Terapeutisk effekt og mekanisme af cistanche-phenylethanol-glycosider på cyclophosphamid-induceret spermatogenese hos mus

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Resumé]

Formål:At udforske den terapeutiske effekt afCistanche phenylethanoid glycosiderpå mus med cyclophosphamid-induceret spermatogenese og for foreløbigt at klarlægge dens virkningsmekanisme.Metode:Ethanol ekstraktionsmetode til at ekstrahereCistanche phenylethanoid glycosider. Fyrre BALB/C-mus blev tilfældigt opdelt i en kontrolgruppe, en modelgruppe, en lavdosisCistanche phenylethanoid glycosidgruppe (50 mg·kg-1), og en højdosisgruppe (100 mg·kg-1), med 10 mus i hver gruppe. Bortset fra kontrolgruppen blev mus i de andre grupper injiceret med cyclophosphamid (80 mg·kg-1) hver dag i 5 på hinanden følgende dage for at forberede musemodeller af spermatogeneselidelser. Efter den sidste administration, mus i lavdosis- og højdosisgrupperne afCistanche phenylethanoid glycosiderfik de tilsvarende doser ved sondemad, og musene i kontrolgruppen og modelgruppen fik samme volumen af ​​normalt saltvand ved sondemad en gang om dagen i 30 dage. Fireogtyve timer efter den sidste sondeernæring blev testikelvævet fra mus taget. Et enzymbundet immunosorbent-assay blev brugt til at bestemme niveauet af testosteron i testikelvævshomogenat fra mus. Spermdensiteten, sædmotiliteten og sædabnormalitetsraten for hver gruppe blev sammenlignet. De morfologiske ændringer af testikelvæv blev observeret ved HE-farvning. Resultater: Sammenlignet med kontrolgruppen faldt sæddensiteten og sædmotiliteten i modelgruppen (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche phenylethanoid glycosidervar signifikant øget (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche phenylethanoid glycosidgruppe øget betydeligt, Lagene er adskilte, de spermatogene celler er ordnet pænt, stramt og regelmæssigt, og sædceller kan ses i lumen.Konklusion: Cistanche phenylethanoid glycosiderhar en signifikant terapeutisk effekt på spermatogeneseforstyrrelsen forårsaget af cyclophosphamid hos mus, og dens mekanisme kan være relateret til forbedringen af ​​testosteronniveauer i testikelvæv.

[Søgeord]Cistanche phenylethanoid glycosider; cyclophosphamid; spermatogenese lidelse; mus, BALB/C

Klik for at Cistanche produkter

På grund af accelerationen af ​​social rytme, dårlige levevaner og miljøforurening og andre faktorer er unormal sædkvalitet såsom oligospermi og asthenospermi blevet hovedårsagen til mandlig infertilitet [1]. På nuværende tidspunkt er der færre lægemidler til behandling af oligospermi og asthenospermi, og den terapeutiske effekt er ikke indlysende. Recepter på traditionel kinesisk medicin eller aktive ingredienser har gode virkninger til at forbedre mænds reproduktive funktion [2-6]. Men på grund af det store udvalg af receptpligtige lægemidler er forholdet mellem de farmakologiske virkninger og de effektive ingredienser i lægemidlet ikke klart, hvilket begrænser promoveringen og anvendelsen af ​​sædfremkaldende lægemidler. Forskningen og udviklingen af ​​de effektive ingredienser i kinesisk medicin og undersøgelsen af ​​dens terapeutiske virkninger ved reproduktionsskader har god anvendelsesværdi.Cistanche phenylethanoid glycosiderer en af ​​de vigtigste aktive ingredienser iCistanche deserticola. De er normalt naturlige glycosider indeholdende esterbindinger og oxo-glykosidbindinger med -glukose som kernen. De findes i vid udstrækning i tokimbladede planter [7]. Det har undersøgelser [8] vistCistanchephenylethanoidglykosiderkan beskytte rottesæd mod oxidativ skade in vitro, men der er ingen rapporter om dens spermatogenese. Dette eksperiment studerer den terapeutiske effekt af Cistanche phenylethanoid glycosider på den spermatogene funktion af mus med cyclophosphamid-induceret spermatogenese og giver et eksperimentelt og teoretisk grundlag for anvendelse afCistanche phenylethanoid glycosideri behandlingen af ​​spermatogenese lidelser.

1. Materialer og metoder

1.1. Laboratoriedyr, hovedreagenser og instrumenter

40 SPF-klasse voksne BALB/C mus, 6-8 uger gamle, med en kropsmasse på 20-22g, blev købt fra Animal Experimental Center på Jilin University School of Basic Medicine og dyrecertifikatnummeret : SCXK (Kirgisistan) 2008-005. Musene blev avlet adaptivt i 5 dage før eksperimentet. Foderforhold: 22 grader ~ 25 grader, døgnrytme (12t/12t), gratis drikkevand og mad. Cistanche er et produkt fra Xinjiang Dakang Trading Company. Cyclophosphamid til injektion blev købt fra Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (batchnummer 11061921). Testikulærvævshomogenat testosteronenzym-koblet immunoassay-kit blev købt fra Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (batchnummer) 20120812), andre reagenser er alle indenlandsk fremstillede analytiske kvaliteter. PLUS384 mikropladelæser (MDC i USA), TE2000U inverteret mikroskop (Nikon, Japan) og J-26XP-centrifuge (Nanodrop, USA).

1.2 Fremstilling af Cistanche Phenylethanol Glucoside

10 g cistanche-pulver blev ekstraheret ved tilbagesvaling med 70% ethanol, to gange, 2 timer hver gang, for at opnå phenethylalkoholglycosidkoncentratet. Den koncentrerede opløsning blev kromatograferet på den makroporøse D101-harpikssøjle og elueret med 70% ethanol til opnåelse af Cistanche-phenecosid-alkohol. UV-spektrofotometeret identificerede ekstraktet ved en bølgelængde på 333 nm.

1.3 Udarbejdelse af dyremodel og lægemiddeladministrationsmetode

Efter at 40 BALB/C-hanmus var blevet adaptivt fodret i 5 dage, blev musene tilfældigt opdelt i 4 grupper (10 mus i hver gruppe): kontrolgruppe, modelgruppe, CistancheCistanche phenylethanoid glycosiderlavdosis gruppe, ogCistanche phenylethanoid glycosiderhøjdosis gruppe. Bortset fra kontrolgruppen fik de andre tre grupper af mus en intraperitoneal injektion af cyclophosphamid 80 mg·kg-1 for hver mus i 5 på hinanden følgende dage for at forberede dyremodeller af spermatogeneseforstyrrelser. Efter at modellen var udarbejdet, mus i lav- og højdosisgrupperneCistanchephenylethanoid blev givet henholdsvis 50 og 100 mg·kg-1·d-1. Musene i kontrolgruppen og modelgruppen fik lige store volumener af normalt saltvand. En gang om dagen i 30 dage. Alle mus blev aflivet 24 timer efter den sidste lægemiddeladministration, og der blev taget bilaterale tests. Den højre testikel fikseres med formaldehyd. Epididymis og testis blev taget fra venstre side. Testiklen blev homogeniseret og centrifugeret ved 3,000 min. i 10 min. Supernatanten blev taget og opbevaret i en fryseboks ved -20 grader til test. Den venstre epididymis blev testet for sæddensitet, sædmotilitet og deformitetsrate.

1.4 Bestemmelse af sæddensitet, sædmotilitet og deformitetsrate

Placer et reagensglas indeholdende 10 mL sædnæringsopløsning [9] i et vandbad med konstant temperatur for at forvarme det til 37 grader , tag en ensidig epididymis for at fjerne bindevæv og fedt, skær vævet over og læg det i et reagensglas kl. 37 grader i 10 minutter Efter at sæden er helt fri, tages 1 dråbe på blodcelletællepladen og sædtætheden beregnes efter celletællemetoden. Resultatet udtrykkes som antallet af sædceller pr. milliliter; derudover tages 5μL sædsuspension og den samme mængde eosin-Y fra reagensglasset. Bland godt, anbring det ved stuetemperatur i 10 minutter, tilsæt et dækglas og observer med et lysmikroskop. Døde sædceller farves lyserøde, levende sæd er ikke farvede og cytoplasmaet er gennemsigtigt. Hver prøve tæller 200 sædceller, beregner sædcellernes levedygtighed, resultatet er udtrykt som en procentdel, sædcellernes levedygtighed=et antal levende sædceller / det samlede antal sædceller × 100 procent . Yderligere 5 μL sædsuspension blev fikseret i methanol i 5 minutter, tørret og farvet med 2 procent eosin vandig opløsning i 1 time, skyllet og føntørret. Se efter dele med mindre spermoverlapning under en linse med lav effekt, og brug en linse med høj effekt til at kontrollere sædmorfologien i rækkefølge. Hver mus inspicerede 1,000 komplet sæd. Spermhovederne uden kroge, bananformede, amorfe, fede hoveder og dobbelthoveder blev bedømt som deformiteter. Spermdeformitetsraten blev beregnet, og resultaterne blev udtrykt som en procentdel. Sperm deformitetsrate=et antal deformerede sædceller / totalt antal sædceller × 100 procent.

1.5 Bestemmelse af reproduktive hormoner

Testiklen blev pillet af membranen og anbragt i et hætteglasskål, og det forafkølede homogeniseringsmedium (0.01 mol·L-1 saccharose, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1 mmol·L-1 EDTA-Na2-opløsning, pH 7,4), klip testikelvævet med en oftalmologisk saks, hæld det i et homogeniseringsrør af glas, og centrifuger ved 4, 000×g i 10 minutter ved lav temperatur, og tag supernatanten. Brug enzym-linked immunosorbent assay kit til at måle testosteronniveauet i testikelvævshomogenatet og test 3 parallelle prøver for hver prøve. De eksperimentelle trin og metoder blev afsluttet i overensstemmelse med instruktionerne i sættet.

1.6 Morfologisk observation af testikler

Tag paraffinsnit af musetestis, farvet med HE, og observer fordelingen af ​​spermatogonia og spermatogene celler i testikelvæv under et lysmikroskop.

1.7 Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS17.0 statistisk software. Spermdensitet, sædmotilitetshastighed, sæddeformitetsrate og testikulær testosteronniveau hos mus i hver gruppe blev udtrykt som x±s, og sammenligningen mellem grupperne blev udført ved enkeltfaktoranalyse af varians.

2. resultater

2.1. Spermdensitet, sædmotilitet og sæddeformitetsrate for hver gruppe mus

Sammenlignet med kontrolgruppen faldt modelgruppens sæddensitet og sædlevedygtighed (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche phenoxyethanol glycosidøget (s<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Testosteronniveauer i testikelvæv fra mus i hver gruppe

Testosteronniveauerne i testikelvævshomogenaterne i kontrolgruppen og modelgruppen var (10.26±0.57) og (5.33±0.84) nmol·L-1, henholdsvis. Testosteronniveauet i modelgruppen var signifikant lavere end for kontrolgruppen (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistanchecistanche phenethylglycosid højdosis-gruppen var signifikant højere end lavdosisgruppen (P<>

2.3 Morfologi af musetestis i hver gruppe

Observeret ved lysmikroskop var sædrørene i normalgruppens testikler tæt arrangeret, niveauet og antallet af kønsceller var stort, sædepitelet var ordnet pænt, og sædrørene blev alle set med sæddannelse. I modelgruppen var sædrørene i testiklerne på mus atrofieret og degenereret, sædepitelet var signifikant fortyndet, antallet af epitellag blev reduceret, arrangementet var uordnet, og antallet af sædceller i hulrummet blev reduceret. Sammenlignet med modelgruppen er den lave dosis afCistanche phenethylalkoholglycosid.

I gruppen steg antallet af seminiferøse epitellag af seminiferøse tubuli, anordningen af ​​epitelet var mere regelmæssig, og skaden af ​​seminiferøse tubuli var åbenbart forbedret; strukturen af ​​sædrør i højdosisCistanche phenylethanoid glycosidgruppen forbedredes mere signifikant, og antallet og antallet af seminiferøse epitellag steg betydeligt. Ordnet pænt er der modne sædceller i sædrørene, og strukturen er grundlæggende tilbage til normal. Se figur 1 (indsats 6).

3 Diskussion

Cyclophosphamid er et almindeligt anvendt antitumorlægemiddel og immunsuppressivt middel, som hovedsageligt interfererer med en række intracellulære biologiske funktioner gennem alkylering af DNA. Reproduktionstoksicitet er en af ​​hovedbivirkningerne af cyclophosphamid [3], som let kan føre til sperm-DNA-skader og unormal spermudvikling. Kliniske undersøgelser [10-11] indikerer, at cyclophosphamids reproduktionstoksicitet kan forårsage azoospermi eller oligospermi. , Fører til infertilitet eller forekomsten af ​​genetiske defekter eller misdannelser hos afkom.

Cistanche tubulosaer en flerårig højere parasitisk plante i Leiden-familien. Det er en velkendt kinesisk medicin, der nærer nyrerne og yang, nærer blodet og nærer tarmene. Det er en almindeligt anvendt receptpligtig medicin til den traditionelle behandling af mandlig reproduktiv dysfunktion [12].Phenylethanoid glycosiderer en af ​​de vigtigste aktive komponenter iCistanche[13] og har en bred vifte af farmakologiske virkninger, såsom antioxidation, anti-aging og anti-tumor [14].

I denne undersøgelse blev cyclophosphamid brugt til at fremstille en musemodel for spermatogeneselidelse, og den terapeutiske virkning af Cistanche phenylethanoid glycosider på spermatogeneselidelse forårsaget af cyclophosphamid blev undersøgt. Resultaterne viste, at sammenlignet med den normale gruppe faldt sæddensiteten i modelgruppen, overlevelsesraten faldt, og deformitetsraten steg. Sammenlignet med modelgruppen kan alle dosisgrupperne af Cistanche phenoxyethanolglycosider effektivt øge sæddensiteten, øge sædmotiliteten og reducere sæddeformitetsraten. Ovenstående resultater indikerer, at cistanche-phenoxyethanol-glycosiderne kan fremme spermatogenese og beskytte den beskadigede testis. Resultaterne af testikelmorfologi viste, at efter behandling medCistanche phenylethanoid glycosid, antallet af sædholdige epitel i testiklen hos modelmusene var signifikant forøget, lagene var adskilte, de spermatogene celler var arrangeret pænt, stramt og regelmæssigt, og sædceller kan ses i lumen, hvilket tyder på, atCistanche phenylethanoidkan ændre Shanhe genopretter strukturen og morfologien af ​​seminiferøse epitel efter reproduktionsskade.

Testosteron regulerer differentieringen af ​​mandlige kønsceller og er en nødvendig betingelse for normal udvikling af testiklerne og normal forekomst af sædceller. Nogle undersøgelser [15] rapporterede, at den selektive knockout af androgenreceptorer i Sertoli-celler i testiklen forårsagede sædudviklingsforstyrrelser og mandlig sterilitet. I denne undersøgelse blev cyclophosphamid brugt til at producere spermatogen.

Efter forhindringsskademodellen var testosteronniveauet i testikelvævet hos musene signifikant lavere end i normalgruppen. Efter virkningen af ​​Cistanche phenylethanoid glycosider steg testosteronniveauerne i hver dosisgruppe, og testosteronniveauet i højdosisgruppen var signifikant højere end i lavdosisgruppen. Det foreslås, at cistanche-phenoxyethanol-glycosiderne kan fremme spermatogenese ved at øge niveauet af testosteron i testikelvævet til behandling af spermatogen dysfunktion, men mekanismen for dens virkning på testosteron kræver yderligere forskning og diskussion.

Testosteron regulerer differentieringen af ​​mandlige kønsceller og er en nødvendig betingelse for normal udvikling af testiklerne og normal forekomst af sædceller. Nogle undersøgelser [15] rapporterede, at den selektive knockout af androgenreceptorer i Sertoli-celler i testiklen forårsagede sædudviklingsforstyrrelser og mandlig sterilitet. I denne undersøgelse blev cyclophosphamid brugt til at producere spermatogen.

Efter forhindringsskademodellen var testosteronniveauet i testikelvævet hos musene signifikant lavere end i normalgruppen. Efter handlingen afCistanche phenylethanoid glycosider, steg testosteronniveauerne i hver dosisgruppe, og testosteronniveauet i højdosisgruppen var signifikant højere end i lavdosisgruppen. Det foreslås, at cistanche-phenoxyethanol-glycosiderne kan fremme spermatogenese ved at øge niveauet af testosteron i testikelvævet til behandling af spermatogen dysfunktion, men mekanismen for dens virkning på testosteron kræver yderligere forskning og diskussion.

[referencer]

[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. Nye fremskridt inden for mandlig infertilitetsforskning [J]. Chinese Journal of Andrology, 2006, 12(9): 771-774.

[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming, et al. Virkning af Guilingji-kapsel på modelrotter med oligospermi. Spermproduktionens rolle og indvirkningen på kønshormoner [J]. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2011, 28(6): 621-623.

[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, et al. Epimedium totale flavonoider forårsager minimering af cyclophosphamid Forskning i den beskyttende virkning af rotte-født spermbarriere [J]. Kinesisk patentmedicin, 2010, 32 (12): 2052-2055.

[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing, et al. Shengjing-granulat på cyclophosphamid-induceret spermforringelse Hindrer den terapeutiske effekt af mus [J]. Journal of Zhengzhou University: Medical Science Edition, 2008, 43(2): 267-270.

[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing, et al. Virkning af Shengjing granulat af kinesisk medicin på spermatogenese svækkede mus Eksperimentel forskning i terapeutiske virkninger [J]. Chinese Journal of Andrology, 2008, 14 (11): 1046-1049.

[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun, et al. Effekt af Heshhouwu-afkog på testisvæv hos aldrende rotter Indflydelsen af ​​celle Rb/p53-signaltransduktionsvej [J]. Anatomy Journal, 2010, 41(3): 435-439.

[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Effekt af refluksekstraktion af Cistanche Phenylethanol Glucoside med ethanolfaktorforskning [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2009 (1): 250-251.

[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei, et al. Virkninger af Cistanche Phenylethanol Glucoside på rottesæd Forskning om den beskyttende virkning af ekstern oxidativ skade [J]. Lishizhen Traditionel Kinesisk Medicin og Materia Medica, 2010, 21(9): 2205-2207.

[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong osv. Anti-sæd-antistoffer på sperm mitokondriefunktion Indvirkningen af ​​[J]. Journal of Shantou University Medical College, 2008, 21(1): 4-6.

[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD, et al. Høj risiko for info Highdoseccyclophaphamiddeforsarcomaduringchildhood [J].Cancer, 2001, 91(3): 613-621.

[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, et al. Testikelfunktion og frugtbar konservering i mallecancerpartier [J]. BestPect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.

[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. Cistanches evne til at modstå træningstræthed hos rotter og påvirkningen af ​​hjernens frie radikaler [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9592-9595.

[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian, et al. Phenylethanolglycosider i dyrket Cistanche cistanche Ekstraktions- og oprensningsforskning [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2006, 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. Fremskridt inden for farmakologisk forskning af phenoxyethanolglycosider Udstilling [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3): 440-441.

[15] ChangC, ChenYT, YehSD, et al. Infomedia foråret TheandrogenreceptorinSertoliceller [J]. ProcNatlAcadSci USA, 2004, 101 (18): 6876-6881.