Den serum/PDGF-afhængige melanogene rolle af minutniveauet af den onkogene kinase PAK1 i melanomceller bevist af det højsensitive kinaseassay

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resumé:Vi har tidligere vist, at den onkogene kinase PAK4, som både melanomer og normale melanocytter udtrykker på et meget højt niveau, er essentiel for deresmelanogenese. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ved hjælp af det meget følsomme "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) kinaseassay det melanogene potentiale af en anden onkogen kinase PAK1, som melanomceller (B16F10) kun udtrykker på et meget lille niveau. Efter transficering af melanomceller med PAK1-shRNA for at dæmpe PAK1-genet, melaninindhold,tyrosinaseaktivitet og kinaseaktivitet af PAK1 blev sammenlignet mellem vildtype- og transfektanterne. Vi fandt ud af, at (i) PAK1 aktiveres signifikant af melanogene hormoner såsom IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthin) og -MSH (melanocytstimulerende hormon), (ii) dæmper det endogene PAK1-gen i melanomceller gennem PAK1-specifikt shRNA reducerer både melaninindhold ogtyrosinaseaktivitet i nærvær af både serum og melanogene hormoner til det basale niveau, (iii) den eksogent tilsatte vildtype PAK1 i melanomcellerne booster det -MSH-inducerbare melaninniveau adskillige gange uden at påvirke det basale, og (iv) - MSH/IBMX-induceret melanogenese finder næppe sted i fravær af hverken serum eller PAK1, hvilket klart indikerer, at PAK1 hovedsageligt er essentielt for serum- og -MSH/IBMX-afhængigemelanogenese, men ikke den basale, i melanomceller. Resultatet af denne undersøgelse kan være det første videnskabelige grundlag for at forklare, hvorfor en lang række urte-PAK1-blokkere såsom CAPE (caffeic acid phenethyl ester), curcumin og shikonin i kosmetik er nyttige tilhudblegning.

Nøgleord:PAK1,melanogenese, melanomer,tyrosinase, MITF,hudblegningserum

blegning af hudpleje cistanche produkter

Introduktion

Farven på hår, øjen iris og hud styres af en familie af pigmenter kaldet melaniner. Den intracellulære kilde til melanin er tyrosin og omdannes til melanin gennem en række enzymatisk oxidation (hydroxylering), som involverertyrosinase, TRP (tyrosinase-relateret protein) 1 og TRP2. Ekspressionen af ​​gener, der koder for disse melanogene enzymer, kræver mindst to onkogene/melanogene transkriptionsfaktorer (MTF'er): beta-catenin og MITF (mikroftalmi-associeret transkriptionsfaktor). Størstedelen af ​​urteforbindelser ihudblegningkosmetik hæmmer enten direkte disse melanogene enzymer eller nedregulerer MTF'erne. Tyrosinanaloger såsom kojinsyre tilhører den første kategori (tyrosinaseinhibitorer), mens størstedelen af ​​resterne såsom CAPE (koffeinsyrephenethylester), curcumin og shikonin tilhører den anden kategori (MTF-regulatorer) (1,2). Interessant nok er mange af disse MTF-regulatorer, herunder CAPE, curcumin, shikonin og cucurbitacin kendt for at blokere den onkogene/aldrende kinase PAK1 (RAC/CDC42-aktiveret kinase 1) (3-5). Det er således højst sandsynligt, at PAK1 er involveret i aktiveringen af ​​disse melanogene/onkogene transkriptionsfaktorer i hårceller, øjeniriser eller hudmelanocytter. Faktisk er i det mindste beta-catenin blandt de direkte substrater for PAK1 (6). PAK1 phosphorylerer beta-catenin ved Ser 675 til aktiveringen, hvilket fører til malign transformation. Ydermere er beta-catenin afgørende for aktiveringen af ​​MITF, hvilket fører tilmelanogeneseeller/og onkogenese af melanocytter (7).

Interessant nok blev det dog for nylig afsløret, at udslettelse af PAK1-genet i sig selv i pigmenterede mus ikke producerer nogen albino-mus (Hong He et al., upubliceret observation), hvilket klart indikerer, at i det mindste den basale melanogenese i både hårceller og øjne iris er uafhængig af PAK1, selvom PAK1's bidrag til hudenmelanogenesemangler at blive afklaret.

Vi har tidligere vist, at den onkogene kinase PAK4 (CDC42-afhængig kinase 4) er stærkt udtrykt i både melanom og normale melanocytcellelinjer og er ansvarlig for deres melanogenese, hvilket aktiverer CREB/beta-catenin-MIFT-tyrosinasepathway, mens PAK2 (RAC/CDC42-aktiveret kinase 2), et andet højt udtrykt medlem af PAK-familien, ikke spiller nogen rolle i deres melanogenese (8).

I denne undersøgelse giver vi det første biokemiske bevis for en specifik rolle af en anden onkogen kinase kaldet PAK1 i hudenmelanogenese, på trods af at dets ekspressionsniveau er minimalt: shRNA-induceret silencing af PAK1-genet i melanocytter (B16F10) afledt af musemelanom reducerede signifikant den -MSH/IBMX-inducerbaremelanogenesetil det basale niveau, mens overekspression af PAK1-genet boostede den -MSH-inducerbare melanogenese uden at påvirke basalen. Desuden fandt vi, at den -MSH/IBMX-inducerbare melanogenese kræver en serumfaktor, som højst sandsynligt er PDGF (blodplade-afledt vækstfaktor). I det serumfrie medium, kun basalmelanogenesefinder sted.

cistanchereducere tyrosinases aktivitet

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer

B16F10 melanomceller blev købt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). PAK1-SureSilencing-plasmider, attraktiv transfektion, endofree® plasmid maxi-kit blev købt fra Qiagen (Valencia, CA 91355, USA). Primære PAK1-antistoffer, biotinylerede sekundære antistoffer, signalfireTM ECL-reagens blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Kinase Glo-reagens og ATP (ATP_Glo-kinase-kit) blev købt fra Promega (Madison, Wisconsin, USA). Lipofectamin og JM109 kompetente celler blev købt fra Invitrogen og Life Technology. AG1295 og AG1478 blev købt fra Calbiochem (San Diego, CA, USA). Alle andre kemikalier inklusive human PDGF-bb blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.2. Silencing af PAK1-gen i musemelanocytter (B16F10) ved stabil transfektion med muse-PAK1-specifikt shRNA

2.2.1. Cellekultur

B16F10 melanomceller blev dyrket i DMEM suppleret med 10 procent varmeaktiveret FBS og 1 procent penicillin/streptomycin (10,000 U/mL og 100 µg/mL) ved 37 grader i en fugtet atmosfære indeholdende 5 procent CO2.

2.2.2. Stabil transfektion med muse PAK1-specifikt shRNA

ShRNA-transfektion af B16F10-cellelinje blev udført grundlæggende gennem den samme procedure, som tidligere er beskrevet (9), men med muse-PAK1--specifikke shRNA'er (# KM04553, Qiagen). Følgende fire distinkte kloner af shRNA'er blev brugt til transfektionen: klon 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), klon 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), klon 3 (GTACACACGGGTTCGAGAGAAGAT) og klon 4 (GTACCACCAGGTGTCAGAAGshCONTROL) samt den negative kontrol (WATTAT) . I denne undersøgelse viste klon 1 og 2 sig imidlertid at være mere effektive end klon 3 og 4 til at dæmpe muse-PAK1-genet i denne melanocytlinje (data ikke vist). Stabile transfektanter blev udvalgt i nærvær af G418 (1 mg/ml), som dræber mere end 99 procent af ikke-transficerede celler.

2.2.3. Western-blot-analyse af PAK1-proteinniveau og in vitro-assay for kinaseaktiviteten af ​​PAK1 i transfektanter

2.2.3.1. Western blot analyse

For at kvantificere det ekstremt lave niveau af PAK1 i både kontrol (WT) cellelinje og PAK1-dæmpede transfektanter (G418-resistente), ved at minimere de "uspecifikke støj"-niveauer, gennemførte vi den vestlige blot-analyse under anvendelse af et kanin polyklonalt antistof mod PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) som det primære antistof. Kort fortalt blev hver klon podet i en koncentration på 2 x 105 celler/brønd i en plade med 6 brønde, fordyrket i 48 timer, og cellelysaterne blev kogt i 25 µL SDS-PAGE-buffer i 5 minutter. Otte µl (indeholdende 15 µg totalt protein) af hver supernatant pr. slot blev anvendt til SDS-PAGE. Nitrocellulosen blev blottet med anti-PAK1 IgG (1:1,000 fortynding som et primært antistof), og som sekundære antistoffer, det HRP-koblede anti-kanin IgG og anti-biotin IgG (#7074, # 7075, Cell Signaling) blev brugt til at detektere både PAK1- og -actin-bånd, som til sidst blev visualiseret med ECL-systemet fra Amersham. Western blot-assayene var repræsentative for tre uafhængige eksperimenter.

2.2.3.2. "Macaroni-Western" (IP-ATP_Glo) kinaseassay for PAK1 i melanomceller

Kinaseaktiviteten af ​​PAK1 i WT-melanocytterne og shRNA-transfektanter (SH'er) blev målt ved en væsentlig modifikation (5) af en tiår gammel metode (som vi opfandt "Macaroni-Western") udviklet af en italiensk gruppe (1{{39 }}). Kort fortalt blev B16F10 melanomcellelinjer (WT eller SH'er, 2 × 105 celler/ml) fordyrket på 6-brøndplade i 24 timer. Derefter blev celler behandlet med 100 nM -MSH eller 100 µM IBMX i 48 timer. Celler blev sprængt af lysisbuffer indeholdende 50 mM Tris HCI pH 7,5 og 150 mM NaCI og 1 procent Triton-X. Til immunpræcipitation (IP) af PAK1 blev de klarede cellelysater inkuberet med anti-PAK1 IgG (1:50 fortynding) og protein A-agarose perler i 1-2 timer i det kolde rum under kontinuerlig rystning med en roterende mixer (Nissin, Suginami-ku, Tokyo, Japan). Den resulterende IP (PAK1) fra hvert lysat blev inkuberet med ATP Glo kinase assay kit (Promega) i nærvær af ATP og MBP (myelin basisprotein) i 1 time ved 37 grader, og det resterende ATP niveau blev målt ved ATP- afhængig Luciferin-Luciferase-reaktion, som til sidst genererer en luminescens (10). Den endelige suspension blev centrifugeret, og supernatanten blev overført til en 96-brøndplade til aflæsning. Luminescens blev registreret af MTP-880Lab-mikropladelæser (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japan) med en integrationstid på 0,5 s pr. brønd.

2.3. Måling af melaninindhold og tyrosinaseaktivitet i transfektanter

2.3.1. Måling af melaninindhold

Melaninindholdet blev bestemt som tidligere beskrevet (11). Kort fortalt blev B16F10-celler (vildtype eller PAK1-specifikke shRNA-transfektanter) udpladet med en tæthed på 2 × 104 celler/brønd i en 24-brøndsplade. Efter 24 timers dyrkning blev 100 µM isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) eller 100 nM -MSH tilsat og inkuberet i yderligere 72 timer ved 37 grader. Cellerne blev vasket to gange med phosphatbuffer, derefter lyseret med 500 µL af en opløsning indeholdende 1 M NaOH og 10 procent DMSO og inkuberet ved 80 grader i 1 time for at solubilisere melaninet, og melaninindholdet blev målt ved 490 nm. For at sammenligne melaninindholdet i vildtype- og transficerede celler blev den totale mængde melanin produceret af vildtype-melanocytterne betragtet som kontrol (100 procent), og mængden af ​​melanin fra transfektanterne blev beregnet i overensstemmelse hermed.

2.3.2. Assay for intracellulær tyrosinaseaktivitet

Tyrosinaseaktivitet blev bestemt som tidligere beskrevet (12) med en lille modifikation. B16F10-celler (vildtype eller transfektanterne) blev udpladet med en tæthed på 2 × 104 celler/brønd, og efter 24 timers dyrkning blev 100 µM IBMX eller 100 nM -MSH tilsat og inkuberet i yderligere 72 timer ved 37 grader . Cellerne blev derefter vasket med iskold phosphatbuffer og lyseret med phosphatbuffer (pH 6,8) indeholdende 1 procent Triton-X (500 µL/brønd). Pladerne blev frosset ved -80 grader i 30 min. Efter optøning blev 100 µL 1 procent L-DOPA tilsat til hver brønd. Efter inkubation ved 37 grader i 2 timer blev absorbansen målt ved 490 nm.

2.4. Måling af melaninindholdet i vildtype- og PAK-1-overudtrykkende melanocytter efter -MSH-behandling

Ved anvendelse af Myc-vektor (2 µg) blev melanocytter (B16F10) transficeret transient med enten vildtype (WT) PAK1 eller såkaldt "konstitutivt aktiveret" (CA) PAK1, der bærer T423E-mutation. Efter 3 dages dyrkning blev hver transficeret klon høstet til yderligere eksperiment. Effekten af ​​PAK1--overekspression på melaninindholdet blev målt ved de samme procedurer beskrevet tidligere (8). Kort fortalt blev melanocytter, enten vildtype- eller PAK-1--overekspressionen, som udtrykker enten vildtype-PAK1 eller dens CA-mutant, inkuberet med 100 nM -MSH i 3 dage. Celler blev lyseret med en opløsning indeholdende 1 M NaOH og 20 procent DMSO for at opløse melaninet, og dets indhold blev bestemt ved 405 nm.

2.5. Melanogenese i et serumfrit medium

B16F10-celler (vildtype- eller PAK1-specifikke shRNA-transfektanter) blev udpladet med en tæthed på 2 × 104 celler/brønd i en 24-brøndsplade i nærværelse af 10 procent FBS. Efter 24 timers inkubation erstattes dyrkningsmediet med et serumfrit medium og dyrkes i yderligere 72 timer med eller uden 100 µM IBMX eller 100 nM -MSH for at måle melaninindholdet.

2.6. Virkning af PDGF/EGF-receptorhæmmere på serumafhængig melanogenese

2 × 104 B16F10-celler blev podet i hver brønd i 24 timer i 10 procent FBS-holdigt medium og derefter dyrket i yderligere 72 timer i det friske medium indeholdende 100 nM -MSH og følgende: (1) intet serum, (2) 10 procent FBS alene, (3) 10 procent FBS plus 2 µM AG1295 (PDGF-receptorinhibitor) og (4) 10 procent FBS plus 400 nM AG1478 (EGF-receptorinhibitor) for at måle melaninindholdet.

2.7. Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdier med deres standardfejl. Statistiske sammenligninger blev udført ved envejs ANOVA efterfulgt af Duncans multiple range test. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SAS (version 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA), og p Mindre end eller lig med 0.05 blev betragtet som signifikant.

maca ginseng cistanche

3. Resultater

3.1. Aktivering af PAK1 i en melanomcellelinje (B16F10) af melanogene hormoner

To melanogene hormoner, -MSH (melanocytstimulerende hormon) og IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthin) bruges ofte til at stimuleremelanogenesei melanocytter såsom melanomcellelinje B16F10. Således undersøgte vi først, om disse hormoner kan aktivere PAK1 i denne cellelinje, selvom proteinniveauet af PAK1 der er ekstremt lavt sammenlignet med PAK2 og PAK4 (8). For at overvåge ændringerne i kinaseaktiviteten af ​​PAK1 i celler udviklede vi for nylig et meget følsomt/specifikt kinaseassay kaldet "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) kinaseassayprotokol ved at kombinere immunpræcipitation (IP) af PAK1 fra celle lysater og Promegas ATP_Glo kinase kit (5). Ved at bruge dette kinaseassay fandt vi, at både -MSH (100 nM) og IBMX (100 µM) aktiverer PAK1 i melanomceller, hvor -MSH er mere potent end IBMX (se i figur 1). Vi bør dog minde læserne om, at foldaktiveringen af ​​PAK1 vist her kun er tilsyneladende, fordi i løbet af denne tidskrævende reagensglas IP og kinase assay (over 3 timer i alt), der finder sted uden disse melanogene hormoner, ville PAK1 gradvist blive normaliseret over tid. Med andre ord kan vi ikke fryse den nøjagtige kinasestatus for PAK1 i slutningen af ​​cellekultur behandlet med disse stimulatorer, og foldaktiveringen er kun en undervurderet afspejling af PAK1-aktivering, der fandt sted under cellekultur af disse simulatorer.

3.2. Silencing af PAK1-gen af ​​shRNA'er i musemelanomcellelinje

For yderligere at undersøge biokemisk, om PAK1 bidrager tilmelanogenesei hudceller (melanocytter) transficerede vi stabilt melanomcellelinjen B16F10 med muse-PAK1--specifikt shRNA for selektivt at dæmpe PAK1-genet.

3.2.1. Silencing PAK1-gen i melanocytter

Vores foreløbige western blot-analyse antydede, at i to forskellige PAK1-silented kloner (SH1 og 2) er PAK1-proteinniveauerne signifikant (med omkring 75 procent) reduceret, men væksthastigheden af ​​denne melanomcellelinje i sig selv var ikke væsentligt påvirket af PAK1-dæmpningen (data ikke vist). Imidlertid var den nøjagtige kvantificering af PAK1-proteinniveauer ved at scanne denne western-blot ret vanskelig, hovedsageligt på grund af den høje baggrundsstøj omkring PAK1-båndet i bestræbelserne på at visualisere dets ekstremt lave ekspressionsniveauer. I stedet, ved at bruge "Macaroni-Western" kinaseassayet (5,10), verificerede vi, at kinaseaktiviteten af ​​PAK1 i både SH1 og 2 kloner kun er omkring 25-30 procent af den i kontrolcellerne (WT) ( se figur 2A).

3.2.2. Reduktion i melanogenesen ved at dæmpe PAK1-genet

Vores næste kritiske spørgsmål var, om en sådan reduktion i kinaseaktiviteten af ​​PAK1 påvirkermelanogenese. Melaninindholdet i disse kloner (SH1 og 2) blev således sammenlignet med vildtype (WT) melanomceller efter behandling af alle disse celler med -MSH, en melanogen inducer, i 72 timer. Som vist i figur 2B er melaninindholdet i disse PAK-1-deficiente melanocytter (SH1 og 2) reduceret med omkring 50 procent (51-55 procent), og når det basale niveau i WT uden melanogent hormon. For at se, om denne reduktion i melaninindhold er forbundet med undertrykkelse af tyrosinaseaktivitet, målte vityrosinaseaktivitet i PAK1-deficiente celler (klonerne SH1 og 2), sammenlignet med WT. Som vist i figur 2C er tyrosinaseaktiviteten i PAK-1--mangelfulde celler kun omkring 45 procent (33-58 procent) af den i WT, og når igen det basale (ikke-stimulerede) niveau, hvilket tydeligt indikerer at PAK1 er afgørende for -MSH-induceret melaninproduktion vedtyrosinasei melanocytter. Desuden blev den IBMX-inducerede melanogenese også reduceret på en meget lignende måde ved at dæmpe PAK1-genet i denne melanomcellelinje (data ikke vist). Men tager man følgende to faktorer i betragtning, er det højst sandsynligt, at kun halvdelen afmelanogenesei melanocytter er PAK1-afhængig, og den resterende (stort set "grundlæggende") er PAK4-afhængig: (i) PAK4 er også afgørende for den -MSH-inducerede melanogenese i melanocytter (8), og (ii) omkring 25 procent af PAK1-genet ser ud til stadig at blive udtrykt i disse transfektanter (SH1 og 2). Det mangler dog at blive afklaret kraftigt, om PAK1 er ansvarlig for det hormon-inducerbare eller det basalemelanogenese.

Desuden har vi bekræftet, at den endogene PAK1 er signifikant aktiveret af melanogene inducere såsom IBMX og -MSH i denne melanomcellelinje (se figur 1), men uden nogen signifikant ændring i dets autophosphorylering ved Thr 423 som bedømt af anti-pPAK1 antistof (data ikke vist).

3.3. Forøgelse i -MSH-inducerbar melanogenese ved overudtrykt PAK1

Ved overekspression af vildtype (WT) PAK1-genet i melanocytter (B16F10-cellelinje) ved transfektion afslørede vi, at det eksogent tilføjede PAK1-gen booster det -MSH-inducerbare melanin-niveau med flere gange (se venstre i figur 3, sammenlign. bane 2 og 4), mens det næppe påvirker det uafhængige "basale" melaninniveau i sig selv (sammenlign bane 1 og 3 i venstre panel i figur 3), hvilket tyder på, at PAK1 hovedsageligt bidrager til -MSH/IBMX-afhængigemelanogenese, og ikke den basale melanogenese uden eksogene stimulator(er).

3.4. Serumeffekt på -MSH/IBMX-inducerbar melanogenese

Mere interessant fandt vi, at induktionen af ​​melanogenese af -MSH/IBMX kræver 10 procent FBS (føtalt bovint serum) ud over PAK1. Som vist i figur 4A inducerede enten -MSH eller IBMX i et serumfrit medium næppemelanogenesei WT-cellerne, selvom de 10 procent FBS alene (uden -MSH/IBMX) induceredemelanogenesebetydeligt (med omkring 60 procent). Interessant nok var melanogenesen i SH-transfektanter (PAK1-deficiente celler) i nærvær eller fravær af serum det samme niveau som i WT-celler i fravær af serum (se figur 4B), hvilket tyder på, at den serumafhængige melanogenese kræver også PAK1. For at understøtte denne opfattelse aktiverer serum alene signifikant kinaseaktiviteten af ​​PAK1 i WT-celler, men den -MSH-afhængige aktivering af PAK1 i WT-celler kræver serum (se figur 4C).

Med hensyn til den kemiske natur af melanogen serumfaktor, der alene aktiverer PAK1, spekulerer vi i, at det er PDGF (blodpladeafledt vækstfaktor) af følgende årsager: (i) for mere end ti år siden har vi vist, at PDGF er den eneste vækstfaktor i serum, der aktiverer PAK1 gennem transaktivering af EGF (epidermal vækstfaktor) receptor med PDGF receptor (13,14), og for nylig har andre bevist, at enten PDGF eller EGF alene stimulerermelanogeneseaf melanocytter (15,16).

3.5. Den serum/PDGF-afhængige melanogenese kræver EGF-receptor

I et forsøg på at identificere den specifikke kemiske natur af denne melanogene serumfaktor har vi testet virkningen af ​​enten AG1295 (inhibitor specifik for PDGF-receptor) eller AG1478 (inhibitor specifik for EGF-receptor) på den serumafhængigemelanogenesei melanocytter. Som vist i figur 5 reducerede enten 2 µM AG1295 eller 400 nM AG1478 kraftigt den serumafhængigemelanogenesetil det niveau, der svarer til den grundlæggende (serumfri) melanogenese. Da PDGF er rigeligt til stede i serum, men ikke EGF og AG1295 ikke hæmmer EGF-receptoren, mens AG1478 ikke hæmmer PDGF-receptoren (13), er det højst sandsynligt, at PDGF i serum aktiverer sin receptor, som igen transaktiverer EGF-receptoren, som aktiverer til sidst PAK1, der er afgørende for serumafhængig melanogenese (se figur 6 for detaljer). Baseret på denne antagelse vil vi senere diskutere den mest sandsynlige mekanisme, der ligger til grund for den tilsyneladende synergi mellem -MSH og serum/PDGF til aktivering af PAK1, hvilket fører til robust melanogenese.

Til sidst bør det være værd at påpege, at det "basale" melaninindhold uden -MSH ikke blev signifikant ændret af overudtrykt CA (konstitutivt aktiv) mutant af PAK1, der bærer T423E-mutation (se venstre panel i figur 3, bane 5) som hvis det enten var en DN (dominant negativ) eller inaktiv mutant. Faktisk inducerede -MSH slet ikke phosphoryleringen af ​​WT PAK1 ved Thr 423 (data ikke vist). Det kunne således konkluderes, at autophosphoryleringen af ​​PAK1 ved Thr 423 ikke har noget at gøre med -MSH-induceret aktivering af PAK1, hvilket fører til den robustemelanogenesei melanomceller. Da T423E-mutant af PAK1 er velkendt for at være stærkt onkogen (6), kan auto-phosphoryleringen ved Thr 423 muligvis tjene et skifte fra "melanogen" til "onkogen" signalering.

4. Diskussion

Fra vores observation af både PAK1-afhængig og PAK4-afhængig melanogenese i melanocyt-/melanomceller, opstår der to potentielt interessante spørgsmål, der skal påpeges: (i) Den "specifikke" melanogene aktivitet af PAK1 ( kun minutiøst udtrykt) skal være langt højere end PAK4 (højt udtrykt) i melanomceller. (ii) Det ser ud til, at PAK1 hovedsageligt er ansvarlig for serum-induceret melanogenese, mens PAK4 hovedsageligt er ansvarlig for det indre (basale)melanogenese. Med andre ord, selvom PAK4-mangel er fosterdødelig hos mus, mens PAK1-mangel alene ikke producerer "albino"-mus, er den tilsyneladende forskel i den oprindelige hudfarve (grundlæggendemelanogenese) mellem sorte og hvide mennesker for eksempel kunne være i det mindste delvist en afspejling af forskellen i ekspressionsniveauet af PAK4, såvel som forskellen i niveauet af melanogentyrosinases.

In vivo, ved hjælp af HRM-2 (pigmenterede, men hårløse) mus har vi for nylig vist, at en creme indeholdende 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4-inhibitor) reducerer den UV-inducerede melanogenese i deres hud til basal niveau, selvom det stadig mangler at blive afklaret, om PAK4 eller PAK1 er ansvarlig for UV-induktion af melanogenese (8). Da PAK1 er ansvarlig for den inducerbare, men ikke den basale, melanogenese, ville det være værd at teste, om PAK1 bidrager væsentligt til den UV-inducerbaremelanogenese(solgarvning) også ved at bruge den sjældne PAK1 KO (knock-out) mutant afledt af C57B16-stamme af mus, der bærer mørke hår og øjne (Hong He et al., upubliceret observation), i et forsøg på at forstå, om en række forskellige urte-PAK1 blokkere i kosmetik er nyttige til solafskærmende midler eller ej. Interessant nok blev PAK1 rapporteret at blive aktiveret af UV-bestråling og andre DNA-skadelige midler (17).

Det er blevet vist, at -MSH aktiverer Tyr-kinasen JAK2 (18), som igen aktiverer PAK1 ved phosphorylering ved Tyr 285 (i stedet for Thr 423), hvilket fører til PIX-PAK1-interaktionen (19). Dette kunne forklare, hvorfor hverken -MSH-afhængig aktivering af PAK1 eller melanogenese involverer autophosphorylering af PAK1 ved Thr 423. Vi har således for nylig undersøgt, om den PAK1-afhængige melanogenese er blokeret af en potent urte-JAK2- hæmmer kaldet cucurbitacin I (CBI) fra bitter melon (Goya), der direkte hæmmer JAK2 (20), og fandt ud af, at CBI hæmmermelanogenesei nærvær af melanogene hormoner med mere end 70 procent, hvilket tyder på muligheden for, at CBI blokerer ikke kun PAK1, men også PAK4 (5). I denne sammenhæng ville det være af stor interesse at bemærke, at urte-PAK-1-blokkere såsom CAPE, curcumin, shikonin og FTY 720 kun kunne hæmme den -MSH-inducerede melanogenese i muse- eller humane hudceller med ca. 50 procent selv ved deres koncentrationer, hvor PAK1 er næsten fuldstændig blokeret (1,2), hvorimod den syntetiske pan-PAK-blokker PF3758309, der hæmmer både PAK1 og PAK4, afskaffermelanogenesei hudceller med omkring 90 procent ved 300 nM (8). Med andre ord kunne det -MSH-inducerede melanogene system i melanocytter skelne de PAK1-specifikke blokkere fra pan PAK-blokkere. Hidtil er ingen urte-PAK4-specifikke blokkere (ud over PAK4-specifikke siRNA'er) blevet identificeret. Imidlertid har en meget potent kvassinoid kaldet glaucarubinon afledt af et bittert træ dyrket i Amazonas jungler for nylig vist sig at blokere både PAK1 og PAK4, hvilket hæmmer væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller både in vitro og in vivo (21). Det ville derfor være af stor interesse at teste, om denne urte-PAK-blokker undertrykker melanogenesen af ​​hudceller næsten fuldstændigt ligesom PF3758309.

Hovedformålet med denne undersøgelse var at fokusere på den specifikke melanogene rolle af PAK1, og ikke at undersøge i detaljer, hvordan PAK1 aktiverer den melanogene signalvej, herunder melanogene enzymer og MTF'er. Det er dog mest sandsynligt, at PAK1 aktiverer beta-catenin direkte ved phosphorylering ved Ser 675, hvilket fører til aktivering af MITF, som er essentielt for ekspression af gener, der koder for melanogene enzymer som f.eks.tyrosinase(Tyr).

For nylig fandt vi ud af, at PAK4 (CDC42-afhængig kinase 4) også er involveret imelanogeneseaf den samme melanomcellelinje ved at aktivere to transkriptionsfaktorer, CREB og beta-catenin, som begge er essentielle for MIFT-aktivering (8). Da CREB vides at blive aktiveret af LIM kinase (22,23), der ligesom beta-catenin er blandt de almindelige direkte substrater for både PAK1 og PAK4 (6,18), er det højst sandsynligt, at PAK1 og PAK4 deler den samme CREB /beta-catenin-MITF signalveje til at aktivere de melanogene enzymgener.

Imidlertid kan de detaljerede signalveje, der fører til den -MSH/IBMX-afhængige aktivering af PAK1, afvige væsentligt fra dem, der fører til aktiveringen af ​​PAK4, hovedsagelig fordi førstnævnte involverer serumfaktoren (PDGF). Serumet alene er i stand til at aktivere PAK1 (13) og booster også den -MSH/IBMX-afhængige aktivering af PAK1. Der er med andre ord en klar synergi mellem serumet og disse melanogene hormoner i både PAK1-aktivering ogmelanogenese.

Det følgende er vores arbejdshypotese om, hvordan denne synergi kunne finde sted. Den vigtigste signalvej, der fører til PAK1-aktiveringen, er den onkogene EGFR (epidermal vækstfaktorreceptor)-RAS-PI 3 kinase-RAC/CDC42-PAK1-kaskade. Denne kaskade alene er dog ikke tilstrækkelig til den fulde aktivering. Det har brug for en anden faktor kaldet PIX, et SH3-adapterprotein, der binder PAK1 direkte gennem dets Pro-rige motiv på 18 aminosyrer kaldet PAK18. PIX-PAK1-interaktionen har brug for et tredje protein kaldet JAK2, en Tyr-kinase, der phosphorylerer PAK1 ved Tyr 285. RAS opregulerer JAK2 gennem prolaktin. Ifølge et par tidligere resultater fra os og andre (13-16) er PDGF (blodpladeafledt vækstfaktor) den eller de vigtigste melanogene serumfaktorer, der er afgørende for den -MSH/IBMX-induceredemelanogenese, fordi den aktiverer sin receptor (PDGFR) Tyr-kinase, som igen transaktiverer EGFR (epidermal vækstfaktor receptor=ErbB1) Tyr-kinase, hvilket fører til aktivering af PAK1 gennem den onkogene RAS-PI3 kinase-RAC /CDC42-vej (13). Således kan PDGF i serum alene aktivere PAK1 og inducere melanogenese op til halvvejs. Men for den fulde aktivering af PAK1-afhængig melanogenese er -MSH/IBMX nødvendig for at aktivere JAK2 gennem en cAMP-afhængig vej (som kan involvere PKA), der til sidst sikrer PIX-PAK1-interaktionen (for detaljer, se figur 6).

Som konklusion præsenterer vi her det allerførste biokemiske bevis, som kan forklare, hvordan en række forskellige urte-PAK1-blokkere såsom CAPE, curcumin og shikonin i kosmetiske cremer kunne bidrage til "hudblegningEn række analoge undersøgelser med humane melanocytter afventes for yderligere bevis eller bekræftelse.

maca ginseng cistanche

Referencer

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Curcumin undertrykker alfa-melanocyt-stimulerende hormon-stimuleret melanogenese i B16F10-celler. Int J Mol Med. 2010; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Koffeinsyrephenethylester hæmmer alfa-melanocyt-stimulerende hormon-induceret melaninsyntese ved at undertrykke transaktiveringsaktiviteten af ​​mikrophthalmi-associeret transkriptionsfaktor. J Nat Prod. 2013; 76:1399-1405.

3. Maruta H. Naturlægemidler, der blokerer den onkogene kinase PAK1: En praktisk tilgang til PAK1-afhængige sygdomme og lang levetid. Phytother Res. 2014; 28:656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Adskillige urteforbindelser i Okinawa-planter hæmmer direkte den onkogene/aldrende kinase PAK1. Drug Discov Ther. 2014; 8:238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Kombination af immunpræcipitation (IP)-ATP_Glo kinase assay og melanogenese til vurdering af potente og sikre PAK1-blokkere i cellekultur . Drug Discov Ther. 2015; 9:289-295.

6. He H, Maruta H. Onkogenicitet af PAK'er og deres substrater. I: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-aktiverede kinases: Towards the cure of cancers and other PAK-afhængige sygdomme (Maruta H, red.). Elsevier, Oxford, 2013; s. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -Catenin-induceret melanomvækst kræver den downstream-målmikrophthalmi-associerede transkriptionsfaktor. J Cell Biol. 2002; 158:1079-1087.

8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-aktiveret kinase 4 regulerer kritisk melanogenese via aktivering af CREB/MITF- og -catenin/MITF-vejene. J Invest Dermatol. 2015; 135:1385-1394.

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21-aktiveret kinase 1 stimulerer tyktarmskræftcellevækst og migration/invasion via ERK- og AKT-afhængige veje. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803:1106-1113.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Udnyttelse af luminescerende teknologi til at udvikle en kinaseanalyse: Cdk4 som et modelsystem. J Pharm Biomed Anal. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Hæmmende virkning af phlorotanniner isoleret fra Ecklonia cava på svampe-tyrosinaseaktivitet og melanindannelse i muse B16F10-melanomceller. J Agric Food Chem. 2009; 57:4124-4129.

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein hæmmer melanogenese gennem aktivering af ERK-signalvejen. Int J Mol Med. 2010; 25:923-927.

13. He H, Leitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Blodplade-afledt vækstfaktor kræver epidermal vækstfaktorreceptor for at aktivere p21-aktiverede kinasefamiliekinaser. J Biol Chem. 2001; 276:26741-26744.

14. Saito Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Receptor hetero-dimerisering: essentiel mekanisme for blodplade-afledt vækstfaktor-induceret epidermal vækstfaktor receptor transaktivering. Mol Cell Biol. 2001; 21:6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Blodplade-afledt vækstfaktor regulerer proliferation og differentiering af humane melanocytter på en differentieringsstadiespecifik måde. J Dermatol Sci. 2016; 83:200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Epidermal vækstfaktor (EGF) fremmer in vitro-differentieringen af ​​neurale kamceller til neuroner og melanocytter. Cell Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. p21-aktiveret proteinkinase gamma PAK aktiveres af ioniserende stråling og andre DNA-skadelige midler. Ligheder og forskelle med alpha PAK. J Biol Chem. 1999; 274:31119-31122.

18. Buggy JJ. Bindingen af ​​det alfa-melanocyt-stimulerende hormon til dets G-protein-koblede receptor på B-lymfocytter aktiverer Jak/STAT-vejen. Biochem J. 1998; 331:211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Fosforylering af tyrosin 285 af PAK1 letter PIX/GIT1 binding og adhæsionsomsætning. FASEB J. 2015; 29:943-959.

20. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Opdagelse af JSI-124 (cucurbitacin I), en selektiv Janus-kinase/signaltransducer og aktivator af transkription 3-signalvejsinhibitor med potent antitumoraktivitet mod humane og murine cancerceller i mus. Cancer Res. 2003; 63:1270-1279.

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaucarubinone og gemcitabin reducerer synergistisk bugspytkirtelkræftvækst via nedregulering af p21-aktiverede kinaser. Cancer Lett. 2014; 346:264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Cytoskeletændringer reguleret af PAK4 serin/threoninkinasen medieres af LIM kinase 1 og cofilin. J Biol Chem. 2001; 276:32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM kinase 1 aktiverer cAMP-responsivt element-bindende protein under den neuronale differentiering af immortaliserede hippocampale stamceller. J Biol Chem. 2004; 279:8903-8910.