Del Ⅱ: Overekspression af PKD1 forårsager polycystisk nyresygdom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté og Marie Trudel

De underliggende patogenetiske mekanismerautosomal dominant polycystisk nyresygdom(ADPKD) mangler at blive belyst. Mens der er bevis for, at PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen-haploinsufficiens og tab af heterozygositet kan forårsage cystedannelse hos mus, paradoksalt nok høje niveauer af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) ekspression er blevet påvist i nyrerne hos ADPKD-patienter (autosomal dominant polycystisk nyresygdom). For at bestemme, om PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) funktionsforøgelse kan være en patogenetisk proces, en PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) bakterielt kunstigt kromosom PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-BAC) blev modificeret ved homolog rekombination til udelukkende at målrette en vedvarende PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) udtryk fortrinsvis til den voksne nyre. Der blev genereret adskillige transgene linjer, der specifikt overudtrykte PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) transgen i nyrerne 2- for at 15-folde over PKD1 (polycystisk nyresygdom1) endogene niveauer. Alle transgene mus udviklede reproducerbart tubulære og glomerulære cyster og nyreinsufficiens og døde af nyresvigt. Denne model viser, at overekspression af vildtype PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) alene er tilstrækkeligt til at udløse cystogenese, der ligner human ADPKD (autosomal dominantpolycystisk nyresygdom). Vores resultater afslørede også en slående øget renal c-Myc-ekspression i mus fra alle transgene linjer, hvilket indikerer, at c-Myc er en kritisk in vivo nedstrøms effektor af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) molekylær vej. Denne undersøgelse producerede ikke kun en uvurderlig og første PKD（polycystisk nyresygdom）model til at evaluere molekylær patogenese og terapier, men giver også bevis for, at funktionsforøgelse kan være en patogenetisk mekanisme i ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom).

Cistanche til behandling af nyresygdom

KLIK HER FOR AT DEL Ⅰ

RESULTATER

Produktion af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-Ac-BAC ved homolog rekombination. For at bestemme, om PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) funktionsforøgelse alene er tilstrækkelig til at producere ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) fænotype, vi isolerede først en genomisk klon indeholdende hele PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen i et BAC vektor 129/Sv bibliotek. Dette bibliotek blev screenet ved PCR med to sæt primere for PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen, der spændte over exon 1 ved 5'-enden og exoner 39 til 40 mod 3'-enden (fig. 1). En positiv BAC-klon for PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen blev identificeret, som omfattede hele det tilstødende Tsc2-genlegeme. PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) indsættelsen blev karakteriseret i detaljer for at sikre, at den genomiske struktur matchede den endogene PKD1 (polycystisk nyresygdom1) gen fra 129/Sv-musestammen, hvorfra insertet var afledt, og fra den indavlede C57BL/6J-stamme. Genomiske kort over PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) locus i BAC og i disse indavlede stammer ved Southern blot-analyse, med fire restriktionsenzymfordøjelser og syv prober, der dækker hele PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-genet, forekom identisk uden tegn på omlejringer (fig. 1). Denne BAC indeholdt en -121-kb insert inklusive ~37 kb upstream og -39 kb af en downstream sekvens af PKD1 (polycystisk nyresygdom1) gen som bestemt ved elektroforese og sekventering.

FIG. 2.Produktion af SBPkdlrAc-konstruktioner og transgene mus. (a) Successive homologe rekombinationshændelser blev udført på den murine Pkdl-BAC for at introducere to modifikationer: SB regulatoriske elementer indsat umiddelbart opstrøms for Pkdl initieringskodonen og en tavs punktmutation af EcoRI (RI*) introduceret i exon(ex) 10. BAC-rekombinationsvektoren indeholder et R6Ky-replikationsstartsted, et ampicillin-resistent gen, et SacB-gen, et RecA-gen og et unikt Smal-kloningssted, hvori de "SB"-regulatoriske elementer (eller exon 10-stille punktmutationen) blev klonet. med flankerende Pkd1-genarme. BAC-rekombinationsvektoren blev elektroporeret ind i E, coli (DH10B)-celler indeholdende Pkdl-BAC-vildtypen, og efter selektion opstod en første homolog rekombinationsbegivenhed via en af ​​de to Pkd1-arme for at producere BAC-kointegrater. Rekombinationsvektoren og duplikerede Pkdl-regioner af BAC-kointegraterne blev elimineret i et andet selektionstrin. Opløste Pkdl-BAC'er kan enten vende tilbage til vildtype eller inkludere den tilsigtede modifikation. Efterfølgende homolog rekombination i den nyligt modificerede BAC kan derefter indføres.(b)(ienomc DNA ot SBPkd l-etransgent mxce blev anakZed bv Sou thern blot.AVicToiD1ecLon af lineariserede fragmenter forårsagede insertion af transgenet i et head-to-head head. -til-hale og/eller hale-til-hale orientering. 5'-enden blev analyseret ved fordøjelse af genomisk DNA med HindIII og hybridiseret med den specifikke transgene SB-probe (venstre panel). Alle tre transgene muselinjer genererede de forventede 10 .9-kb-bånd til hoved-til-hale-insertion; det yderligere bånd observeret i linje 39 repræsenterer højst sandsynligt et forbindelsesfragment mellem SB og musegenomet. Transgenets indre integritet blev overvåget af adskillige restriktionsenzymfordøjelser, og et repræsentativt blot af genomisk DNA fordøjet med EcoRI og hybridiseret med Pkdl-proben (exon 7-15) er vist (midterste panel).

Denne SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-BAC-klon blev modificeret ved to successive homologe rekombinationshændelser i E. coli. PKD1-genet (polycystisk nyresygdom 1) blev mærket i exon 10 ved at substituere et nukleotid (G til A) for at skabe et nyt EcoRI-sted i position 2355 på cDNA-kortet. Denne tavse punktmutation blev produceret for at skelne mellem PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen og transkript af BAC fra det af endogen oprindelse. Derudover har vi erstattet de 5'regulatoriske elementer i PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-BAC-gen ved at drage fordel af tidligere identificerede "SB" nyreepitelspecifikke elementer fra SBM (linket til c-Myc) eller SBF koblet til c-fos-konstruktionen-trans-genet for at begrænse ekspression til nyrerne (36, 38)(fig. 2a).

Denne nye SBPkdlrAG-BAC blev fordøjet med NotL, et unikt sted placeret umiddelbart opstrøms for SB-elementerne, og ClaI i Tsc2-genlegemet, der trunkerede de Tsc2-regulatoriske elementer og 5'-halvdelen af ​​genkroppen for at sikre mangel på T'sc2 eksogen ekspression i alle væv og for at fjerne de prokaryote BAC-vektorsekvenser (fig. 1 og 2). Dette 70-kb NotI-ClaI lineariserede fragment blev isoleret, oprenset. og kvantificeret til oocytmikroinjektion (36).

CISTANCHE FORDEL: BEHANDLING AF NYRESYGDOMME

Produktion og analyse af SBPkdl-ac transgene mus. Fire transgene grundlæggere, der bar flere kopier af SBPkdlrAc-transgenet, udviklede konsekvent PKD. Fra de fire SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1)RAC-grundlæggermus bestemt ved Southern-analyse, tre SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1)TAG-transgene linjer blev etableret med to til ni kopier af transgenet (fig. 2b). Karakterisering af transgenintegriteten i disse linjer blev overvåget med 5'-, interne og 3'-prober som vist ved repræsentative eksempler i fig. trans-gen er integreret i en hoved-til-hale-orientering og afsløret med 3'-proben et 7.1-kb-bånd (fig. 2b). Derudover detekterede den interne probe det 9.4-kb endogene PKD1-bånd (polycystisk nyresygdom 1) såvel som 6.9-kb- og 2.5-kb-båndene af transgenet på grund af EcoRI-indsættelsesstedet i exon 10 (fig. 2b). Disse mus indeholdt komplette kopier af transgenet baseret på den genomiske overlappende strukturanalyse.

PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) funktionsforøgelse i voksne SBPkdl-Ac transgene mus. Udtryk af SBPkdl-AG. transgen og PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen blev undersøgt i forskellige organer. Kvantificering af transkriptniveauer fra transgenet og/eller det endogene gen blev udført ved Northern blot-analyse (fig. 3a). Som forventet var transgene og endogene gentranskripter af lignende længde (14,2 kb). Baseret på kontrol-GAPDH-ekspression havde nyrer fra alle SBPkd 1 A-muselinjer konsekvent øget transkriptekspression sammenlignet med normal PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) niveauer i voksne nyrer (n=3) af lignende alder. Renalt transgen og endogen ekspression for de forskellige transgene linjer udviste et interval på 2- til 15-fold over den endogene kontrol nyre PKD1(polycystisk nyresygdom 1)niveauer (Fig.3a). Især viste den transgene linje 39(n=4) højere PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) niveauer end linje 3 (n=3) og 41(n=4). Ydermere, PKD1 (polycystisk nyresygdom 1Ekspressionsniveauer målt ved Northern blot-analyse korrelerede med dem opnået ved realtids-PCR under anvendelse af primere i exon 1 og 2 (fig. 3b).

FIG. 3.Renal ekspressionsanalyse af SBPkdlrA-mus. (a) Ekspressionsanalyse af Pkd1 endogene (endo) og SBPkdlrA transgene (Tg) transkripter i nyrer fra tre transgene linjer ved Northern blotting. To prøver fra hver transgen linje, 3, 39 og 41, blev sammenlignet med endogent nyre-Pkdl-transkript af normale kontrol-aldersmatchede mus fra den samme genetiske baggrund (C5BI 6I ×CBA/DE, nyre-RNA-prøver blev opnået fra transgene mus før nyresygdom i slutstadiet. Transkripter fra endo og Tg er begge -14,2 kb lange. En systematisk overekspression af transkripterne blev observeret i nyrerne hos alle transgene mus i forhold til ikke-transgene kontroller. GAPDH blev brugt som en intern kontrol kvantificering af nyreekspression i disse transgene mus varierede fra 2- til 15-fold i forhold til Pkd1-endogene niveauer fra kontrolmus vilkårligt sat til 1. (b) Skematisk repræsentation af SBPkdl-. transgen og primere blev brugt til at amplificere total Pkdl inklusive endogent og transgen (exon 1 og exon 2) og kun Pkd1 transgen (B. exon 2) ved real-time PCR og semikvantitativ RT-PCR, RT-PCR analyse af SBPkdlAc transgenekspressionen blev kvantificeret i renal og ekstra nyrevæv. En repræsentativ semikvantitativ evaluering af SBPkdl.Ac-transgenet (Tg) er vist, der inkluderer en nyrevævsprøve (K) fra én mus af alle tre transgene linjer (3. 39 og 41) og af ekstrarenalt væv. H, hjerte; Lu, lunge; B. hjerne; Li, lever; og S. milt fra en mus af linje 39. Ekspression af transgenet er let påviselig i nyrerne hos alle transgene mus, hvorimod det er lavt til upåviselig i ekstrarenalt væv. Ekspression fra SBPkd1rAc-transgenet producerede et specifikt 307-bp-amplikon, hvorimod den interne S16-kontrol genererede et 102-bp-amplikon. M,100-bp markør; H, O, negativ kontrol for PCR-amplifikation. (c) Realtids PCR-ekspressionsanalyse af SBPkdlr. Transgenet blev bestemt fra flere uafhængige mus. SBPkdl.Ac-transgenet fra de tre transgene muselinjer 3 (n=5),39(n =7) og 41 (n=5) viste, at linje 39 og 41 havde den højeste nyreekspressionsniveauer. Ekspression af SBPkdlrAc-transgen i ekstrarenalt væv fra mus (n=3) af de tre transgene linjer blev evalueret ved real-time PCR. Sammenlignet med nyrerne i hver transgene linje (100 procent) viste analyse af ekstrarenalt væv, at transgenekspressionsniveauer konsekvent var 10- til 1,000-fold lavere i hjernen, hjertet, leveren, bugspytkirtlen , milt og lunge. (d) Ekspression af det endogene c-mc-gen i SBPkdl.Ac-nyrerne ved semikvantitativ RT-PCR. En skematisk illustration viser de primere, der anvendes til at amplificere c-Myc. Som forventet er ekspression af c-Myc minimal i voksne ikke-transgene nyrer (kontroller). I modsætning hertil påvises øget ekspression af c-Mye i alle voksne SBPkdlrAc-nyrer af de tre linjer, som observeret i de voksne transgene SBM-nyrer brugt som en positiv kontrol. Amplikonet af c-Myc var 250 bp; amplikonet for S16, en intern kontrol, var 102 bp.M,100-bp markør.

Kvantificering af transgenekspressionsniveauerne blev specifikt udført ved realtids-PCR og semikvantitativ RT-PCR i de tre transgene linjer i voksen alder ved at bruge primere i den 5'-utranslaterede region (B, -globin-promotor) og i exon 2 af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)(Fig. 3b). SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1) RAC-ekspression i transgene mus blev sammenlignet med S16-ribosomalt proteingenproduktet som en intern standard. Betingelser anvendt til semikvantitativ RT-PCR-amplifikation var inden for det lineære område. Transgenekspression ved real-time PCR og semikvantitativ RT-PCR viste konsekvent og specifikt den højeste ekspression i nyren af ​​alle transgene linjer i forhold til andre organer (fig. 3b og c). Renale ekspressionsniveauer for en individuel prøve var reproducerbare med enhver af de anvendte detektionsteknikker. De højeste niveauer af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) transgen nyreekspression blev målt for linje 39 og 41. For at overvåge, om den øgede PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) ekspression skyldtes transgenet eller det endogene gen, blev den samme gruppe af mus fra de tre transgene linjer sammenlignet for renal PKD1 ( polycystisk nyresygdom 1) transgenekspression og for renal PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)total (transgen og endogen) ekspression ved real-time PCR. Interessant nok. linje 39 og 41 i forhold til linje 3 viste, at den øgede PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)transgen nyreekspression svarede til eller over den for PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) total nyreekspression, hvilket peger på transgenet som specifikt ansvarligt for denne inducerede ekspression. I forskellige organer (herunder hjerte, lunge, hjerne, lever, bugspytkirtel og milt), SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1) RAC; transgen viste meget svag ekspression lejlighedsvis påvist i milt og lunge, med lidt til upåviselig ekspression i andre organer (fig. 3b). Kvantificering ved realtids-PCR viste et 10-til 1,000- gang lavere niveau af transgenekspression i ekstrarenale væv i forhold til nyreekspression (fig. 3c). De "SB" regulatoriske elementer af SBPkdlrAc-transgenet bidrog præferentiel renal ekspression; denne særlige organfordeling blev også bestemt, når den blev brugt i transgener knyttet til c-Myc (SBM) og c-fos(SBF)(36, 38). c-Mye, en nedstrøms effektor af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) signalveje i SBPkdlrAc: mus. For at få indsigt i den intracellulære patogenetiske mekanisme af SBPkdlrAc transgene mus, søgte vi derefter at overvåge c-Myc renal ekspressionsniveau baseret på vores tidligere observation af c-Myc deregulering i human ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) nyrer (22). Analyse af nyrer blev udført fra alle tre transgene linjer 3(n=4).39(n=7), og 41 (n =4) ​​såvel som kontroller (n {{9) }}).Som vist i fig. 3d er der en væsentlig ekspression af endogen c-Mye induceret i SBPkdlrAa-mus i forhold til kontrolmus af lignende alder. Interessant nok nåede niveauet af c-Myc-ekspression i nogle SBPkdlrAG-nyrer, især linje 39, niveauer, der var sammenlignelige med det, der blev observeret i den transgene PKD SBM-musemodel produceret af renal c-Myc-ekspression.

Nyreanomalier i SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 for hver linje) udviklede multiple tubulære (T) og glomerulære cyster (G) (Fig. 4d, f og g). Cyster blev observeret i tubuli fra de kortikale og medullære regioner samt opsamling af tubuli fra papillen (fig. 4d og e). Transgene mus udviste tubulær epitelhyperplasi (pilespids), der involverede både cystiske og ikke-cystiske tubuli og hyppig hypertrofi (fig. 4g og h). men sværhedsgraden varierede mellem individuelle mus. Interstitiel fibrose (F), perivaskulær lymfoide infiltrater og proteinholdige afstøbninger (P) blev hyppigt observeret (fig. 4d og e)

Fig. 4

For mere præcist at definere lokaliseringsstedet for øget PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) ekspression i nyrerne, udførte vi in ​​situ hybridisering under anvendelse af den tidligere anvendte exon 36-45-probe(16). Hybridiseringssignalet var lokaliseret specifikt til epitelcellerne, der beklædte cyster og hyperplastiske tubuli samt glomerulære cyster. Derudover blev der set et eller andet signal over epitelet af ikke-cystiske eller let dilaterede tubuli, hvilket sandsynligvis identificerede tubuli forudbestemt til at gennemgå fremtidige cystiske forandringer (fig. 4i og j). Renal histologisk analyse blev også udført på transgene mus ved fødslen (n=8), postnatal dag 10(P10)(n=3),P20(n=5),P35(n{ {10}}), og P45(n= 3) i sammenligning med negative kuldkammerater i samme aldersgruppe (n =2 til 4). Interessant nok udviste alle nyfødte transgene mus tubulær og glomerulær dilatation i forhold til kontrol negative kuldkammerater (fig. 4k og 1), hvilket indikerer, at nyreanomalier startede in utero som observeret i SBM-mus og i ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) patienter. Den tubulære og glomerulære dilatation steg i størrelse og antal med progressiv alder. Ved P35 udviste transgene mus mere alvorlig hyperplasi og tegn på glomerulosklerose Ændrede nyrefysiologiske funktioner i SBPkdlrsc-mus. Renale fysiologiske funktioner hos alle transgene mus viste egenskaber, der ligner PKD, mens de ikke-transgene kuldkammerater aldrig udviklede sygdommen. Inden for få måneder efter fødslen udviklede de ramte dyr kronisk nyreinsufficiens. Disse dyr blev overvåget for nyrefunktionelle parametre ved måling af serum- og urinniveauer. blodurinstofnitrogen (BUN) og kreatinin, urinosmolalitet, urinprotein og ionudskillelse (tabel 1). Alle mus fra de tre linjer sammenlignet med kontroller viste koncentrationsdefekter, et almindeligt fund i ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom). og viste følgelig nedsat urin BUN. kreatinin-, protein- og jernkoncentrationer. Transgen SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1)rAc.foundere og afkom (n=6) fra hver linje blev overvåget kvalitativt for proteinuri på urinprøver ved SDS-PAGE (fig. 5). Mus ældre end 2 måneder viste ikke-selektiv proteinuri, der udviklede sig med alderen. Derudover blev niveauerne af serum-BUN og serum-kreatinin øget, hvilket afslørede nyreinsufficiens (tabel 2). Fordi kronisk nyreinsufficiens almindeligvis fører til ændringer i hæmatologiske parametre, blev disse undersøgt i SBPkdlAc transgene mus i alderen 3 til 14 måneder (tabel 2). Disse transgene mus var anæmiske, som det fremgår af det signifikant reducerede antal røde blodlegemer, hvor hæmoglobin og hæmatokrit nåede halvdelen af ​​de normale niveauer. Andre parametre for røde blodlegemer, såsom procentdelen af ​​retikulocytter, var upåvirket, som forventet, når de var induceret af en nyredefekt. Disse dyr døde konsekvent af nyresvigt ved -5.9± 2,8 måneders alderen (n {{12} }) for transgene linje 39 og i senere aldre,-14.6± 3,1 måneder (n= 20)og-11.7 ±6,5 måneder (n=7) , for henholdsvis linje 3 og 41.

VIRKNINGER AF CISTANCHE: BEHANDLING AF NYRESYGDOMME

DISKUSSION

Heri rapporterer vi isolering og karakterisering af en murin PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-BAC. Denne PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen blev mærket, og regulatoriske elementer blev erstattet for at målrette ekspression specifikt til nyrerne af to på hinanden følgende homologe rekombinationshændelser. Transgene mus produceret med dette nye SBPkdlrAG-gen viste en 2-til 15-fold stigning i PKD1-udtryk (polycystisk nyresygdom 1) og reproducerbart udviklede tidlige nyremorfologiske ændringer, der er typiske for PKD. Nyreinsufficiens er tydelig i middelalderen, og mus dør for tidligt af nyresvigt. Vores resultater indikerer også, at PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) overekspressionsmekanisme, der er ansvarlig for denne fænotype, medieres ved at signalere aktivering af c-Myc in vivo. Denne undersøgelse viser, at den murine PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) funktionsforøgelse i nyrerne er tilstrækkelig til at producere en PKD-nyrefænotype.

Siden den murine PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen ikke duplikeres, som det er hos mennesker (27), har vi direkte identificeret og isoleret en BAC-klon, der indeholdt hele PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen. Komplet karakterisering af 129/Sv murine PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-BAC. indirekte sammenligning med to andre indavlede musestammer bekræftede integriteten af ​​PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-locus. PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-BACinsert indeholdt -37 til 39 kb opstrøms- og nedstrømssekvenser fra PKD1-genet (polycystisk nyresygdom 1). Vores analyse viste, at PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen i denne BAC var et bona fide murint vildtype locus, der kunne tjene til yderligere undersøgelser.

Selvom der er stærke beviser for, at cystedannelse i ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) kan skyldes tab af heterozygositet efter somatisk inaktivering af den normale PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) allel(3.21.32), er der også tydende beviser for vedvarende eller endda øget polycystin-1-ekspression i det cystiske tubulære epitel (22.29). Sidstnævnte observation rejser spørgsmålet om, hvorvidt overekspression af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) i sig selv er en tilstrækkelig nærliggende årsag til cystogenese. I transgene mus, der bærer den humane PKD1 (polycystisk nyresygdom 1), TSC2. RAB26. NTHL1- og SLC9A3R2-gener, kun et mindretal af mus udviklede cyster, og ingen havde påviselig transgenekspression i voksenalderen på trods af 30 kopier af transgenet (31). I de transgene mus. det var vanskeligt at etablere en klar rolle for PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) overekspression i cystogenese. Vores model adskiller sig, da to til ni vildtype kopier af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) alene, uden sammenhængende gener, blev integreret i transgene mus. Da PKD1-genet (polycystisk nyresygdom 1) har væsentlige funktioner i forskellige organer eller væv, som beskrevet for adskillige mus med ablation af PKD1-genet (polycystisk nyresygdom 1), er en systemisk overekspression af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) kan føre til yderligere forvirrende effekter. Derfor har vi behandlet rollen som PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) funktionsforøgelse ved hjælp af en tilgang, der retter sig mod PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) specifikt til nyrerne. Ved homolog rekombination har vi først erstattet PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) opstrøms regulatorisk region med de "SB" nyrebegrænsede regulatoriske elementer og derved forhindret den nedsatte genekspression, der normalt ses for PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)i voksenlivet samt potentiel sekundær feedback-sløjferegulering(36,38). For det andet har vi markeret den murine PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) transgen(Pkdlr) med en tavs punktmutation i exon 10, men indsatte ikke et epitopmærke for at sikre, at et fuldt funktionelt "vildtype"-protein med bevaret struktur og integritet ville blive produceret. Fra denne modificerede BAC blev et SBPkdlrAG-fragment oprenset væk fra Tsc2-genet og BAC-vektoren for at forhindre interferens fra Tsc2-genet, som også kan inducere en cystisk fænotype (8.20.28). samt at undgå den hæmmende effekt af prokaryote sekvenser(5).

Fire forskellige SBPkdlrActransgene grundlæggermus og tre uafhængige linjer blev produceret med specifik renal PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-forstærket udtryk. Særligt slående er den fuldstændige penetrering af fænotypen i disse transgene mus. SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1) rAc-grundlægger- og muselinjer delte adskillige fysiopatologiske træk til fælles med ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom). Disse omfatter udviklingen af ​​cyster i cortex, medulla og glomeruli sammen med epitelhyperplasi, interstitiel fibrose og fokal interstitiel inflammation.

Fordi PKD-fænotypen konsekvent blev observeret i alle forskellige transgene grundlæggermus, og transgenintegrationen i musegenomet er et tilfældigt fænomen, kan fænotypen ikke skyldes kromosomal positionseffekt, men kun fra øget PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)udtryk. Faktisk blev ekspression af PKD1-transgenet (polycystisk nyresygdom 1) i alle linjer påvist at være nyrebegrænset. som tidligere observeret for andre transgener reguleret af "SB"-elementerne (36,38). Desuden var denne øgede PKD1-ekspression (polycystisk nyresygdom 1) forårsaget af transgenet og ikke af en indirekte endogen PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) aktivering. Derfor giver vores resultater klare beviser for, at funktionsforøgelsen af ​​en vildtype funktionel PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) kan producere flere nyrecyster. Det er vigtigt, at disse SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1) praksis udgør den første musemodel, der er genereret af den eneste overekspression af museortologen af ​​den humane PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen.

SBPkdl-Ac musene viser, at PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)overekspression er en primær patogenetisk mekanisme for renal cystogenese. Det er vigtigt, at de højeste transgenekspressionsniveauer i nyrerne så ud til at korrelere med progressionen og sværhedsgraden af ​​fænotypen. Vi fandt også, at PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) overekspression i udviklingen af ​​SBPKD1 (polycystisk nyresygdom 1)-Ac-fænotype signalerer sandsynligvis aktivering af c-Myc in vivo. Tænkeligt kunne denne aktivering endda være direkte gennem den polycystin-1 C-terminale hale, der undergår proteolytisk spaltning og nuklear translokation (7), da øget nyreekspression af c-Myc i voksne mus blev vist at inducere PKD, ville være meget konsekvent for at understøtte c-Myc som en vigtig downstream effektor af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) signalveje. Dette resultat korrelerede også med vores tidligere fund af øget c-Myc-ekspression i nyrerne af al human ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) analyseret (22). Alt i alt indikerer disse resultater, at c-Mye er en primær mediator af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) cystogenese.

Vores resultater fra PKD1 (polycystisk nyresygdom 1)gain-of-function model, sammen med murin PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) haploinsufficiens og funktionstab, indikerer, at enhver PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) dysregulering kunne føre til cystogenese (2.19.23-26.31.40). Alvorlig PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) ubalance hos mus induceret af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) ablation eller transgen overekspression forårsagede tidlig indtræden og hurtig progression af nyrecyster og påvirkede en høj andel af tubuli. Derimod er en mildere PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) ubalance såsom haploinsufficiens førte til en langsommere progression af PKD med flere fokale cyster. Den tilsyneladende paradoksale udvikling af en lignende fænotype ved hjælp af modsat polycystin-1 dysregulering kunne forklares med det fælles resultat, nemlig en relativ proteinkoncentrationsubalance, der kunne ændre dannelsen eller funktionen af ​​et aktivt polycystin multiproteinkompleks. Tilsammen hævder vores resultater og resultaterne fra andre efterforskere, at mekanismen for cystedannelse i ADPKD (autosomal dominant polycystisk nyresygdom) skyldes sandsynligvis tre patogenetiske mekanismer: funktionsforøgelse, funktionstab og gendoseringseffekter.

Romanen SBPkdlrAc; mus udgør en kraftfuld model for nyrecystogenese, der kan give stor indsigt i patofysiologien af ​​PKD, PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) signaltransduktionsveje og interagerende partnere. Studiet af denne model kan også føre til udvikling af nye terapeutiske strategier til at genoprette normal proteinbalance i PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) multimert kompleks.

Cistanche behandler nyresygdom og forbedrer nyrefunktionen

REFERENCER

1. Blouin, MJ, H. Beachmin, A Wright, ME. De Paepe, M. Surrette, AM. Beau. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos og M. Trudel. 2000. Genetisk korrektion af seglcellesygdom: indsigt ved hjælp af transgene musemodeller Nat. Med.17-182.

2 Boulter, C, S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle og R. Sandford. 2001.Kardiovaskulær, skelet. og nyredefekter hos mus med en målrettet forstyrrelse af PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) gen. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 9812174-12179.

3. Brasier, JL, and EPHenske.1997. Tab afpolycystisk nyresygdom(PKD1) region af kromosom 1φp13 i nyrecystecelle understøtter en funktionstabsmodel for cystepatogenese. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R. Dackowski, LR. Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R ML Hakim, G. ML Landes, KW Klinger, F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino og N. A Doggett. 1995. En analyse af den genomiske sekvens forautosomal dominant polycystisk nyresygdomgenet forudsiger tilstedeværelsen af ​​en leucin-rig gentagelse. Hum Mol, Genet.4-575-58.

5. Chada, K, J. Magram, K. Raphael, G. Radice, E. Lacy og F. Costantini. 1985. Specifik ekspression af et fremmed -globingen i erythroidcellen af ​​transgene mus Nature 337-380.

6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst,GG Germino og M.-C. Gubler.2002. Ekspression af PKDI- og PKD2-transkripter og proteiner i det humane embryo og under normal nyreudvikling. Er. J. Pathol. 160973-983.

7. Chaurvet, V, X Tian, ​​H. Husson, DH Grimm, T. Wang T.Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya, S.Somlo og MJ Caplan.2004 Mekaniske stimuli inducerer spaltning og nuklear translokation af pobeystin-1 C terminus.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson og DJ Kwiatkowski 2000. Molekylær genetisk fremgang i tuberøs sklerose. Hum. Genet10797-114.

9. Konsortium, EPKD1993. Identifikation og karakterisering af tuberøs sklerosegenet på kromosom 16.Cell75:1305-1315.

10. Konsortium, EPKD1994.Thepolycystisk nyresygdom 1genet koder for alt, der kan transskriberes inden for en duplikeret region på kromosom 16-celle 7781-894.

11. Konsortium, L PK D 1995.Polycystisk nyresygdom: den komplette struktur af PKD1 (polycystisk nyresygdom1) gen og dets protein. Ce 81:289-298

12. Couillard, M., R Guilkume, N Tanj, V.DAgati og M. Trudel.2002. c-Myc-induceret apoptose ipolycystisk nyresygdomer uafhængig af FasL/Fas interaktion. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, En model af human seglcelle glomerulopati. Nyre Int. 46:1337-1345.

14. GengL,Y, Segal B.PekseL, N.Den Y. Pei, F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders og J.Zhou. 1996. Identifikation og lokalisering af polyester, PKD1 (polycystisk nyresygdom 1) genprodukt. J. Clin. Undersøg. 98-2674-2682