De hudblegende virkninger af ektoin via undertrykkelse af -MSH-stimuleret melanogenese og aktivering af antioxidant Nrf2-baner i UVA-bestrålede keratinocytter

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1, Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 og Hsin-Ling Yang 8,*

Abstrakt:Ultraviolet A (UVA)-bestråling-induceret reaktive oxygenarter (ROS) produktion medierer overdrevenmelanogenesei hudceller, der fører til pigmentering. Vi demonstrerede de depigmenterende og anti-melanogene virkninger af Ectoine, en naturlig bakteriel osmolyt, i UVA-bestrålede humane (HaCaT) keratinocytter, og de underliggende molekylære mekanismer blev belyst. HaCaT-celler blev forbehandlet med lave koncentrationer af ektoin (0,5-1,5 µM) og analyseret for forskellige depigmenterende og anti-melanogene parametre. Denne forbehandling nedregulerede signifikant ROS-generering, -melanocytstimulerende hormon (-MSH) produktion og proopiomelanocortin (POMC) ekspression i UVA-bestrålede HaCaT-celler. Også,antioxidanthæm-oxygenase-1 (HO-1),NAD(P)H-dehydrogenase [quinon 1] (NQO-1), og -glutamat-cysteinligase katalytisk underenhed(-GCLC) proteinekspressioner var medieret via nuklear translokation af nuklear faktor erythroid2-relateret faktor 2 (Nrf2), hvis knockdown faktisk svækkede denne effekt, hvilket indikerer vigtigheden af ​​Nrf2-vejen. Ectoin medierede aktiveringen af ​​Nrf2 via p38-, proteinkinase B (også kendt som AKT), proteinkinase C (PKC) og kaseinkinase II proteinkinase (CKII)-vejene. Det konditionerede medium opnået fra de ektoin-forbehandlede og UVA-bestrålede HaCaT-celler nedreguleredetyrosinase, tyrosinase-relateret protein-1 og -2 (TRP-1/-2), cyklisk AMP (c-AMP) proteinkinase, c-AMP-respons element-bindende protein (CREB ), og mikroftalmi-associeret transkriptionsfaktor (MITF)-udtryk, der fører til melanom B16F10-celler, der har hæmmet melaninsyntese. Interessant nok kunne denne anti-melanogene effekt i -MSH-stimulerede B16F10-celler kun observeres ved 50-400 µM koncentrationer af ektoin, hvilket angiver den nøglerolle, som Ectoin (0,5-1 µM)-behandlet keratinocytesin-hud spiller.blegningeffekter. Vi konkluderede, at Ectoine kunne bruges som et effektivt aktuelt naturligt kosmetisk middel med depigmenterende og anti-melanogen effekt.

Nøgleord:ektoin; keratinocytter;melanogenese; tyrosinase; -MSH; Nrf2

Cistanche har en antioxidationseffekt.

1. Introduktion

Udsættelse af menneskelig hud for UVA-stråling udløser ROS-generering og overproducerer også melaninin i hudcellerne. Den ukontrollerede produktion af ROS kan også føre til melanomtilstande. De fleste hudblegemidler er rettet mod og forsøger at minimeremelanogeneseproces gennem inhibering af -MSH ogtyrosinaseproduktioner [1]. De fleste hudtonecremer er sammensat af hydroquinon [2] eller hydrocortison [3], som er kendt for at mindske dannelsen af ​​melanin, men er også forbundet med alvorlige bivirkninger. For eksempel acne, skællende og kløende hud, blå og sorte misfarvninger af huden, okronose, brændende og stikkende hudirritation og endda betændelse.blegningmidler fra naturlige kilder, for eksempel Kojic syre (et svampederivat opnået fra Penicillium og Aspergillus arter) er også rapporteret at forårsage "kontakteksem" hos personer med følsom hud. Hos disse individer kan mere end 1 procent af kojinsyre forårsage alvorlige overfølsomme bivirkninger [4,5]. Derfor kun få naturligt afledte hudblegningprodukter (oleosin, lakridsekstrakt, ascorbinsyre, sojaprotein, N-acetylglucosamin osv.) bliver i øjeblikket brugt i den kosmetiske industri [6]. Imidlertid har de hudplejeprodukter, der hovedsageligt er rettet mod de depigmenterende egenskaber, til tider ikke fokuseret på at modvirke de skadelige virkninger af den UVA-bestrålingsinducerede ROS-produktionsmedierede overskudmelanogenesei hudceller.

Ektoin er en "naturlig ekstremolyt" fremstillet af flere arter af mikroorganismer under stressende forhold [7,8]. Denne forbindelse blev først isoleret fra Ectothiorhodospira-arterne af bakterier, der lever i den egyptiske ørken. Kaskaden af ​​ect operonger (ectA, ectB, ectC eller ectD) er involveret i produktionen af ​​denne forbindelse. Ektoin er kemisk betegnet som 1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidincarboxylsyre [9]. Som fugtbinder hjælper Ectoine med omstrukturering af hudcellemembranen [10], beskyttelse mod UV-skader og forurening [11,12], fugter huden [13], forsinker for tidlig aldring af huden [14] osv. Derudover til hudbeskyttelsesorganerne har ektoin vist sig at være nyttig i behandlingen af ​​atopisk dermatitis [15], Alzheimers [16], såvel som hæmning af HIV-replikation [17], radio- og kemoterapi [18] og levercirrhose [ 19]. Ektoin spekuleres i at udvise sine depigmenterende og hudblegende egenskaber uden at forårsage uønskede bivirkninger [20]. I modsætning hertil er de molekylære mekanismer fremkaldt af Ectoine ikke kendte. Derfor var formålet med denne undersøgelse at afgrænse de ektoinmedierede depigmenterende og anti-melanogene mekanismer fremkaldt i UVA-bestrålede humane (HaCaT) keratinocytter som det cellulære modelsystem. Effekten af ​​ektoin-induceret sekretion af hudbeskyttende midler fra HaCaT-cellerne til dyrkningsmediet (konditioneret medium) blev også testet under anvendelse af en typisk melanomcelle (B16F10) linje.

2. Materialer og metoder

2.1. Reagenser og antistoffer

Ectoine (produktnr.: 81619, renhed større end eller lig med 95 procent) blev købt fra Sigma-Aldrich (Taufkichen, Tyskland). Føtalt bovint serum (FBS), penicillin/streptomycin, Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) og l-glutamin blev købt fra Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA, USA). l-DOPA, melanin, 3-4,5-dimethyl-2-yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) og -MSH blev indkøbt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). N-acetylcystein (NAC) og20,70-dichlorfluorescein-diacetat (DCFH2-DA) blev fremskaffet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle farmakologiske inhibitorer, der kræves til JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X) og CKII blev opnået fra Calbiochem (La Jolla, CA, USA) PI3K/AKT-hæmmer (LY294002) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle antistoffer mod POMC, CREB, -actin,tyrosinase, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, Kelch-lignende ECH-associeret protein-1 (Keap-1), ogTRP-1, TRP-2 blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Tyskland). Antistoffer mod -GCLC og HO-1 blev fremskaffet fra Gene Tex Inc. (San Antonio, TX, USA). Vi opnåede antistoffer mod c-AMP-proteinkinase og CKII fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Histoner, MITF, p-p38, p38, p-AKT og AKT blev opnået fra Cell Signal Technology (Beverly, MA, USA). Forstærket kemiluminescens (ECL) detektionsreagenser blev opnået fra Millipore, (Billerica, MA, USA). Alle andre reagenser (i HPLC-kvalitet) blev enten købt fra Sigma-Aldrich eller Merck & Co., Inc. (Darmstadt, Tyskland).

2.2. Cellekultur

Vi opnåede udødeliggjort human hud-keratinocyt HaCaT og murine melanom B16F10-celler fra både Cell Line Services (CLS, Eppelheim, Tyskland) og American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA). Cellerne blev dyrket i DMEM suppleret med 10 procent varmeaktiveret FBS, 1 procent streptomycin/penicillin og 2 mM L-glutamin i en fugtig inkubator suppleret med 5 procent CO2 ved 37 ◦C.

2.3. Cellebehandlinger og UVA-bestråling

Før UVA-bestråling blev cellerne forbehandlet med ektoin (0,5-1,5 µM i 24 timer) eller vehikel (PBS). Efter inkubation blev PBS-vaskede celler udsat for 3 J/cm2 UVA-stråling (i 27 minutter, λmax, 365 nm, ingen påviselige emissioner under 320 nm) ved hjælp af UV CROSS-LINKER CL -508 (UVItec, Cambridge, Storbritannien) [21].

2.4. Intracellulær ROS-assay

HaCaT-celler blev podet ved en tæthed på 1,5 × 105 i et 8-brønd Lab Teck-kammer indeholdende DMEM suppleret med 10 procent FBS og blev dyrket til 80 procent konfluens. Disse celler blev først behandlet med 1,5 µM ektoin, efterfulgt af eksponering for 3 J/cm2 UVA-bestråling i den foreskrevne tid. Cellerne blev vasket med PBS, og DCFH2-DA-metoden blev brugt til at bestemme den intracellulære ROS-produktion ved at bruge Olympus-softwareløsningssoftwaren til hver tilstand [21].

2.5. Melanin kvantificering

I en 6-brøndsplade blev murine melanom B16F10-celler podet med en tæthed på 2,5 × 105 celler/brønd. De blev forbehandlet med 100, 200 og 400 µM Ectoine i 2 timer i fravær eller tilstedeværelse af -MSH (1 µM). Den anvendte protokol til kvantificering af melanin fulgte en tidligere beskrevet metode [21]. Vi målte melaninindholdet med ELISA mikropladelæseren med en absorbansbølgelængde på 470 nm.

cistanche hæmmer melanin.

2.7. Western Blot

HaCaT (1 × 106 celler/10 cm skål) eller B16F10 (1 × 106 celler/10 cm skål) celler blev forbehandlet med varierende koncentrationer af ektoin (0,5, 1 og 1,5 µM) eller -MSH (1 µM) efterfulgt af bestråling i fravær eller tilstedeværelse af UVA i den foreskrevne tid. PBS-vaskede celler blev høstet, proteinindholdet (nuklear og cytosolisk) blev isoleret efter behandling. Derefter blev cellerne udsat for Western blot-metoden, der tidligere blev brugt til bestemmelse af ekspressioner af forskellige nukleare og cytosoliske proteiner [21].

2.8. RNA-ekstraktion og RT-PCR

Ektoin-forbehandlede (1,5 µM, 24 timer) HaCaT-celler blev udsat for TRIzol-reagenset (Invitrogen, Carlsbad) til isolering af totalt RNA fra disse celler. 1 µg total RNA og reagenserne leveret af SuperScript-III One-Step RT-PCR platin Taq-kittet (Invitrogen, Carlsbad) blev brugt i PCR-eksperimentet med Bio-Rad iCycler PCR-instrumentet (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De anvendte frem- og omvendte primere for Nrf2 var: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. De anvendte frem- og omvendte primere for GAPDH var: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev PCR-produktet analyseret under anvendelse af 1 procent agarosegel. Derefter blev det visualiseret med ethidiumbromid-farvning. Som intern kontrol brugte vi GAPDH [22].

2.9. Immunfluorescensassay

HaCaT-celler blev dyrket ved en tæthed på 1 × 104 celler/brønd i DMEM-supplement med 10 procent FBS i et 8-brønd Lab Tek-kammer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Vi forbehandlede cellerne med 1,5 µM ektoin i den angivne tid efterfulgt af bestråling i fravær eller tilstedeværelse af UVA. Cellerne blev udsat for et immunfluorescensassay, som anvender en tidligere beskrevet metode [21].

2.10. Statistisk analyse

Vi brugte middelværdien ± standardafvigelse (gennemsnit ± SD) for alle resultaterne anvendt i denne undersøgelse. Alle data blev analyseret med en variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Dunnetts test for parvise sammenligninger og præsenteret som middel ± SD af tre eller mere uafhængige eksperimenter. Statistisk signifikans blev sat til * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" sammenlignet="" med="" ubehandlede="" kontrolceller,="" og="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p="">< 0,01;="" ###="" p="">< 0,001="" sammenlignet="" med="" de="" uva-eksponerede="" hacat-celler="" eller="" -msh-behandlede="">

3. Resultater

3.1. Ektoin hæmmet UVA-induceret ROS-generering i HaCaT-celler

Først testede vi for de cytotoksiske virkninger af ektoin (figur 1A) på UVA-bestrålede HaCaT-celler. Vores MTT-data viste, at sammenlignet med de ubehandlede kontrolceller var ektoin forbehandlet (0.5-1,5 µM) og 3 J/cm2 UVA-eksponerede HaCaT-celler var ude af stand til at vise et signifikant fald i celleviabilitet (figur 1B). Ydermere svækkede ektoin-forbehandling den UVA (3 J/cm2)-inducerede celledød på en dosisafhængig måde (figur 1B). Ud over vores fluorescensdata, som indikerede, at sammenlignet med kontrolcellerne opregulerede 3 J/cm2 UVA-bestråling og ektoin alene (1,5 µM) ROS-niveauer signifikant med 5- og 2-fold, henholdsvis. I tilfælde af ektoinforbehandling blev ROS-niveauerne imidlertid betydeligt nedreguleret, og vi kan udlede, at ektoin har enantioxidanteffekt mod UVA-bestråling. Dette inducerer også basale niveauer af ROS i HaCaT-celler (figur 1C, D).

3.2. Ektoin-undertrykte POMC- og -MSH-ekspressioner i UVA-bestrålede HaCaT-celler

UVA-eksponerede keratinocytter blev stimuleret for deres ROS-p53-medierede POMC og også et lille peptidhormon -MSH, der er afledt af POMC [23]. Derfor bestemte vi ændringerne i ekspressionsmønstrene for -MSH, POMC og andre associerede proteiner i ektoin-forbehandlede HaCaT-celler og udsatte dem derefter for UVA (3 J/cm2). Western blot-data indikerede, at UVA-induceret opregulering af -MSH- og POMC-ekspressioner blev nedreguleret af ektoin-forbehandling; hvorimod Ectoine-behandling uden UVA-bestråling fuldstændigt har hæmmet -MSH- og POMC-ekspressionerne af ikke-bestrålede HaCaT-celler (figur 2A). Senere testede vi effekten af ​​'konditioneret medium' (10 ml/100 mm plade), opnået fra de ektoin-forbehandlede og UVA-bestrålede HaCaT-celler, påmelanogeneseaf B16F10 melanomceller. Figur 2B viser dette konditionerede medium nedregulerettyrosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkinase, p-CREB, CREB og MITF niveauer i B16F10 celler.

3.3. Ektoin nedreguleret melanin- og tyrosinaseekspression i -MSH-stimulerede B16F10-celler

B16F10 melanomceller blev først udsat for de højere koncentrationer af ektoin, og virkningen af ​​cytotoksicitet blev bestemt ved anvendelse af MTT-assay. Figur 3A viser, at Ectoine ikke havde nogen signifikant indflydelse på levedygtigheden af ​​B16F10-celler ved højere koncentrationer (100-400 μM i 72 timer). Cellelevedygtighed blev imidlertid ikke påvirket efter 24 og 48 timers ektoinbehandling (data ikke vist). Derfor blev disse koncentrationer brugt til at bestemme effekten af ​​ektoin på -MSH-stimuleretmelanogenesei B16F10-celler. Melaninkvantificeringsdata viste, at sammenlignet med kontrolcellerne opregulerede behandling med -MSH (1 μM) alene melaninniveauerne signifikant med mere end 25 procent. Sammenlignet med behandling med -MSH alene nedregulerede celler udsat for stigende koncentrationer af ektoin (100-400 μM efter 72 timer) dosisafhængigt og signifikant procentdelen af ​​melaninindholdet med maksimal nedregulering på kun 85 procent (eller -15 procent end ubehandlet) kontrol) blev observeret ved 400 μM ektoin-forbehandling (figur 3B). Desuden viste vores Western blot-data også, at -MSH stimuleredetyrosinase(24 timer) og p-CREB (2 timer) udtryk blev signifikant nedreguleret med stigende koncentrationer af ektoin-forbehandlinger i disse melanomceller (figur 3C).

3.4. Ektoin opregulerede ekspressionen af ​​HO-1-, NQO-1- og -GCLC-proteiner i HaCaT-celler

For at bestemme effekten af ​​tid på ektoin-medieret nuklear translokation af Nrf2 og den efterfølgende nedstrøms ekspression af HO-1-, NQO-1- og -GCLC-proteiner, blev HaCaT-celler udsat for 1,5 µM ektoin, og de cellulære proteiner blev høstet 0.5, 1, 2, 4, 8 eller 12 timer efter ektoinbehandlingen. Western blot-data indikerede, at bortset fra -GCLC-proteinet, forårsagede 1,5 µM Ectoine den maksimale ekspression af HO-1-, Nrf2- og NQO-1-proteiner på 4 timers tidspunkt. -GCLC blev vist på et tidspunkt på 8 timer (figur 5A). Data opnået fra tidskurven fører os til at teste effekten af ​​ektoinkoncentration på ekspressionen afantioxidantproteiner på et tidspunkt på 4 timer. Figur 5B viser, at alle tre antioxidantproteiner udviste maksimal ekspression ved 1,5 µM Ectoin-koncentration. Senere blev virkningerne af Ectoine-forbehandling testet på ekspressionen af ​​Nrf2 og Keap-1-forhold i de UVA-bestrålede HaCaT-celler. Western dataanalyse indikerede, at forbehandling med 1,5 µM Ectoine udviste en stigning i forholdet mellem Nrf2/Keap-1 i UVA-bestrålede HaCaT-celler (figur 5C). Vi så også konsistente data med den øgede ekspression af NQO -1-, HO-1- og -GCLC-proteiner i ektoin-forbehandlede HaCaT-celler, der blev bestrålet med 3 J/cm2 UVA (figur 5D). Disse data konkluderer, at ektoin-forbehandling spiller en beskyttende rolle i UVA-bestrålede HaCaT-celler.

3.5. Forskellige signalveje var involveret i aktiveringen af ​​Nrf2 i ektoinbehandlede HaCaT-celler

Vi bestemte signalvejene involveret i den ektoin-medierede nukleare translokation af Nrf2. HaCaT-celler blev forbehandlet med farmakologiske inhibitorer af PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS og CKII signalveje efterfulgt af 1,5 μM ektoin. Western blot-data for nuklear Nrf2 viste, at p38 MAPK-, PI3K/AKT-, PKC- og CKII-veje var involveret i denne mekanisme (figur 6A). Ud fra den opnåede information bestemte vi også effekten af ​​ektoin-forbehandling på den rolle, som disse veje spillede i ekspressionen af ​​antioxidantproteiner. Figur 6B viser, at farmakologisk hæmning af MAPK-, p38-, PI3K/AKT-, CKII- og PKC-veje nedregulerede ekspressionen af ​​NQO-1, HO-1 og -GCLCantioxidantproteiner i HaCaT-celler. Desuden indikerer den tid, det tager for phosphoryleringen af ​​AKT, p38 og ekspressionen af ​​PKC og CKII, mens den er udsat for Ectoine, at bortset fra p-AKT, phosphoryleringen af ​​p38 og ekspressionerne af PKC og CKII fandt sted på det senere tidspunkt. kun tidspunkter (efter 30 min) (figur 6C). I tilfælde af AKT blev phosphorylering observeret fra tidspunktet på 15 minutter, der har nået en top ved 30 minutter (figur 6C). I tilfælde af AKT blev phosphorylering observeret fra tidspunktet på 15 minutter, der har nået et højdepunkt ved 30 minutter (figur 6C). Disse kumulative resultater antydede, at p38-, AKT-, PKC- og CKII-signalvejene aktiverede antioxidanter Ectoine-medieret nuklear translokation af Nrf2 fører til ekspression af antioxidantproteiner.

3.6. Ektoin-medieret anti-melanogen effekt blev undertrykt på grund af knockdown af Nrf2

Nrf2's rolle i ektoin-medieret anti-melanogeneseblev bestemt ved at dæmpe Nrf2 i HaCaT-celler. Data fra Western blot indikerede, at Nrf2 knockdown-celler udsat for 1,5 μM ektoin viste minimum ekspression af NQO-1, HO-1 og -GCLCantioxidantproteiner (figur 7A). Senere testede vi effekten af ​​Nrf2 knockdown på ekspressionen af ​​-MSH-niveauer i UVA-bestrålede (3 J/cm2) HaCaT-celler. Western blot-resultater indikerede, at for at kontrollere de siRNA-transficerede celler var UVA-bestråling signifikant i opreguleringen af ​​ekspressionen af ​​-MSH-niveauer i celler, der ikke var eksponeret for ektoin (figur 7B). Imidlertid har 1,5 μM Ectoine undertrykt denne effekt. For det andet tilfælde viste celler transficeret med siNrf2 et fald i ekspressionen af ​​-MSH-niveauer i både ubehandlede og behandlede celler (figur 7B). I lighed med -MSH-data indikerede vores fluorescensdata også, at UVA-bestråling signifikant opregulerede ROS-produktionen i ektoin-ubehandlede kontrol-siRNA-celler (figur 7C, D). Denne effekt blev imidlertid signifikant undertrykt, når cellerne blev udsat for 1,5 µM ektoin. På den anden side viste Nrf2-transficerede og UVA-bestrålede HaCaT-celler en ca. 8-fold stigning i ROS-niveauer sammenlignet med de Nrf2-transficerede celler, der ikke blev bestrålet med UVA, men udsat for ektoinbehandling (figur 7C, D). Alle disse data angiver den ektoinmedierede beskyttende rolle, som Nrf2 spiller i minimeringen af ​​melaninproduktion i UVA-bestrålede HaCaT-celler.Antioxidanter 2020, 9, x TIL PEER-REVIEW 11 af 15 bestrålet med UVA, men udsat for ektoinbehandling (Figur 7C) . Alle disse data angiver den Ectoine-medierede beskyttende rolle, som Nrf2 spiller i minimeringen af ​​melaninproduktion i UVA-bestrålede HaCaT-celler.

cistanche fordel: blegende hud

4. Diskussion

Forskellige hud-blegningmidler er i brug i den kosmetiske industri. Mange af disse midler er af kemisk oprindelse og lider af begrænsningerne ved at forårsage forskellige bivirkninger, herunder cancer [24-26]. Derfor repræsenterer identifikation af sikre og naturlige hudblegemidler tidens behov. Ektoin (figur 1A) har været kendt for at blive brugt som en aktiv ingrediens i ansigtscremer og andre kosmetiske midler. Dette virker som et fugtgivende middel til huden og anses også for at forsinke for tidlig aldring af huden [27]. Næsten alle kendte hudblegemidler er rettet mod nedregulering aftyrosinaseenzymaktivitet i UV-bestrålede celler, der nedsættermelanogenesei hudceller. Yao et al. demonstreredeblegningegenskaber af biosyntetiseret ektoin og foreslog, at det er et aputativt blegemiddel. I deres undersøgelse testede de den høje koncentration (500 µM) af Ectoine for dets blegende effekt på musemelanom (B16F0) og humant melanom (A2058) cellelinjer og konkluderede, at Ectoine er en sikker og potentielt middel til kosmetisk og klinisk anvendelse [20]. Men i denne undersøgelse testede vi yderligere de gavnlige virkninger af lave koncentrationer af ektoin (0,5-1,5 µM) på UVA-bestrålede HaCaT-celler, og de underliggende molekylære mekanismer blev dechiffreret. I vores undersøgelse blev det vist, at Ectoine gennem Nrf2/ARE-vejen ikke kun har induceret ekspressionen af ​​antioxidantgenekspression, men også nedreguleret -MSH-niveauerne i UVA-bestrålede HaCaT-celler via undertrykkelsen af ​​POMC. Et fald i -MSH-niveauerne var korreleret med nedreguleringen af ​​tyrosinaseenzymaktivitet, hvilket førte til faldet i melaninproduktion. Fra vores viden er dette først den rapport, der blev bevist af mekanismen fremkaldt af Ectoine i UVA-bestrålede HaCaT-celler. Denne undersøgelse afgrænsede de molekylære mekanismer udstillet af Ectoine i HaCaT-celler som det cellulære modelsystem.

Vi bestemte først de subletale koncentrationer af ektoin såvel som effekten af ​​UVA-stråling på levedygtigheden af ​​HaCaT-celler. Vores MTT-data indikerede, at lave koncentrationer af ektoin (0,5-1,5 µM) ikke havde nogen signifikant effekt på levedygtigheden af ​​HaCaT-celler (figur 1B). Ektoin-forbehandling øgede levedygtigheden af ​​3 J/cm2 UVA-bestrålede HaCaT-celler (figur 1B). Baseret på disse observationer fortsatte vi yderligere eksperimenter med 1,5 µM Ectoine-forbehandling og UVA-bestråling ved 3 J/cm2-doseringer.

UVA-bestråling-induceret ROS-produktion i hudkeratinocytter er et velkendt faktum [28]. Derfor testede vi også for eventuelle gavnlige effekter fra ektoin-forbehandling i den UVA-strålingsinducerede ROS-produktion i HaCaT-celler. Vores DCF-fluorescensintensitetsdata indikerede, at forbehandling med 1,5 µM Ectoine signifikant nedregulerede de UVA-strålingsinducerede ROS-produktionsinkeratinocytter. Det kunne også observeres, at 1,5 µM Ectoine kunne forårsage en stigning i basalniveauet i ROS-niveauerne i HaCaT-celler, der viste sig at være statistisk signifikant (figur 1D, E).

Rousseau et al. rapporteret, at POMC udskilles af humane epidermale keratinocytter og melanocytter og er stimuleretmelanogenese[29]. Ved at holde dette for øje testede vi også effekten af ​​UVA-bestråling og ektoin-forbehandlinger på de melanogenese-associerede proteiner i HaCaT-celler. Vores Western blot-data indikerede, at den dosisafhængige nedregulering af ekspressionen af ​​-MSH- og POMC-proteiner i UVA-bestrålede HaCaT-celler var forårsaget af forbehandlingen med Ectoine. Omvendt har Ectoine-forbehandlingen en differentiel effekt på ekspressionsmønsteret afmelanogenese-associerede proteiner. Især næsten alle testede proteiner (Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP-proteinkinase, CREB og MITF) viste nedsatte udtryk med stigende koncentrationer af ektoinpræ-behandling i UVA-bestrålede HaCaT-celler (figur 2A, B). Disse data indikerer det faktum, at Ectoine besidder anti-melanogene egenskaber i UVA-bestrålede HaCaT-celler.

Den anti-melanogene virkning af Ectoine blev yderligere testet i B16F10-celler, en velkendt melanomcellelinje, der anvendes imelanogeneseundersøgelser [30]. En af de bemærkelsesværdige observationer i vores undersøgelse var, at i modsætning til HaCaT-cellerne var høje koncentrationer af Ectoine (100-400 µM) nødvendige for at undertrykke melaninsyntesen i -MSH-stimulerede B16F10-celler (Figur 3B). Vores Western blotdata indikerede, at Ectoine dosisafhængigt nedregulerede ekspressionen aftyrosinaseog p-CREB-proteiner i -MSH-stimulerede B16F10-celler, hvilket fører til den førnævnte effekt (figur 3C). Derfor testede vi også, om disse høje koncentrationer af ektoin kunne påvirke levedygtigheden af ​​B16F10-celler. Vores MTT-resultater indikerede, at høje koncentrationer af ektoin (100-400 µM) ikke havde nogen effekt på levedygtigheden af ​​B16F10-celler (figur 3A). Disse resultater indikerer, at keratinocytter spiller en nøglerolle i ektoin-medieret anti-melanogeneseog depigmenterende effekter.

Rollen af ​​transkriptionsfaktor Nrf2 i hudcellers metabolisme var veldokumenteret [31]. Derfor testede vi yderligere mekanismerne af Nrf2/Keap-1-vejen i ektoinmedierede effekter i keratinocytter. Figur 4A viser, at ektoin dosisafhængigt og signifikant øgede Nrf2/Keap-1-forholdet med en maksimal effekt blev observeret ved 1,5 µM ektoinkoncentration. Det blev også observeret, at 1,5 µM ektoin favoriserede den nukleære translokation af Nrf2-protein med den maksimale ekspression af Nrf2 fra den nukleare proteinfraktion observeret på 2-timers tidspunktet (figur 4B). Data opnået fra immunfluorescensfarvning af HaCaT-celler har også understøttet denne effekt. (Figur 4D).

I humane melanocytter og keratinocytter har Marrot et al. og andre har forklaret vigtigheden af ​​den defensive Nrf2-vej i fotooxidative stressresponser [32]. Vi undersøgte også effekten af ​​ektoinmedieret antioxidantproteinekspression i HaCaT-celler. Vores tidskurvedata indikerede, at ektoinmedieret ekspression af alle tre antioxidantproteiner (HO-1, NQO-1, -GCLC) og Nrf2 viste sig at udtrykke sig på en bifasisk måde med den stigende tid ({{ 8}}.5-12 timer) med en observerbar effekt blev noteret på 4 timers tidspunkt (figur 5A). Herfra en koncentrationskurve, der måler effekten af ​​Ectoineconcentration påantioxidantproteinekspression blev også bestemt på et 4 timers tidspunkt. Figur 5B viser, at i sammenligning med de ubehandlede celler har ektoinbehandling dosisafhængigt øget ekspressionen af ​​HO-1, NQO-1, -GCLC-proteiner. Vi målte også, hvordan ektoinkoncentration udviste beskyttende virkninger i HaCaT-celler, der blev udsat for UVA-stråling. Western blot-data viste, at Ectoine dosisafhængigt øgede ekspressionen af ​​antioxidantproteiner med en dramatisk opregulering i Nrf2/Keap-1-forholdet (figur 5C, D). Disse resultater indikerede, at ektoinforbehandling (1,5 µM, 4 timer) har den potentielle effekt at inducere antioxidantproteinekspression i HaCaT-celler, der kunne modvirke de skadelige virkninger af UVA-eksponering.

antioxidant cistanche

5. Konklusioner

Ud fra ovenstående data konkluderede vi, at lave koncentrationer af ektoin (0,5-1,5 µM) kunne nedregulere -MSH- og melaninproduktion via suppression af POMC ogtyrosinasepathway i UVA-bestrålede HaCaT-celler, hvilket indikerer dets anti-melanogeneseeffektivitet. Derudover var Ectoine også involveret i undertrykkelsen af ​​intracellulær ROS-produktion i HaCaT-celler. I modsætning til HaCaT-celler var høje koncentrationer af ektoin (50-400 µM) i stand til at vise en lignende effekt i B16F10 melanomceller, der har betydet det faktum, at keratinocytter kunne spille en nøglerolle i den ektoinmedierede anti-melanogeneseog hud-blegningvirkninger i hudceller. Det vigtigste er, at Ectoine medierede gavnlige virkninger via aktiveringen af ​​Nrf2-vejen, som inducerer ekspressionen afantioxidantproteinerne HO-1, NQO-1 og -GCLC. AKT blev vist at være den første signalvej, der initierer aktiveringen af ​​Nrf2 efterfulgt af de andre veje (p38, PKC og CKII). Endelig gav dæmpning af Nrf2 direkte bevis for, at Nrf2 spiller en nøglerolle i reguleringen af ​​intracellulær ROS såvel som -MSH-produktionen. Vi konkluderede, at den vigtigste blegningsmekanisme for Ectoine burde begrundes med hæmningen af ​​ROS-p53/POMC{10}}MSH-vejen i UVA-bestrålede HaCaT-celler. Derfor kunne Ectoine eller dets derivater være en aktiv ingrediens i fugtighedscreme og lotion der bruges som potentiel og naturligt baseret hudblegningagenter i kosmetikindustrien.

antioxidant cistanche supplement