Tredimensionel arkitektur af nefroner i den normale og cystiske nyre

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Thomas Blanc^1,2,7, Nicolas Goudin^3,7, Mohamad Zaidan^1,4,7, Meriem Garfa Traore³, Frank Bienaime^1,5, Lisa Turinsky¹, Serge Garbay¹, Cle´ment Nguyen¹, Martine Burtin¹, Gerard Friedlander^1,6, Fabiola Terzi^1,8og Marco Pontoglio^1,8

¹Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université deParis, Institut Necker Enfants Malades, Departement « Croissance et Signalisation », Paris, Frankrig;²Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, Frankrig;³Struktur Fédérative de Recherche Necker, USA24-UMS3633, Paris, Frankrig; ⁴Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Frankrig;⁵Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, Frankrig; og⁶Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Paris, Frankrig

NØGLEORD: cystisknyresygdom;nyre; nefron; nefronophthisis; vævsrensning

Oversættelseserklæring

Clearingmetoder giver et unikt værktøj til at forstå, hvordan morfologiske ændringer fører til patologiske konsekvenser.Nyrerer kritiske organer, der opretholder kroppens homeostase gennem vand-, metabolit- og elektrolythåndtering, som er afgørende afhængige af den komplekse 3-dimensionelle struktur afnefroner.Når denne strukturelle organisation ændres, følger nyrepatofysiologien. I denne undersøgelse har vi udviklet en kraftfuld metode baseret på optisk clearing, multifotonmikroskopi og digital sporing for at studerenyrepå enkelt-nephron-niveau under fysiologiske og patologiske forhold. Især giver vi den første 3-dimensionelle rekonstruktion af en polycystickidney på skalaen af ​​enkeltnefroner. Denne metode kan anvendes til flere patologiske sammenhænge, ​​hvilket giver os mulighed for bedre at forstå den komplekse proces med nyreforringelse og som følge heraf udvikle mere målrettede terapeutiske strategier

Nyren opretholder kroppens homeostase via sit kompleks3-dimensionelle(3D) nefronstruktur. Når denne strukturelle organisation ændres, opstår renal patofysiologi. Kronisknyresygdomme er karakteriseret ved udvikling af nyrelæsioner. Spændende nok har patologer rapporteret om en bred heterogenitet i fordelingen af ​​læsioner under kroniske nyresygdomme.1,2 Hvorvidt dette afspejler det faktum, at specifikke nefronsegmenter kan være forskelligt beskadiget, eller alternativt, at nogle nefroner har forskellige modtageligheder for at blive skadet som helhed, er uvist. For at løse dette problem er det obligatorisk at rekonstruere 3D (Tredimensionel) form afnefroneri patologiske sammenhænge.

Så vidt vi ved,nefronerer kun blevet fuldstændig rekonstrueret ved hjælp af serielle 2D-sektioner.3–5 Selvom standard histologisk sektionering giver høj opløsning, er 3Drekonstruktioner besværlige og svære at opnå. Dette skyldes primært mekaniske forvrængninger, som er en uundgåelig effekt af udskæringsproceduren. Endvidere tillader 3D(-rekonstruktion fra 2D-billeder ikke direkte afbildning af 3D-strukturer i helmonterede væv.

Multifotonmikroskopi har forbedret vores evne til at detektere morfologiske ændringer i tykke snit. En væsentlig begrænsning er dog den lave tilgængelige dybde på grund af lysspredning. Ved at minimere forskelle i brydningsindekset har clearingmidler forbedret evnen til at afbilde dybder dramatisk.6,7 På trods af at det første clearingmiddel blev introduceret for et århundrede siden8, er det først for nylig, at der er udviklet adskillige clearingprotokoller, mest til hjernen.9 –17 Nylige undersøgelser har vist deres potentiale for at forestille sig andre faste organer, såsom leveren, bugspytkirtlen ellernyre.18–26

Polycystisknyresygdom, en genetisk heterogen lidelse, der involverer mutationer i flere ciliære gener, er den mest almindelige arvelige nyresygdom.27,28 Polycystisknyresygdom er karakteriseret ved udvikling af cyster, der fører til fuldstændig ødelæggelse af nyren.28 Mikrodissektionsundersøgelser antydede, at cyster kan udvikle sig enten som et "udskubning" af et nefronsegment, som ved autosomal dominant polycystisk nyresygdom; som ekstatisk udvidelse af samlekanaler (CD'er), som i autosomal recessiv polycystisknyresygdom; eller udelukkende i medullære tubuli, som ved nefronophthisis (NPHP).27,29 Men hvordan cyster udvikler sig i 3D (Tredimensionel) og organisere med hinanden og normal tilstødende tubulesis stadig ukendt.

Her kombinerede vi optisk clearing med multifotonmikroskopi for at give ny indsigt i hvordannefronerer formet og organiseret i fysiologiske forhold og hvordan de modificeres under sygdom, såsom cystogenese. Vores resultater viser, at der er 3 typernefronerog at kar kan påvirke nefrons rumlige organisation. Interessant nok har vi observeret, at nefroner har tendens til at ligge i specifikke planer. Uventet, da vi anvendte denne teknik på jckmus, observerede vi, at cyster kun udviklede sig i specifikke nefronsegmenter med fusiforme cyster blandet med normale tubuli.

Klik for atCistanchebivirkningerfor nyresygdom

RESULTATER

Forsøgsopstilling

At studere formen af ​​helenefroneri forhold til deres miljø, adopterede vi en teknik baseret på optisk clearing og multifotonmikroskopi (Supplerende figur S1A). Ved at sammenligne forskellige optiske clearing-protokoller bestemte vi, at fornyrebenzylalkohol/benzylbenzoat (BABB) var den mest passende med hensyn til effektivitet (Supplerende Figur S1B og C og Supplerende Tabel S1).

3D (Tredimensionel) rekonstruktion og digital sporing kræver billeder af høj kvalitet med høj opløsning og et højt signal-til-baggrundsforhold. Vi observerede, at det optiske signal leveret af nativ fluorescens ikke var ensartet over nyresektioner. Især var billeder fra medulla dårligt kontrasteret med et lavt signal-til-baggrundsforhold (Supplerende figur S2). For at forbedre signal-til-baggrundsforholdet, vestfarvede sektioner med periodic acid-Schiff (Supplementary Figure S1D), fordi vi empirisk bemærkede, at denne farvning gav anledning til høj kontrast i tynde sektioner under 2-fotonfluorescens. Signalet var imidlertid ikke ensartet i hele tyk periodic acid-Schiff-farvetnyresektioner (Supplerende figur S1E). Derfor farvede vi nyresektioner med fluorokrom-koblede lektiner: jordnøddeagglutinin og hvedekim-agglutinin, som farver glomeruli og tubuli, og Griffonia simplicity I folia-agglutinin, som markerer blodkar. blev dramatisk forøget i hele nyresektioner med en betydelig forbedring i både XY-planet og z-aksen (Supplerende figur S1E og Supplerende Film S1).

3D nefron segment visualisering

At visualisere helhedens formnefroner, vi sporede deres veje, begyndende ved glomerulus' urinpol og sluttede ved CD-krydset (Supplementary Movie S2). På trods af det faktum, at de anvendte lektiner globalt binder alle nefronsegmenter, bemærkede vi, at når de blev nøje inspiceret, var disse lektiner karakteriseret ved et specifikt mønster i den måde, de farvede basale eller luminale membraner i de forskellige nefronsegmenter. Med andre ord udnyttede vi det stereotype mønster af lektinfarvning til at identificere de forskellige nefronsegmenter. På denne måde kunne vi nemt identificere 6 entiteter: proksimal tubuli (PT), tynd lem (TL) af Henleloop (HL), tyk opadstigende lem (TAL) af HL, distal convoluted tubuli (DCT), connecting tubuli (CNT), og CD. Overgangen mellem PT og TL var karakteriseret ved det pludselige tab af det typiske PT-børstekantsignal og af faldet i lumenbredden, som næsten var fraværende i TL (figur 1a). Omvendt var overgangen mellem TL og TAL karakteriseret ved en signifikant stigning i eksternt rørformet diameter og relativt konstant lumenbredde (figur 1b). I alle nefroner blev overgangen af ​​TAL til DCT systematisk fundet ved glomerulus' vaskulære pol. Denne overgang var karakteriseret ved en pludselig udvidelse af den ydre rørformede diameter, der overvejende skyldtes en betydelig stigning i lumendiameteren (Figur 1c). Overgangen mellem DCT og CNT var karakteriseret ved areduktion i både rørformet diameter og lumen (Figur 1d). Endelig var forbindelsen mellem CNT og kortikal CD karakteriseret ved en pludselig stigning i både rørformet diameter og lumen (Figur 1e). Kvantificeringen af ​​disse morfologiske overgange var statistisk signifikant (Figur 1f), og dens relevans blev verificeret med farvning med specifikke rørformede markører (Supplerende figurer S3-S5 og Supplerende film S3-S5).

Formen og størrelsen af ​​PT'er varierer efter deres dybde

Farvningen af ​​tyknyresektioner gjorde det muligt for os at spore koordinaterne for den rumlige udvikling af hele PT-segmenter. Interessant nok opdagede vi, at deres form var ekstremt variabel og bestemt af placeringen af ​​deres glomeruli i cortex. Globalt identificerede vi 3 mønstre. Den første svarede til den mest overfladiskenefroner(SNs) (Figur 2a; Supplerende film S6), som optog den mest eksterne del af cortex (de mest eksterne 30 procent tæt på nyrekapslen). Deres snoede dele dannede kompakte strukturer med kun 6 til 7 vindinger omkring deres egen glomerulus, der optog meget små og tætpakkede rum. Konvolutionen af ​​disse SN'er endte i lange og lige pars recta, der faldt ned i medulla. I den modsatte ende af dette spektrum observerede vi et andet mønster af nefroner placeret i den dybeste del af cortex (40 procent mere indre dybde), ved siden af ​​medulla (juxtamedullære nefroner [JN'er]) (Figur 2a; Supplerende figur S6 og Supplementary Movie) S6). Deres PT'er var karakteriseret ved en indledende kortsløjfe, der systematisk faldt ned mod papillen, og derefter vendte U sig for at stige op mod nyrekapslen. I modsætning til SN'er var JN proksimale snoede tubuli karakteriseret ved store spoler, der udviklede sig omkring deres egen glomerulus og optog store, løst pakkede domæner i juxtamedullarycortex. Den indviklede del af PT af JN'er havde 10 til 15 foldninger, der dannede store domæner. Endelig inkluderede det tredje mønster nefroner placeret i den midterste del af cortex (midterste nefroner [MNs]) (Figur 2a; Supplerende film S6). Interessant nok havde disse tubuli en form og rumlig orientering, der repræsenterede en overgang mellem SN'er og JN'er. Faktisk indeholdt de 8 til 9 viklinger med spoler, der var større end SN'er, men mindre end JN'er. Derudover havde MN'er længere pars recta end JN'er. Interessant nok viste en global sammenligning af PT'ernes former, at SN'er og MN'er havde et homogent mønster, mens JN'er var ekstremt heterogene (Supplerende figur S6). Hertil kommer den rumlige rekonstruktion af flerenefroner afslørede, at PT'er aldrig blander sig (SupplementaryMovie S6), hvilket indikerer, at hver nefron optager sit eget individuelle rum i cortex.

Morfometriske analyser bekræftede de store forskelle i størrelsen og formen af ​​SN'er og JN'er, med et mellemliggende aspekt for MN'erne. PT af JN'er var mere end 2-fold længere end PT for SN'er (figur 2b); dog var retheden større i SN'er end i JN'er (figur 2c), i overensstemmelse med observationen, at JN-tubuli var meget mere snoede (figur 2a; Supplerende figur S6).

Figur 1|Morfologiske kriterier, der bruges til at identificere nefronsegmenter. (a–e) Morfologi af de forskellige segmenter af nefroninkontrollerede mus.Nefronerblev sporet fra glomerulus urinpol til opsamlingskanalen (proximal tubuli [PT]: turkis; tynd lem[TL] af Henle-løkken: lysegrå; tyk opadstigende lem [TAL] i Henle-løkken: mørkegrå; distal indviklet tubuli [DCT]: pink; forbindelsesrør [CNT]: gul; kortikal opsamlingskanal [CCD]: orange). Pilene angiver diameteren af ​​de forskellige nefronsegmenter. (Fortsatte)

Figur 1|(Fortsat) (f) Kvantificering af den ydre rørformede diameter af de forskellige nefronsegmenter. Data er udtrykt som middelværdi±SEM. Variansanalyse efterfulgt af Tukey-Kramer-testen: **P < 0.01, ***P < 0,001.

Figur 2 |Tredimensionel(3D) proksimal tubuli rekonstruktion afslører 3 forskellige former og organisationer. (a) Repræsentative 3D-rekonstruktionsbilleder af proksimale tubuli gennem hele nyrebarken, opdelt i 3 niveauer (hvide linjer) i henhold til formen af ​​proksimale tubuli (PT'er): overfladisk (blå), mellem (grøn) og juxtamedullær (rød) cortex, svarende til henholdsvis de ydre 30 procent, de midterste 30 procent og de indre 40 procent af cortex. Bemærk de forskellige former for de 3 typernefronerog især længden og snoetheden af ​​de juxtamedullære tubuli. Bar{{0}} mm. (b,c) Kvantificering af (b) længde og (c) rethed af de 3 typer proksimale tubuli. (d) Kvantificering af volumen af ​​glomeruli fra hver cortex-region. Data er udtrykt som middel SEM. Analyse af varians efterfulgt af Tukey-Kramer-testen: juxtamedullær PT versus overfladisk PT: ###P < 0.001;="" juxtamedullær="" pt="" versus="" mellem="" pt:="" ***p="">< 0,001;="" overfladisk="" pt="" versus="" mellem="" pt:="" $$$p=""><>

Figur 3 |Tredimensionel(3D) nefronrekonstruktion afslører 3 forskellige typer nefroner. (a) Repræsentative 3D-billeder af hele nefron (venstre paneler) fra glomeruli til opsamlingskanal i den overfladiske cortex (blå), midterste cortex (grøn) og juxtamedullær region (rød) i kontrolmus. Nefronsegmentering (højre paneler) for de 3 forskellige typer nefroner. Bar=150 mm. (b) Kvantificering af den indre afstand mellem de 2 lemmer af Henle-løkken for de 3 typer nefroner. (c) Kvantificering af nefronlængden for (fortsat)

Figur 3|(fortsat) 3 typer afnefroner. (d) Kvantificering af længden af ​​de forskellige segmenter af nefronen i henhold til typen af ​​nefron. Data er udtrykt som middelværdi±SEM. Analyse af varians efterfulgt af Tukey-Kramer-testen: juxtamedullær nefron (JN) versus overfladisk nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" mellemnephron="" (mn):="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" forbindelsesrør;="" dct,="" distalconvoluted="" tubuli;="" pt,="" proximal="" tubuli;="" tal,="" tykt="" opstigende="" lem="" af="" henle-løkken;="" tl,="" tynd="" lem="" af="">

Glomerulær størrelse varierer med dybden

Vi analyserede derefter dybden og diameteren af ​​glomeruli tilfældigt udvalgt fra hver af de 3 zoner. Morfometriske analyser afslørede, at glomeruli var lokaliseret i gennemsnit 783 og 355 mm fra nyrekapslen i henholdsvis JN'er og SN'er. Som tidligere rapporteret observerede vi, at størrelsen af ​​glomeruli varierede i henhold til deres dybde. Især var det glomerulære volumen af ​​JN'er 3 gange større end det for SN'er og MN'er (figur 2d).

3D nefron rekonstruktion

Vi sporede derefter den rumlige udvikling af helenefronerfraPT til CNT. Den globale visning af deres 3D (Tredimensionel) rekonstruktion bekræftede, at nefronformen var forskellig blandt SN'er, MN'er og JN'er (Figur 3a; Supplerende film S7). Denne forskel skyldtes hovedsagelig PT's struktur. Derudover observerede vi, at HL havde en anden 3D rumlig organisation. Især var TL og TAL mere fjernt adskilt i JNsthan i SN'er og MN'er (figur 3b). Morfometriske analyser afslørede, at JN'er globalt set var 2-fold længere end SN'er (figur 3c). Den øgede længde var proportionalt fordelt i alle segmenter, undtagen TAL og DCT, som havde en tendens til at have en lignende absolut længde i alle nefrontyper (figur 3d). Dette antydede, at nefronforlængelse er overraskende homogent mønstret proces.

De bueformede kar påvirker juxtamedullær PT-foldning

For at få et mere omfattende perspektiv pånyrestruktur, udnyttede vi Griffonia simplicifoliaagglutinin-farvning, som gjorde det muligt for os at spore buekar og deres grene ind i de kortikale strålekar (Figur 4a; Supplerende film S8). Interessant nok, den samtidige 3D (Tredimensionel) rekonstruktion af nefroner og kar viste, at de bueformede kar har tendens til at være i en overraskende parallel rumlig organisation med nærliggende tubuli. Især observerede vi, at stien fulgt af specifikke JN'er (begrænsede JN'er) har en tendens til at følge stien for det nærliggende fartøj (Figur 4b; Supplerende film S9). Bemærkelsesværdigt er denne bias (kun observeret i en delmængde af JNnefroner) tegnede sig for den store heterogenitet i formerne af PT (Supplerende figur S6). Morfometriske analyser afslørede, at de "begrænsede" PT'er var signifikant længere og mere snoede (reduceret rethed) end de "ikke-begrænsede" (figur 4c og d). Det er værd at bemærke, at de indviklede dele af både SN'er og MN'er var placeret over de bueformede kar og ikke var begrænset.

Cistanche-kronisk nyresygdom

Tubuli har tendens til at ligge i fly

Interessant nok, en inspektion af 3D (Tredimensionel) former afnefronerindikerede, at de har tendens til at ligge i fly (Figur 5a; Supplerende FilmS10). For at kvantificere denne parameter og for at vurdere den mulige statistiske skævhed af denne konformation målte vi tubulis generelle tendens til at bøje ud af planet defineret af deres sløjfer. Vores målinger viste, at sammenlignet med en simuleret model af tilfældig gang genereret med det samme sæt af på hinanden følgende målte vinkler og længde mellem på hinanden følgende punkter (Figur 5b), havde tubuli en tendens til at udvikle sig med en mindre afvigelse fra et plan (Figur 5c). Dette indikerede, at tubulus prøvede at begrænse deres vej langs et fly. De observerede forskelle var meget statistisk signifikante (P <>

3D nefronrekonstruktion afslører et specifikt mønster for cysteudvikling

For at afgøre, om vores protokol tillader sporing af nefroner i uorganiseret patologisk væv, karakteriserede vi formerne og den rumlige fordeling af cyster i jack-mus, en udbredt model for NPHP og cystisk sygdom.31–33 3D-billeder viste, at på trods af udseende af fremtrædende cyster, den generelle 3D (Tredimensionel) forløbet af nefroner afveg ikke signifikant fra kontrolmusens (Supplerende film S11). Tilsvarende bekræftede morfometriske analyser, at den globale længde afnefroner, glomerulært volumen og længden af ​​hvert nefronsegment var sammenlignelige med dem for kontrolmus (Supplerende figur S7). Det skal bemærkes, at vi på grund af cysteudvikling ikke var i stand til at differentiere TL fra TAL i HL. Alle nefronerne udviklede fusiforme cyster (SupplementaryMovies S11 og S12). Et af de mest slående træk var observationen af, at fusiforme cystiske udvidelser fandt sted flere steder langs det samme nefronsegment (Supplerende film S12 og S13). Spændende observerede vi, at cyster aldrig udviklede sig i PT'er og HL-nedadgående lemmer (Figur 6a; Supplerende film S12). I modsætning hertil blev de overvejende detekteret i HL-opstigende lemmer, DCT'er, CNT'er og i den øvre del af CD'er, i kontinuitet med CNT (Figur 6a; Supplerende film S12). Især observerede vi, at DCT såvel som CNT-segmenter havde en særlig øget sandsynlighed for at udvikle cyster i deres respektive mere distale dele (figur 6b). Kvantitative morfometriske analyser af 3D-rekonstruktionsbilleder afslørede, at det samlede cystevolumen pr. nefron var særligt højt i CNT (figur 7a). Derudover observerede vi, at cysteforstørrelser i HL og DCT var større i JN'er end i SNs og MN'er (Figur 7a; Supplerende film S12). Ydermere var cysteforekomsten signifikant højere i JN'er end i de andre typer afnefroner(Figur 7b). Vi observerede også, at den gennemsnitlige glomerulære interafstand (beregnet på de nærmeste 5 glomeruli) havde en tendens til at være særligt øgede incystiske mus, især i den mere overfladiske cortex (Supplerende figur S8).

Figur 4|Fartøjer bestemmer nefronformen. (en)Tredimensionelrekonstruktion af kararkitekturen fra de bueformede kar til de kortikale strålekar. Bar ¼ 200 mm. (b) Repræsentative billeder af "nonconstrained" (øverste panel) og "constrained" (nederste panel) juxtamedullære proksimale tubuli. Bar ¼ 100 mm. (c,d) Kvantificering af (c) længden og (d) retheden af ​​"ikke-indskrænket" og "indskrænket" juxtamedullære proksimale tubuli. Data er udtrykt som middelværdi±SEM. Mann-Whitney test: "constrained" versus "nonconstrained":*P < 0.05,="" ***p=""><>

3D (Tredimensionel) rekonstruktion af adskillige cyster afslørede, at de var ekstremt varierende i form og volumen (Figur 6c; Supplerende film S11 og S13). I HL-opstigende lem havde cyster en fusiform med en lille diameter. I DCT havde cyster en ret sfærisk og større form og var spredt blandt ikke-udvidede tubuli. Interessant nok var overgangen mellem DCT og CNT systematisk karakteriseret ved en normal ikke-dilateret struktur. I modsætning hertil observerede vi i CNT systematisk en sammenhængende udvidet cystisk struktur direkte i kontakt med CD'en. Interessant nok krympede denne struktur i CD gradvist til en normal tubulistørrelse. Meredistalt kunne der ikke påvises yderligere cyster i den sammenhængende del af CD'en. Et andet gennemgående træk var den ejendommelige rumlige organisering af cyster i HL-opstigende lem. Selv om cyster var dybere og tættere på løkken i SN'er, var de faktisk mere overfladiske og tættere på DCT i JN'er (figur 6c). Igen indtog cyster en mellemposition i MN'er (figur 6c).

Figur 5|Nephron tubuli har tendens til at udvikle sig som en flad struktur. (a) En typisk vej til en nefron proksimal tubuli. Denne sti illustrerer dens tendens til at ligge i et fly. Planariteten af ​​udviklingen af ​​stien kan bedre ses, når den drejes korrekt og justeres med observatørens synsvinkel (se den højre repræsentation af det samme rørformede segment, som på venstre side er repræsenteret i en anden vinkel) . (b) Skematisk repræsentation af en rørformet bane sammensat af 4 segmenter (mellem 5 punkter, der definerer en given rørformet bane vist som et eksempel). Den grad, i hvilken stier har en tendens til at gå "ud af deres plan" kan repræsenteres af den vinkel, der er angivet her som "beta". (Fortsatte)

Figur 5|(Fortsat) Denne vinkel måles mellem segmentet p3-p4 i forhold til planet (defineret af de umiddelbart foregående punkter p3, p2 og p1) og repræsenteret af et mørkegrå rektangel i skemaet. Beregning af beta-vinkler blev derefter rekursivt beregnet langs med sættet af punkter i en rørformet bane. For at evaluere omfanget af disse beta-vinklers skævhed simulerede vi en tilfældig gang (Monte Carlosimulation [MCs]) ved at bruge det samme sæt af på hinanden følgende alfa-vinkler af hver rørformet sti (målt mellem alle på hinanden følgende segmenter). Denne tilfældige gang genererede en sti med et identisk sæt alfa-vinkler og randomiserede beta-vinkler. (c) Violinplot af den globale fordeling af beta-vinkler og resultatet af MC'er i den proksimale tubulus (PT), tynde lem (TL) af Henle-løkken, tykt opstigende lem (TAL) i Henle-løkken, distalt indviklet tubuli (DCT) ), og binderør (CNT). MC'er, P <>

DISKUSSION

Traditionelle histologiske metoder er begrænset i deres evne til at opdage patologiske ændringer, der påvirker den globale form afnefroner. Her præsenterer vi en kraftfuld tilgang baseret på sagsrydning, som har potentiale til at løse afgørende spørgsmål omnyrearkitektur med hidtil usete rumlige detaljer under normale og patologiske forhold. Vores resultater bekræftede eksistensen af ​​3 typer nefroner, som adskiller sig i deres placering, form og størrelse, i overensstemmelse med deres funktionelle specificiteter. Desuden demonstrerede vi, at nephronstender til at ligge i fly og tilpasse sig fartøjets rumlige organisation. Spændende nok, da vi anvendte denne teknik på en model af cystisk nyresygdom, observerede vi, at cyster udviklede sig i allnephrons, men kun i specifikke segmenter. Interessant nok viste vi, at cysteformen varierer afhængigt af nefronsegmentet, og at cyster langs den samme nefron interkalerer med normale ikke-dilaterede tubuli. Alt i alt giver disse resultater den første 3D (Tredimensionel) karakterisering af det rumlige arrangement afnefronerog kar og giver vigtigere grundlag for at forstå en patologisk proces, såsom ascystogenese.

Nyreoptisk clearing er udfordrende på grund af høje niveauer af autofluorescens og celletæthed. Ved at sammenligne forskellige clearing-protokoller identificerede vi i BABB en kraftfuld teknik til implementering af visualisering og rekonstruktion af strukturer placeret i den dybeste del afnyre, altså medulla. Desuden er BABB hurtig og skalerbar, og når de er ryddet, kan prøver opbevares i måneder før billedoptagelse. En anden hovedfordel ved denne teknik er dens lave omkostninger. Clearingmidler kan resultere i indsnævring eller forstørrelse af strukturer.9-17 Men fordi disse ændringer af nyrestørrelsen er isotrope, forventes de relative målinger ikke at blive påvirket eller skæve deres fortolkning. En af de vigtigste begrænsninger er annoteringen af ​​strukturer, som er meget tidskrævende. Ikke desto mindre er der et stigende antal teknikker baseret på dyb læring, som hurtigt bør overvinde denne begrænsning.

I overensstemmelse med resultaterne opnået ved klassiske teknikker viste vores undersøgelse, at nefroner adskiller sig i deres form og længde i henhold til deres position. Vi observerede især, at JN'er har mere udviklede indviklede PT'er og større glomeruli og er 2 gange længere end SN'er. Den øgede længde er resultatet af en harmonisk proces, fordi forlængelsen påvirker proportionelt alle nefronsegmenter. Vi observerede også, at JN'er har større HL. Alt i alt viser disse data klart, at mikroanatomien af ​​SN'er og JN'er er væsentligt forskellige, og at MN'erne viser mellemliggende funktioner. Interessant nok har fysiologiske undersøgelser vist detnefronerer også funktionelt forskellige.2 De morfogenetiske hændelser, der ligger til grund for disse forskelle, kendes endnu ikke. Det er derfor fristende at spekulere i, at JNs særlige struktur kan forklare specificiteten af ​​deres funktioner.

Interessant nok ved for første gang at levere 3D (Tredimensionel) rekonstruktion afnefronerog deres omgivende kar, vi opdagede en rumlig begrænsning mellem de buede kar og en undergruppe af nefroner. Det er således tænkeligt at tro, at kar kan diktere, hvordan nefroner forlænges under udvikling.34,35 Inspektionen af ​​nefronernes 3D-former kombineret med beregningssimuleringer afslørede også, at nefroner aldrig blander sig, og at hver nefron har tendens til at ligge i et plan. Den funktionelle betydning af denne observation mangler at blive belyst.

Cysteudvikling under polycystisknyresygdom er stadig en spændende proces. NPHP, en patologisk tilstand karakteriseret ved cysteudvikling, er den mest almindelige genetiske sygdom, der forårsager nyresygdom i slutstadiet hos børn og unge. Tyve NPHP-gener er blevet identificeret indtil videre.36Deriblandt koder NEK8 for et medlem af den aldrig inmitosis A-relaterede kinasefamilie, som spiller en rolle i ciliafunktion og cellecyklusprogression.37 Nek8 blev oprindeligt karakteriseret som genet muteret i jck-mus.32 Det er bemærkelsesværdigt, at amutation i det samme proteindomæne har vist sig at føre til NPHP9 hos mennesker.38 2D-undersøgelser antydede, at cysteudviklingen adskiller sig dramatisk mellem de forskellige former for polycystisk nyresygdom.27,29 Især i NPHP ser det ud til, at cyster er afledt udelukkende fra CD og DCT.31 Selvom de er informative, kan disse immunhistokemiske undersøgelser ikke argumentere imod muligheden for, at tabet af specifikke tubulære markører39 kunstigt forklarer denne observation. Således vores 3D (Tredimensionel) undersøgelse giver det første klare bevis på, at cysteudvikling er en proces, der kun involverer specifikke nefronsegmenter. Interessant nok, selvom NIMA (Never In mitosisgene A)-Relateret Kinase 8 (NEK8) udtrykkes i cytoplasmaet af alle nefronsegmenter, er dets ekspression i cilia begrænset til DCT og CD. Fordi kun disse segmenter er tilbøjelige til at udvikle cyster,31 kan vi postulere, at forstyrrelsen af ​​NEK8 ciliær funktion er den afgørende begivenhed for cystedannelse. Spændende har vi også observeret, at fusiforme cyster er i kontinuitet med normale ikke-dilaterede tubuli. Det faktum, at en recessiv kimlinjemutation kun fører til en patologisk fænotype i en undergruppe af celler, tyder på, at en anden hændelse kan udløse cysteudvikling i disse celler, som foreslået for autosomal dominant polycystisknyresygdom.40,41

Figur 6 |Tredimensionel(3D) nefronrekonstruktion afslører, at cyster kun udvikles i specifikke nefronsegmenter. (a) Repræsentative 3D-billeder med cystevolumengengivelse af en hel nefron (venstre paneler) fra glomeruli til opsamlingskanal i den overfladiske cortex (blå), midterste cortex (grøn) og juxtamedullær region (rød) i jackmus. Nephron segmentering (højre paneler) for de 3 forskellige typer afnefroner. Bar=150 mm. (b) Sandsynlighed for at udvikle cyster i de forskellige nefronsegmenter hos jackmus. (Fortsatte)

Figur 6|(Fortsat) Den vandrette akse er en normaliseret længde af nefroner svarende til 50 bins (proksimal tubuli [PT], turkis; Henleloop [HL], hvid; distal snoet tubuli [DCT], pink; forbindelsesrør [CNT], gul). (c) Repræsentative 3D-cyster-rekonstruktionsbilleder med gengivelse af cystevolumen af ​​det opadgående lem af HL (venstre paneler), DCT'er (midterpaneler) og CNT'er og kortikale opsamlingskanaler (CCD'er) (højre paneler) i overfladiske (øvre paneler), midterste (midterste paneler) paneler) og juxtamedullære (nedre paneler) nefroner i jackmus. Bar= 50 mm.

Figur 7|Karakterisering af cystefordeling og volumen i hele nefronen. (a) Kvantificering af det totale cystevolumen (summen af ​​cysterne pr. nefron) for hvert nefronsegment (Henle-løkke [HL], hvid; distalt indviklet tubuli [DCT], pink; forbindende tubuli [CNT], gul) og (b) længde af tubuli optaget af cysterne for hver type nefron (overfladisk: blå; midt: grøn; juxtamedullær: rød) hos jackmus. Data er udtrykt som middelværdi±SEM. Analyse af varians efterfulgt af Tukey-Kramer-testen: juxtamedullær nefron [JN] versus overfladisk nefron [SN]: #P < 0.05;="" jn="" versus="" mellemnephron="" [mn]:="" *p="">< 0.05,="" **p=""><>

Vi observerede også, at cysteforstørrelse er mere dominerende i JN'er end i SN'er, i det mindste i betragtning af de cyster, der befinder sig mellem PT og CNT. Konsekvent er det blevet rapporteret, at glomerulære læsioner i forbindelse med glomerulosklerose er fundet hyppigere i JN'er end i SN'er. at forværres er en interessant hypotese, der fortjener yderligere undersøgelse.

Sammenfattende beskriver vi en ny teknik til billeddannelsenyreri 3D (Tredimensionel) med tilstrækkelig molekylær specificitet og opløsning til direkte at registrere den rumlige og kvantitative fordeling af specifikt mærkede interne strukturer (nefroner, kar og cyster). I betragtning af bekvemmeligheden, hastigheden og evnen til direkte kvantificering, forventer vi, at denne teknik vil blive et stærkt værktøj til at forstå nyrepatofysiologi.

METODER

Dyr

Alle dyreprocedurer blev godkendt af "Services Vétérinairesde la Préfecture de Police de Paris" og af den etiske komité ved Université Paris Descartes. To måneder gamle FVB/N-mus (n=20) blev brugt til at opsætte den eksperimentelle betingelse fornyreclearing. Undersøgelsen blev derefter udført i 2-ugegamle jack hanmus (n=4) og kontrolkuldskammerater (n=3).

Forberedelse af nyrevæv

Før aflivning blev mus perfunderet via intrakardial kateterisering med 25 ml hepariniseret saltvand (1000 IE/l) efterfulgt af 75 ml 4 procent paraformaldehyd i fosfatpufret saltvand (PBS). Eksperimenter blev udført under xylazin (Rompun 2 procent, Bayer, Leverkusen, Tyskland, 6 mg/g kropsvægt) og ketamin (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Frankrig, 120 mg/g kropsvægt) anæstesi.

Til clearing af undersøgelser,nyrerblev fikseret i 4 procent paraformaldehyd i 4 timer og indlejret i 4 procent agarose og 1,5- mm tykke sektioner, der omgiver nyrehilum, blev skåret og opbevaret i PBS ved 4grad. Nyresektioner blev først farvet og derefter renset.

Til immunhistokemiske undersøgelser af tynde snit blev nyrerne fikseret i 4 procent paraformaldehyd natten over, og paraffinindlejrede og 4-mm snit blev skåret.

Farvning

Periodic acid-Schiff farvning. De 1.5- mmnyresektioner blev inkuberet i ren eller 1:100 PBS-fortyndet periodic acid-Schiff i 5 minutter ved stuetemperatur før clearing.

Immunhistokemi på tynde paraffinindlejrede snit. Fire-mikrometer sektioner af paraffin-indlejrede nyrer blev opvarmet til antigenudvinding og inkuberet natten over ved 44 gradermed flfluorochrom-koblede lektiner for at spore tubuli (rhodamin jordnøddeagglutinin [RL-1072-5] og rhodamin hvedekim agglutinin [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, fortyndet ved 1:200) og segment- specifikt primært antistof til at afbilde distinkte tubulære segmenter (biotinyleret Lotus tetragonolobus lectin [B-1325], Vector Laboratories, fortyndet ved 1:100; muse-anti-Calbindin D28K[D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland, fortyndet ved 1:200; gede-anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, fortyndet ved 1:200). Den næste dag blev sektionerne inkuberet med det sekundære antistof i 1 time ved stuetemperatur (Alexa Fluor 488 konjugat [S32354], Invitrogen; anti-ged Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-mus AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; alle fortyndet ved 1:500), før de farves med 40,6-diamidino-2-phenylindol. Alle billeder blev optaget med et Nikon Eclipse E800-mikroskop (Champignysur Marne, Frankrig) og forberedt ved hjælp af Fiji-software (version 1.50). Lektinfarvning på tykke snit. Den 1.5-mm tykkenyresektioner blev inkuberet ved 44 graderi 1 måned i Texas Red eller flfluorescein-isothiocyanat-koblede lektiner: jordnøddeagglutinin (RL-1072-5) og hvedekim-agglutinin (RL-1022-5), fortyndet 1:100 i 0,1 procent PBS-azid og 0,1 procent Triton-X. Sektioner blev derefter vasket hver dag i 2 uger med PBS før rensning.

Cistanche-nyre funktion

Optisk clearing

For skala-rydning, 1.5-mmnyresektioner blev inkuberet i ScaleA2 (4 M urinstof, 0,1 procent Triton X-100, 10 procent glycerol) eller ScaleB4 (8 Murea, 0,1 procent Triton X-100 ) i 2 uger, op til 1 år, ved 4grad.

Til BABB-rensning blev 1.5-mm nyresektioner dehydreret i sekventielle skylninger af ethanol ved stuetemperatur. Prøverne blev derefter inkuberet i BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) i et 1:2-forhold i mindst 2 dage ved 4 grader.

To-foton mikroskopi billedoptagelse

Væv blev afbildet med vandig gel på et omvendt multifotonmikroskop (LaVision BioTec) udstyret med en Mai Tai HP Titanium-Sapphire Laser (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Supplerende figur S1A). Excitationsbølgelængden var 815 nm ved 8 procent af effekten. Vi brugte en 20Xvandnedsænkningsobjektiv (XLUMPLFL20XW,Olympus [Tokyo, Japan]; numerisk blænde, 0.95; arbejdsafstand, 2.0 mm). Til fluorescenserhvervelse brugte vi en ikke-descannet detektor ved 80 procent med et båndpasfilter på 593/40 nm.

Det første trin bestod af 2D-mosaikbilledoptagelse ved den midterste z-stabel ved at bruge suboptimale optagelsesparametre (400 mm X400 mm og 1011X1011 pixels, med 10 procent overlap og en lineavering ved 2) for at guide udvælgelsen af ​​de mest relevante centrale felter (Supplerende figur S9A) ). Når XY-gitteret og z-felterne af interesse var defineret, blev parametrene justeret for at opnå billeder af høj kvalitet. En sådan tilgang reducerede interesseområdet til 5X12 felter pr. z-stak. Derefter anskaffede vi 850 z stakke/optiske skiver (1-mm trinstørrelse) omkring nyrehilum i den midterste del afnyreafsnit.

Billedsammensætning, behandling og sporing Hver stak blev flisebelagt i henhold til metoden udviklet af Preibischet al.,43, som tillader sammensætning af en stor samling billeder ved hjælp af "Grid/Collection stitching" plugin fra Fiji-softwaren (HTTP://Fiji. sc/Fiji). Fordi vi observerede et vigtigt skift mellem 2 tilstødende billeder efter syning, skrev vi et tilpasset matchende program i Python. Dette program kompenserer for billedforskydningen, hvilket gør det muligt at justere billederne korrekt (Supplerende figur S9B). Stitched-korrigerede billeder blev analyseret ved hjælp af Imaris version 8.4.2 (Bitplane, Zürich, Schweiz). Tubuli og kar blev sporet ved hjælp af Imaris filamentsporingspakkes manuelle tilstand og forenet af en Imaris Xtension, som vi udviklede med MATLAB(https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Deltag_ Filament_Tool.zip?dl=0) (Supplerende figur S9C). Glomeruliand-cyster blev 3D-rekonstrueret ved hjælp af den manuelle tilstand af overfladepakken af ​​Imaris. Den 3D (Tredimensionel) glomeruli rumlig organisation blev vist ved hjælp af den manuelle tilstand af spot-pakken af ​​Imaris.

Morfometri

Rørsegmentlængde, nefronlængde og rethed blev bestemt ved hjælp af filamentsporingspakken fra Imaris. Ifølge Imaris software blev rethed kvantificeret som forholdet mellem afstanden mellem 2 punkter og længden af ​​nefronsegmentbanen. Enogtredive PT'er og 12 helenefronerblev rekonstrueret og målt i 3 vildtype mus, hvorimod 37 PT'er og 17 wholenephroner blev rekonstrueret og målt i 4 jack-mus. Cyste- og glomerulære volumener blev bestemt under anvendelse af "overfladepakken" af Imaris. Enogtredive og 34 glomeruli blev målt i henholdsvis vildtype- og jackmus. 74 cyster blev målt i alt.

Vinklerne "ud af planet" af rørformede vindinger (angivet som "beta") blev målt mellem planet (defineret af 3 på hinanden følgende punkter) og retningen med det næste på hinanden følgende fjerde punkt i rummet (figur 5b). For at evaluere den statistiske signifikans af den observerede bias, simulerede vi fordelingen af ​​beta-vinkler med tilfældig rotation af beta-vinkler (Monte Carlo-simulering) i strukturer, der var sammensat af de samme segmenter med det samme sæt alfa-vinkler.

Til beregning af sandsynligheden for at udvikle en cystisk læsion sammen med nefronsegmenter repræsenterede vi hver nefron med et sæt punkter i rummet. Hvert punkt blev kommenteret med hensyn til tilstedeværelsen af ​​cyste versus normal struktur og typen af ​​segment. Sandsynligheden for hver standardiseret længde (sat til 50 bins) blev beregnet som forholdet mellem antallet af punkter med cystisk annotering og det samlede antal punkter i beholderen.

Til beregningen af ​​den gennemsnitlige glomerulære interdistance betragtede vi for hver glomerulus den gennemsnitlige glomerulære interdistance beregnet på de nærmeste 5 glomeruli.

Dataanalyser og statistik

Data er udtrykt som middel ±SEM. Forskelle mellem de eksperimentelle grupper blev evalueret ved hjælp af variansanalyse efterfulgt, når signifikant (P < {{0}}.05),="" af="" tukey-kramer-testen.="" når="" kun="" 2="" grupper="" blev="" sammenlignet,="" blev="" mann-whitney="" testen="" brugt.="" statistiske="" analyser="" blev="" udført="" ved="" hjælp="" af="" graph="" prism-software="" (sandiego,="" ca,="" version="">

AFSLØRING

Alle forfatterne erklærede ingen konkurrerende interesser.

ANKENDELSER

Vi takker Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese(LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative deRecherche Necker for teknisk assistance. Vi takker Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler og Nicolas Kuperwasser for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, RochePharma Research and Early Development (Basel, Schweiz) , og Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paris, Frankrig).

FORFATTERS BIDRAG

TB, NG og MZ designet og udførte eksperimenterne og analyserede dataene. FB, LT, MGT og SG udførte også nogle eksperimenter og analyserede dataene. MB og CN udførte museeksperimenterne. TB og MZ bidrog også til at skrive manuskriptet.GF reviderede manuskriptet. FT og MP leverede den konceptuelle ramme og designede undersøgelsen, overvågede projektet og skrev papiret.

Cistanche-Tredimensionel arkitektur af nephrons nyre

SUPPLERENDE MATERIALE

Supplerende fil (PDF)

Figur S1. Eksperimentel opsætning, anskaffelsesprocedure og billedbehandling.

Figur S2. Grænser for autofluorescenssignal i XY- og z-opløsninger.

Figur S3. Et todimensionelt billede af overgangen mellem PT og TL på 4-mm paraffinindlejretnyresektioner.

Figur S4. Et todimensionelt billede af overgangen mellem TAL og DCT på 4-mm paraffinindlejrede nyresektioner.

Figur S5. Et todimensionelt billede af overgangen mellem DCT og CNT på 4-mm paraffinindlejrede nyresektioner.

Figur S6. Tredimensionel rekonstruktion afslører 3 forskellige former af proksimale tubuli.

Figur S7.Tredimensionelrekonstruktion afslører, at længden og segmenteringen afnefronerer ikke påvirket af cyster.

Figur S8. Tætheden af ​​glomeruli i kontrol og cystisknyrer.

Figur S9. Acquisition procedure og efterbehandling billedbehandling.Tabel S1. Sammenligning af clearingmetoder. Supplerende fil (film)

Film S1. Lektinfarvning forbedrer opløsningen og signal-til-baggrundsforholdet markant.

Film S2. Sporing af en tubulis vej.

Film S3. Tredimensionel rekonstruktion af en ryddet nyre, der viser overgangen mellem den proksimale tubuli og den tynde lem af Henle-løkken.

Film S4. Tredimensionel rekonstruktion af en ryddet nyre, der viser overgangen mellem den tykke opadgående lem af Henleloop og den distale sammenviklede tubuli.

Film S5.Tredimensionelrekonstruktion af en ryddetnyreviser overgangen mellem det distale, indviklede rør og det forbindende rør.

Film S6. Formen og størrelsen af ​​proksimale tubuli varierer i henhold til deres dybde.

Film S7. Tredimensionel nefronrekonstruktion i kontrolmus.

Film S8. Sporing af et kars vej fra et bueformet kar til akortikalt strålekar.

Film S9. De bueformede kar modellerer formen af ​​de juxtamedullaryproximale tubuli.

Film S10.Nefronerhar tendens til at ligge i et fly.

Film S11. Tredimensionel nefronrekonstruktion viser et specifikt mønster for cysteudvikling.

Film S12.Tredimensionelnefronsegmentering afslører, at cyster udvikler sig i specifikke nefronsegmenter.

Film S13. Rumlig indretning og indbyrdes sammenhæng afnefronerog kar i en polycystisknyre.

REFERENCER

1. Rig AR. En hidtil ubeskrevet sårbarhed af juxtamedullaryglomeruli ved lipoid nefrose. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173-186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Heterogenitet af nefronanatomi. Nyre Int Suppl. 1987;20:S25-S39.

3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al.Tredimensionelrekonstruktion af rottenefronet. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.

4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Digital tredimensionel rekonstruktion og ultrastruktur af musens proksimale tubuli. J Am Soc Nephrol.2003;14:611-619.

5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Tredimensionel rekonstruktion af musens nefron. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77-88.

6. Puelles VG, Møller MJ, Bertram JF. Vi kan se klart nu: optisk clearing ognyremorfometri. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179-186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Clearing- og mærkningsteknikker for biologiske væv i stor skala. Mol celler. 2016;39:439-446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Leipzig, Tyskland: S. Hierzel; 1914.

9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Skala: en kemisk tilgang til fluorescensbilleddannelse og rekonstruktion af den gennemsigtige musehjerne.Nat Neurosci. 2011;14:1481-1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al.Tredimensionelbilleddannelse af organer, der er renset med opløsningsmiddel, ved hjælp af 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983-1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: en detergent- og opløsningsmiddelfri rensningsmetode for neuronalt og ikke-neuronalt væv. Udvikling. 2013;140:1364-1368.

12. Ke MT, Imai T. Optisk clearing af fikserede hjerneprøver ved hjælp af SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY til kortlægning af nervesystemet. NatMethods. 2013;10:508-513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY til hurtig og højopløselig billeddannelse af intakt væv. Nat Protoc. 2014;9:1682-1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Enkeltcellet fænotypning i gennemsigtigt intakt væv gennem helkropsrensning. Celle. 2014;158:945-958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Billeddannelse af hele hjernen med enkeltcelleopløsning ved hjælp af kemiske cocktails og beregningsmæssig analyse. Cell.2014;157:726–739.

17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Tomografisk molekylær billeddannelse og 3D-kvantificering i voksne museorganer. Nat Methods.2007;4:31–33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Multifotonmikroskopi af ryddede museorganer. J Biomed Opt. 2010;15:036017.

19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: en enkel, hurtig metode til at immunmærke store vævsprøver til volumenbilleddannelse. Celle. 2014;159:896-910.

20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Forbedret anvendelse af den elektroforetiske vævsrensningsteknologi, CLARITY, på intakte faste organer, herunder hjerne, bugspytkirtel, lever,nyre, lunge og tarm. BMC Dev Biol. 2014;14:1-7.

21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Øget glomerulært kapillærtryk og størrelse medierer glomerulosklerose i SHR juxtamedullarycortex. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365-F373.

22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Billeddannelse af nyren: fra lys til superopløsningsmikroskopi. Nephrol Dial Transplant.2021;36:19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validering af en tredimensionel metode til at tælle og dimensionere podocytter i helglomeruli. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093-3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Rolle aftredimensionellearkitektur i den urinkoncentrerende mekanisme i den renale indre medulla. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. Optisk clearing i nyren afslører spotassium-medieret tubuli-ombygning. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Kombineret strukturel og funktionel billeddannelse af nyrerne afslører store aksiale forskelle i proximal tubulus endocytose. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696-2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Polycystisknyresygdom. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.

29. Wilson PD. Polycystisk nyresygdom. N Engl J Med. 2004;350:151-164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Ændringer i glykosyleringsmønsteret under embryonal udvikling af musenyre som afsløret med lectinkonjugater. J Histochem Cytochem. 1987;35:55-65.

31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Udvikling af polycystickidneysygdom hos juvenile cystiske nyremus: indsigt i patogenese, ciliære abnormiteter og fælles træk ved menneskelig sygdom. J AmSoc Nephrol. 2006;17:2821-2831.

32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. En defekt i en ny kinase fra Nek-familien forårsager cystisk nyresygdom hos mus og zebrafisk. Udvikling.2002;129:5839–5846.

33. Franke M, Baeßler B, Bechtel J, et al. Magnetisk resonans T2-kortlægning og diffusionsvægtet billeddannelse til tidlig påvisning af cystogenese og respons på terapi i en musemodel for polycystisk nyresygdom.NyreInt. 2017;92:1544-1554.

34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Molekylær determinanter af nefron vaskulær specialisering inyre. Nat Commun. 2019;10:5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endotel-epitelkommunikation i polycystisknyresygdom: rolle for signalering af vaskulær endotelvækstfaktor. Cellesignal. 2020;72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Mange gener-en sygdomme? Genetik af nefronophthisis (NPHP) og NPHP-associerede lidelser. Front Pediatr. 2017;5:287.

37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Cellecyklusregulering af NEK-familien af ​​proteinkinaser. J Cell Sci. 2012;125:4423-4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. NEK8-mutationer påvirker ciliær og centrosomal lokalisering og kan forårsage nefronophthisis. J Am SocNephrol. 2008;19:587-592.

39. Wilson PD. Apico-basal polaritet i polycystisk nyresygdom epitel.Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239-1248.

40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Toksisk tubulær skade i nyrer fra Pkd1-deletionsmus accelererer cystogenese ledsaget af dysreguleret plan cellepolaritet og kanoniske Wnt-signalveje. Hum Mol Genet. 2009;18:2532-2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. En kritisk udviklingsomskifter definerer kinetikken for nyrecystedannelse efter tab af Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490-1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mekanisme af den unikke modtagelighed af dybe corticale glomeruli af modningnyrertil svær fokal glomerulær sklerose. Pediatr Res. 1990;28:270-276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Globalt optimal syning af flisebelagt 3D (Tredimensionel) mikroskopiske billedoptagelser. Bioinformatik. 2009;25:1463-1465.