RNA M6 A-læseren YTHDF2 kontrollerer NK-celle antitumor og antiviral immunitet del 6

Metastatisk melanommodel og MCMV-udfordring

B16F10-celler (105) blev injiceret iv i mus. 14 d efter injektion blev musene aflivet til postmortem analyse. Metastatiske knuder i lungen blev analyseret makroskopisk og talt. B16F10-cellelinjen blev leveret af Hua Yu (City ofHope, Los Angeles, CA). Ythdf2ΔNK- og Ythdf2WT-mus blev inficeret med en ip-injektion af Smith-stamme MCMV (2,5 × 104 PFU), som blev købt fra American Type Culture Collection (VR-1399). Perifere blodprøver blev taget gennem submandibulær punktur på dag 0, 4 og 7 efter infektion.

Lungemetastaseknuder refererer til knuder dannet af ondartede tumorceller fra andre steder, der migrerer til lungerne gennem blodet eller lymfesystemet. For mange patienter er dette en almindelig manifestation af lungekræft.

Men selvom lungemetastaseknuder udgør en trussel mod patienternes fysiske sundhed, er der ingen direkte sammenhæng mellem det og hukommelsen. Derfor bør vi aktivt møde udfordringerne med lungekræft og lungemetastaseknuder og ikke lade negative følelser og angst påvirke vores fysiske og mentale sundhed.

Samtidig kan vi vedligeholde og forbedre hukommelsen gennem nogle positive metoder. Udfør for eksempel noget hukommelsestræning, såsom matematiske udregninger, læsning, lytning til musik, spil osv. Derudover kan det at overholde gode levevaner, såsom regelmæssig motion, få nok søvn, spise sundt osv. forbedre vores hukommelse.

Det vigtigste er at bevare en positiv indstilling. Uanset hvilke vanskeligheder du står over for, skal du tro på din styrke og dit nervesystems fleksibilitet, og gennem positive justeringer og reaktioner vil du til sidst med succes overvinde vanskelighederne.

Kort sagt, selvom metastatiske knuder i lungerne udgør en trussel mod fysisk sundhed, er de ikke direkte relateret til hukommelsen. Vi bør se det positivt i øjnene og vedligeholde og forbedre vores hukommelse ved at justere vores livsstil og opretholde en god holdning. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer. Disse stoffer er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan Cistanche deserticola også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelige næringsstoffer og energi, og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer. Disse stoffer er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan Cistanche deserticola også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelige næringsstoffer og energi, og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

Klik på kend kosttilskud for at øge hukommelsen

For at måle viral belastning i det perifere blod, milt og lever, blev DNA isoleret ved hjælp af et QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit til qPCR-analyse. Følgende primere blev brugt: MCMV-IE1,59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (fremad) og MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (omvendt).

In vivo musebehandling med IL-15

Til in vivo musebehandling med IL-15 blev Ythdf2ΔNK og Ythdf2WTmus injiceret med 2 µg ip rekombinant human IL-15 (kat.nr. 745101; National Cancer Institute) i 5 dage. De behandlede og kontrolmus blev derefter aflivet til en flowcytometrisk analyse.

Flowcytometri

Enkeltcellesuspensioner blev fremstillet fra BM, blod, milt, lever og lunge fra Ythdf2ΔNK og Ythdf2WT mus som beskrevet tidligere (Wang et al., 2018b). Flowcytometrianalyse og cellesortering blev udført på henholdsvis et LSRFortessa X-20 og et FACSAriaFusion Flowcytometer (BD Biosciences).

Data blev analyseret ved hjælp af NovoExpress-software (Agilent Technologies).

Følgende fluorescensfarvemærkede antistoffer fra BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen eller Cell Signaling Technology blev brugt: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46 }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), granzyme B (QA16A02), perforin (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), annexin V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) og Eomes (WD1928), phospho-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), phospho-Akt (Ser473, #5315), phospho-S6 ribosomalt protein ,phospho-Stat3 (Tyr705, #9145) og phospho-Stat5 (Tyr694, #9539).

Til evaluering af NK-celleproliferation blev celler mærket med 5 µM CTV (Invitrogen) i henhold til producentens protokol, før de blev overført til modtagermus. Intracellulær farvning af Ki67, Tbet og Eomes blev udført ved at fiksere og permeabilisere med Foxp3/Transcription Factor Staining Kit (eBioscience).

Til påvisning af phosphorylerede proteiner blev oprensede milt-NK-celler forbehandlet med rekombinant human IL-15 (50 ng/ml) i 1 time og derefter fikseret med Phosflow Fix Buffer I efterfulgt af permeabilisering med Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) og farvning med antistoffer.

Adoptiv celleoverførsel

Til vurdering af effekten af ​​Ythdf2-mangel på NK-cellemodning blev en blanding af 5 × 106 BM-celler i et 1:1-forhold fra CD45.1 eller Ythdf2ΔNK CD45.2-mus cooverført til Rag2-/-Il2rg-/-mus. Rekonstitution af recipienter blev vurderet ved flowcytometri8 uger efter transplantation.

Til lymfopeni-inducerede homøostatiske proliferationseksperimenter blev lige mange oprensede miltNK-celler fra CD45.1- eller Ythdf2ΔNK CD45.2-mus co-overført til Rag2-/-Il2rg-/- mus efterfulgt af vurdering af de relative procentdele af overført WT og Ythdf2ΔNK-celler i NK-cellerne. af Rag2−/−Il2rg−/− modtagere ved flowcytometri på angivne tidspunkter.

Til den metastatiske melanommodel blev 106 IL-2-ekspanderede NK-celler fra Ythdf2ΔNK eller Ythdf2WTmus injiceret iv i Rag2-/-Il2rg-/- mus. 1 d senere blev B16F10-celler (105) injiceret iv i mus. 14 d efter injektion blev mus aflivet til postmortem analyse. I nogle eksperimenter blev celler mærket med CTV (5 µM, Invitrogen) for at spore celleproliferation før overførsel.

In vivo trafficking assay

Til påvisning af NK-cellehandel fra BM til perifert blod blev 1 µg iv APC-mærket anti-CD45-antistof injiceret i C57BL/6-mus. To minutter efter antistofinjektionen blev temaer aflivet med det samme, og BM-cellerne blev opsamlet til flowcytometri, efter at cellerne var farvet med CD3- og NK1.1-antistoffer. Parenkymale NK-celler blev identificeret ved mangel på CD45-farvning, hvorimod sinusformede NK-celler blev identificeret ved tilstedeværelsen af ​​CD45-mærkning. Derfor indikerer forholdet mellem NK-celler i sinusoiderne (CD45+) og forholdet i de parenkymale regioner (CD45−) NK-cellehandelen fra BM-topperifert blod under en steady state.

Real-time RT-qPCR og immunblotting

RNA blev isoleret ved hjælp af et RNeasy Mini Kit (QIAGEN) og derefter revers transskriberet til cDNA med PrimeScript RT Reagent Kit med gDNA Eraser (Takara Bio) i henhold til producentens instruktioner. mRNA-ekspressionsniveauer blev analyseret ved hjælp af SYBRGreen PCR Master Mix og et QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR System (begge fra Thermo Fisher Scientific). Primersekvenser er angivet i tabel S1.

Immunblotting blev udført i overensstemmelse med standardprocedurer, som tidligere beskrevet (Denget al., 2015; Yu et al., 2006). Følgende antistoffer blev brugt: METTL3 (kat. nr. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (kat. nr.26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (kat. nr. 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (kat.nr. RN123PW; MBL), YTHDF3 (kat.nr.25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (kat.nr. ab195377; Abcam),FTO (kat.nr. ab124892; Abcam), MDM2 (kat.nr. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (kat.nr. PA5-29949; Invitrogen) og -actin(kat.nr. {{20 }}Ig; Proteintech).

siRNA knockdown-assay

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90 % målt ved flowcytometri. Geneknockdown-effektivitet blev bestemt ved qPCR og immunblotting. 3 d efter transfektion blev celleapoptose og proliferation analyseret ved flowcytometri som beskrevet ovenfor.

Luciferase reporter analyse

Ythdf2-promotorregionen i området fra –2,000 bp til +100 bp af TSS'en blev amplificeret fra murine NK-celler og klonet ind i apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) for at generere apGL{ {5}}Ythdf2-reporterplasmid. HEK293T-celler købt fra ATCC blev cotransficeret med pGL4-Ythdf2-reporterplasmidet såvel som STAT5a- eller STAT5b-overekspressionsplasmider eller en tom vektor sammen med et pRL-TK Renilla-reporterplasmid (Promega) til normalisering af transfektionseffektivitet. Cellerne blev høstet til lysis 24 timer efter transfektion, og luciferaseaktivitet blev kvantificeret fluorimetrisk med Dual-LuciferaseSystem (Promega). Primersekvenser til kloning af Ythdf2-promoteren og STAT5a- og STAT5b-overekspressionsplasmider er opført i tabel S1.

Chip-analyser

ChIP-assays blev udført ved hjælp af et Pierce Magnetic ChIP Kit (kat. nr. 26157; Thermo Fisher Scientific) i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev en lige stor mængde ananti-anti-phospho-Stat5 (Tyr694, kat. nr. 9351; Cell Signaling Technologies) eller tilsvarende kontrol normal kanin-IgG anvendt separat til at præcipitere de tværbundne DNA-proteinkomplekser afledt af 5 × 106 oprensede primære NK-celler fra mus, som blev forbehandlet med IL-15 (50 ng/ml) i 1 time. Efter reversering af tværbinding blev DNA'et immunpræcipiteret af det angivne antistof testet ved qPCR. Sekvenserne for alle primere er anført i tabel S1.

Ex vivo cytotoksicitetsassay

Ex vivo cytotoksicitet af NK-celler blev evalueret ved standard 51Crrelease assays. Muse lymfom cellelinjer RMA-S (MHC klasse Ideficient) og RMA (MHC klasse I tilstrækkelige) celler, en gave fra Andre'Veillette (McGill University, Montreal, Canada), blev brugte astarget celler. Mus blev behandlet med ip-injektion af polyinosin:polycytidylsyre [poly (I:C); 200 µg/mus] i 18 timer. Poly(I:C)-aktiverede NK-celler blev isoleret fra milten ved hjælp af EasySepMouse NK Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies). Oprensede NK-celler blev dyrket sammen med målceller i et forhold på 5:1, 2,5:1 og 1,25:1 i nærvær af IL-2 (50 U/ml).

m6A-sek

Oprensede milt-NK-celler blev ekspanderet med IL-2 (1,000 U/ml, kat.nr. Bulk Ro 23-6019; National Cancer Institute) in vitro i 7 dage. Total RNA blev isoleret med TRIzol-reagens (Thermo FisherScientific) fra 50 millioner IL-2-ekspanderede NK-celler. Polyadenyleret RNA blev yderligere beriget fra total-RNA ved at bruge Dynabeads mRNA-oprensningskit (Invitrogen). mRNA-prøver blev fragmenteret til 100-nt-lange fragmenter med RNA-fragmenteringsreagenser (Invitrogen).

Fragmenteret mRNA (5 µgmRNA) blev brugt til m6A-immunpræcipitation under anvendelse af et m6A-antistof (202003; Synaptic) efter standardprotokollen for Magna MeRIP m6A-kittet (Merck Millipore). RNA blev beriget gennem RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) til biblioteksgenerering med et KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche). Sekventering blev udført på City of Hopes genomics-facilitet på en Illumina HiSeq 2500-maskine med enkelt læst 50-bp-tilstand. Sekventeringslæsninger blev kortlagt til musegenomet ved hjælp af HISAT2 v101-software (Kim et al., 2015).

Kortlagte læsninger af immunpræcipitation og inputbiblioteker blev leveret ved hjælp af R-pakken exomePeak (Meng et al., 2014). m6Apeaks blev visualiseret ved hjælp af Integrative Genomics Viewersoftware (http://www.igv.org). Det m6A-bindende motiv blev analyseret af MEME (https://meme-suite.org) og HOMER(http://homer.ucsd.edu/homer/motif). Kaldede toppe blev kommenteret ved skæring med genarkitektur ved hjælp af Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (fold ændring)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

50 millioner IL-2-ekspanderede NK-celler blev høstet og vasket to gange med kold PBS, og cellepelleten blev lyseret med 2 vol. lysisbuffer (10 mM Hepes, pH 7,6, 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 mM dithiothreitol, 1:100 proteaseinhibitorcocktail [Thermo Fisher Scientific] og 400 U/ml SUPERase-In RNase-hæmmer [Thermo Fisher Scientific]).

Lysatet blev inkuberet på is i 5 minutter og centrifugeret i 15 minutter for at klare lysatet. En tiendedel volumen cellelysat blev gemt som input. Resten af ​​cellelysatet blev inkuberet med 5 µg anti-YTHDF2 (kat.nr. RN123PW; MBL), der var koblet med Protein A Magnetic Beads (kat. nr. 10001D; Invitrogen) ved 4 grader i 2 timer med forsigtig drejning. Bagefter blev perlerne vasket fem gange med 1 ml iskold vaskebuffer (50 mM HEPES, pH 7,6.200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,05 % NP-40, 0,5 mM dithiothreitol og 200 U/ml RNase inhibitor).

Immunpræcipiterede prøver blev udsat for Proteinase K-fordøjelse i vaskebuffer suppleret med 1% SDS og 2 mg/ml Proteinase K (ThermoFisher Scientific) inkuberet med omrystning ved 1.200 rpm ved 55 grader i 1 time. Total RNA blev ekstraheret fra både input og immunpræcipiteret RNA ved at tilsætte 5 vol TRIzol reagens efterfulgt af Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).

cDNA-biblioteket blev genereret med et KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) og sekventeret på en Illumina HiSeq 2500 platform. Peak calling-resultater med immunpræcipitation og inputbiblioteker blev genereret af R-pakken RIPSeeker (Li et al., 2013). HOMER blev brugt til at finde motiver af datafordelingen i topområder. Kaldede toppe blev kommenteret ved skæring med gen- og transkriptarkitektur ved hjælp af ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010).

mRNA stabilitetsanalyse

Oprensede milt-NK-celler fra Ythdf2ΔNK- og Ythdf2WT-mus blev dyrket med IL-15 (50 ng/ml). 3 d efter dyrkning blev celler behandlet med actinomycin D (5 µg/ml, kat. nr. A9415; Sigma) i det angivne tidsrum. Celler uden behandling blev brugt efter 0 timer. Celler blev opsamlet på det angivne tidspunkt, og totalt RNA blev ekstraheret fra cellerne til qPCR. mRNA-halveringstiden blev beregnet ved hjælp af metoden tidligere beskrevet af Weng et al. (2018). Primersekvenser er angivet i tabel S1.

Online database analyse

Vi brugte onlineressourcen BioGPS (http://biogps.org) til at analysere den vævsspecifikke ekspression af Ythdf2. RNA-seqdatasættene var fra GEO under accessionsnr. GSE106138,GSE113214 og GSE25672. Normaliserede data fra RNA-seq-analyser blev eksporteret, og genekspressionen z-score blev visualiseret med Heatmap.2-funktionen i gplots Rlibrary

Statistikker

Ikke-parrede Students t-tests (two-tailed) blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-software. En- eller tovejs ANOVA blev udført, når tre eller flere uafhængige grupper blev sammenlignet. P-værdier blev justeret til flere sammenligninger ved hjælp af Holm-Sˇ´ıdak-proceduren. P < 0.05 blev betragtet som signifikant. *, P < {{10}}.05; **, P < 0,01; og ***, P < 0,001.

Online supplerende materiale

Fig. S1 viser proteinniveauerne af YTHDF2 i immunceller, herunder NK-celler som respons på IL-15-stimulering, MCMV-infektion og tumorprogression; generationen af ​​mus med NKcell-specifik deletion af Ythdf2. Fig. S2 viser de virale titere i milten og leveren fra mus inficeret med MCMV og procentdelen og det absolutte antal af Ly49H+ og/eller Ly49D+ NK-celler i mus inficeret med MCMV. Fig. S3 viser proliferation, overlevelse, modning og ekspression af aktiverende og inhiberende receptorer af NK-celler fra Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK mus. Fig.S4 viser reguleringen af ​​YTHDF2-ekspression ved IL-15-STAT5-signalering og ekspressionen af ​​komponenterne i IL-15-receptorer, PI3K-AKT-vejen og MEK-ERK-vejen iNK-celler fra Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK mus. Fig. S5 viser transskriptom-dækkende RNA-seq, m6A-seq og RIP-seq assays i NK-celler. Tabel S1 viser de primere, der blev brugt i undersøgelsen.

Datatilgængelighed

RNA-seq, m6A-seq og RIP-seq data blev deponeret i National Center for Biotechnology Information GEO under tiltrædelsesnr. GSE174027. De resterende data, der understøtter resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra de tilsvarende forfattere efter anmodning.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 og CA210087), Leukemia and Lymphoma Society (1364-19), California Institute for Regenerative Medicine ({DISC2COVID) 9}}), og Breast Cancer Alliance 2021 Exceptional ProjectAward. Dette arbejde blev også delvist støttet af en USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843).

Forfatternes bidrag: S. Ma, J. Yu og MA Caligiuri udtænkte og designede projektet. S. Ma, J. Yan, J. Zhang og J. Yu udførte eksperimenter og/eller dataanalyser. Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun og J. Chen bidrog med reagenser og materialestøtte. S. Ma, J. Yu, J. Chen og MA Caligiuri skrev, anmeldte og/eller reviderede papiret. Alle forfattere diskuterede resultaterne og kommenterede manuskriptet.

Oplysninger: J. Chen rapporterede "andet" fra Genovel BiotechCorp. uden for det indsendte arbejde og er en videnskabelig grundlægger af Genovel Biotech Corp. og en videnskabelig rådgiver for raceonkologi. Ingen andre afsløringer blev rapporteret.

Referencer

1. Arase, H., ES Mocarski, AE Campbell, AB Hill og LL Lanier. 2002.Direkte genkendelse af cytomegalovirus ved at aktivere og hæmme NKcelle-receptorer. Videnskab. 296:1323-1326.

2.Ayala, YM, T. Misteli og FE Baralle. 2008. TDP-43 regulerer retinoblastomproteinphosphorylering gennem undertrykkelse af cyclinafhængig kinase 6-ekspression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105:3785-3789.

3. Barbieri, I., K. Tzelepis, L. Pandolfini, J. Shi, G. Millan-Zambrano, SC Robson, ´D. Aspris, V. Migliori, AJ Bannister, N. Han, et al. 2017. Promoter-bundetMETTL3 opretholder myeloid leukæmi ved m6A-afhængig translationskontrol. Natur. 552:126-131.

4. Becknell, B. og MA Caligiuri. 2005. Interleukin-2, interleukin-15 og deres roller i menneskelige naturlige dræberceller. Adv. Immunol. 86:209-239.

5. Bertoli, C., JM Skotheim og RA de Bruin. 2013. Kontrol af cellecyklustransskription under G1- og S-faser. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14:518-528.

6. Bezman, NA, CC Kim, JC Sun, G. Min-Oo, DW Hendricks, Y. Kamimura, JA Best, AW Goldrath og LL Lanier. Immunologisk genomprojektkonsortium. 2012. Molekylær definition af identitet og aktivering af naturlige dræberceller. Nat. Immunol. 13:1000–1009.

7.Carson, WE, JG Giri, MJ Lindemann, ML Linett, M. Ahdieh, R. Paxton, D.Anderson, J. Eisenmann, K. Grabstein og MA Caligiuri. 1994. Interleukin (IL) 15 er et nyt cytokin, der aktiverer humane naturlige dræberceller via komponenter af IL-2-receptoren. J. Exp. Med. 180:1395-1403.

8. Carson, WE, TA Fehniger, S. Haldar, K. Eckhert, MJ Lindemann, CF Lai, CM Croce, H. Baumann og MA Caligiuri. 1997. En potentiel rolle for interleukin-15 i reguleringen af ​​overlevelse af menneskelige naturlige dræberceller.J. Clin. Investere. 99:937-943.

9. Chan, CJ, MJ Smyth og L. Martinet. 2014. Molekylære mekanismer for naturlig dræbercelleaktivering som reaktion på cellulær stress. Celledød Differ. 21:5–14.

10. Chen, X., J. Han, J. Chu, L. Zhang, J. Zhang, C. Chen, L. Chen, Y. Wang, H. Wang, L. Yi, et al. 2016. Kombinationsterapi af EGFR-CAR NK-celler og onkolytisk herpes simplex-virus 1 for brystkræft hjernemetastaser. Oncotarget. 7:27764-27777.

For more information:1950477648nn@gmail.com