har vist, at et stort antal antioxidanter kan forstyrre funktionen af ​​BBB og egenskaberne ved angiogenese (Mentor og Fisher, 2017). CD31 og a-SMA er markører for henholdsvis vaskulære endotelceller og glatte muskelceller (Saboor et al., 2016). For at undersøge virkningen på den ovennævnte celleproliferation af ekstrakterne fra C. deserticola undersøgte vi ekspressionerne af CD31 og a-SMA i det cerebrale iskæmiske penumbra-homogenat. Vores data viste, at TG'er påfaldende forbedrede udtryk for CD31 og a-SMA. Der var dog ingen signifikante forskelle for PS'er og OS'er grupper. Derfor udledte vi, at TG'er kan reducere hjerneskade ved at fremme angiogenese ved at øge udtryk for CD31 og a-SMA, hvorimod PS'er og OS'er ikke gav en sådan beskyttelse mod hjerneskade. Disse resultater bekræftede yderligere, at kun TGs kunne forhindre cerebral I/R-skade.

Iskæmisk slagtilfælde kan opfattes som et resultat af cerebraliskæmi forårsaget af svækkelse af den neuronale plasticitet eller remodellering af hjerneområder. Størstedelen af ​​apopleksipatienter lider af neurologiske mangler. Aktivering af neurogenese er en lovende strategi for patienter med slagtilfælde for at forbedre deres neurologiske funktioner (Cramer og Chopp, 2000). Neurogenese deltager direkte i genopretning af neurologisk funktion efter hjerne I/Rinjury (Zhang et al., 2019). Tidligere forskning viser, at TG'er kan forbedre overlevelsesraten for hippocampale pyramideceller og inducere neurogenese (Lian et al., 2017). Oxidativ stress forårsager tab af neuroner under mange sygdomme, såsom Parkinson, slagtilfælde og så videre (Duan og Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2transkriberer masser af gener relateret til neuro-beskyttelse i deres promotorregion, hovedsageligt inklusive SOD, MDA, CAT og g glutamylcysteinligaser osv. (Satoh et al., 2006). SYN-, PSD-95- og MAP-2-proteiner, som er tæt forbundet med synaptisk dannelse og neurotransmission, kan betragtes som markører for forskning i neuronal plasticitet i den iskæmiske penumbra-region. Efter at have studeret fandt vi ud af, at kuren med TG'er kunne signifikant øge udtryk for PSD95, SYN og MAP-2, hvilket indikerer, at den cerebrale beskyttelse af TG'er var korreleret med den øgede neuronale plasticitet under I/R. Det er dog en skam, at der ikke er nogen åbenlys forskel for PSs så godt som som OS grupper. Disse resultater indikerede, at TG'er kunne øge neuroplasticiteten efter cerebral I/R-skade.

Billedforskning af patienter med slagtilfælde viste, at BBB-dysfunktion kan opfattes som en slående egenskab ved den periiskæmiske hjerne (Bang et al., 2007). TJ'erne, som er sammensat af cytoplasmatiske proteiner, transmembrane proteiner og junctionadhæsionsmolekyler mellem kapillære endotelceller, er meget vigtige for at opretholde BBB-integritet (Ye et al., 2019). Blandt dem er ZO-1, claudin-5 og occludin de vigtigste proteiner i TJ'er. Flere beviser indikerer, at den øgede permeabilitet af BBB induceret af iskæmi generelt korrelerer med ændringerne af ZO-1, claudin-5 og occludin (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Liu et al., 2018). I dette arbejde viste resultaterne, at selvom TG'er signifikant kunne øge udtryk for ZO-1, claudin-5 og andoccludinproteiner i MCAO-induceret hjernevæv, gjorde hverken PSs eller OS'er det. BBB består af cerebrale endotelceller og er tæt forbundet med pericytter (Nyul-Toth et al., 2016). Pericytter er afgørende for BBB-integritet (Bell et al., 2010). Iskæmisk slagtilfælde udløser pericytes død og løsrivelse fra hjerne-endotelceller i den akutte fase, hvilket destabiliserer mikrovaskulaturen og ændrer BBB-egenskaber (Zechariahet al., 2013). Vores data viste, at TG'er kunne øge pericytdækningen på kapillærer og øge ekspressionsniveauerne af ZO-1, claudin-5 og occludin. Disse fænomener beviste, at TG'er effektivt kunne beskytte BBB-integritet efter cerebral I/R-skade. Sammenfattende kan TG'er dæmpe cerebral skade på flere måder, såsom at fremme angiogenese, forbedre neuronal plasticitet og opretholde integriteten af ​​BBB.

Vi undersøgte derefter signalvejen for at udforske mekanismen, der ligger til grund for TGs hjernebeskyttelse. Processen med I/R-skade er multifaktoriel, og derfor er adskillige mekanismer involveret i patogenesen. Oxidativ stress er en grundlæggende risikofaktor, der bidrager til I/R-induceret hjerneskade (Suda et al., 2013), såsom BBB-strukturskade, vaskulær endotel dysfunktion og forværring af iskæmisk neuronal skade (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2015; Caglayan et al. al., 2019; Priestley et al., 2019). Oxidativ stress er således blevet et attraktivt terapeutisk mål ved I/R-induceret hjerneskade. Fase 2-enzymer, som medieres af nuklear faktor E2-relateret faktor-2 (Nrf-2), har blevet betragtet som et vigtigt middel, hvorved neuroner beskytter sig selv mod oxidativt stress (Suzuki og Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Flere beviser indikerer, at aktivering af Nrf-2 under I/R er et potentielt terapeutisk mål for neurobeskyttelse (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, som en vigtig regulator af endogene antioxidantforsvar, formidler niveauet af hæmoxygenase 1 (HO-1) og andre antioxidantenzymer, såsom NAD(P)H quinonoxidoreduktase1 (NQO1), SOD, CAT, GSH og MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Desuden spiller Nrf-2 en vigtig regulatorrolle inangiogenese. Den nuværende undersøgelse viser, at Nrf-2 kan forbedres og aktiveres væsentligt i processen med vaskulær udvikling (Wei et al., 2013).

Som tidligere beskrevet (Jiang og Tu, 2009) indeholder TG'er masser af bioaktive forbindelser, for eksempel echinacosid, tubulosid A, acteosid, isoacteosid og 2'-acetylacteosid, og nogle af dem viste neurobeskyttende funktioner efter cerebral I/R-skade (Penget al. ., 2016). Echinacosid har masser af farmakologiske virkninger, såsom antioxidation, anti-ældning, neurobeskyttelse, anti-inflammation, fremme af cicatrization, hepatoprotection, fremme af knogledannelse og anti-tumor aktiviteter (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). For nylig er echinacosid blevet identificeret som en potent antioxidant i centralnervesystemet (Lu et al., 2016). Echinacoside kan reducere MDA-indhold og forbedre aktiviteterne af SOD og GSH Px ved iskæmisk hjerneskade, og molekylær docking-analyse viste, at echinacosid kan binde til Keap-1, hvilket fører til Nrf-2-kernetranslokation (Li et al. , 2018). Undersøgelsen af ​​Xia viste, at acteosid kunne reducere infarktvolumenet og hjernens vandindhold for at forbedre neurologiske underskud hos MCAO/R-rotter gennem afhjælpning af oxidativt stress (Xia et al., 2018). Andre undersøgelser har vist, at isoacteosid kunne øge aktiviteten af ​​cellulære antioxidantenzymer, SOD og CAT i H2O2-behandlede V79-4-celler (Chae et al., 2005). Baseret på ovenstående rapporter om de aktive forbindelser indeholdt i TG'er er det muligt at udlede, at TG'er kunne beskytte mod iskæmisk slagtilfælde via antioxidationsvejene.

Li rapporterede om de neurobeskyttende virkninger af phenylethanoidglycosider (PhGs) på H2O2-induceret apoptose på PC12-celler via Nrf2/ARE-vejen (Li et al., 2018). Disse PhG'er blev signifikant undertrykt ved at udløse Nrf2 nuklear translokation og øge udtryk for HO -1, NQO1, glutamat-cystein ligase katalytisk underenhed (GCLC) og glutamat-cystein ligase modificerende underenhed (GCLM) (Li et al., Gong et al., 2018 al., 2019). Derfor tyder disse resultater på, at Nrf-2/ARE-vejen spiller en afgørende rolle i PhGs-medierede beskyttende virkninger på neuronale celler. Tilsvarende fandt vi i denne undersøgelse, at TG'er kunne reducere niveauet af MDA og øge niveauerne af SOD, CAT og GSH-Px i I/R-rotterne. I mellemtiden kunne TG'er opregulere Nrf2-ekspressionen i kernen, nedregulere det tilsvarende udtryk i thecytoplasma og signifikant reducere Keap-1-ekspressionen. Derfor kan Nrf-2/Keap-1-vejen være involveret i TGs-medierede neurobeskyttende effekter. Yderligere validering af denne vej vil blive udført in vitro cellekultur med oxygen-glucosedeprivation/reoxygeneringsskademodeller i fremtiden. Desuden har C. deserticola-ekstrakter blev administreret i vores undersøgelse i 14 dage kontinuerligt. Da neurogenese hos voksne ville påvirke fortolkningen af ​​neurobeskyttende virkninger i løbet af 14 dages reperfusion, kan neurogenese ikke udelukkes i vores nuværende eksperimentdesign i at udforske den neurobeskyttende effekt af CT'er. Dette er begrænsningen af ​​vores forskning.

Som konklusion er det TG'erne fra C. deserticola, der kan forbedre angiogenese og neurogenese samt opretholde integriteten af ​​BBB i I/R-skadede rotter, men ikke PS'erne og OS'erne. Effekterne kunne medieres af aktiveringen af ​​Nrf-2/Keap-1-stien.

C. deserticolakan forbedreangiogenese og neurogenese.

For mere information, klik venligst her.