Forholdet mellem Cyclo-oxygenase (COX-2) og hypoxiinduceret sygdom

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Intracellulær prostaglandin E2 bidrager til hypoxi-induceret proksimal tubulær celledød

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proksimale tubulære celler (PTC) er særligt sårbare over for hypoxi-induceret apoptose, en relevant faktor fornyre sygdom. Vi antog her, at PTC-død under hypoxi medieres af cyclooxygenase (COX-2)-afhængig produktion af prostaglandin E,(PGE,), som blev bekræftet i humane proksimale tubulære HK-2-celler på grund af hypoxi (1 procent O,)-induceret apoptose (i) blev forhindret af en COX-2(cyclo-oxygenase) hæmmer og af antagonister af prostaglandin (EP)-receptorer og (ii) var forbundet med en stigning i intracellulær PGE,(iPGE,) på grund af hypoxi-inducerbar faktor-1 -afhængig transkriptionel opregulering af COX{{3 }}(cyclo-oxygenase). Apoptose blev også forhindret af inhibitorer af prostaglandinoptagelsestransportøren PGT, hvilket indikerede, at iPGE, bidrager til hypoxi-induceret apoptose (tværtimod skyldtes hypoxi/reoxygenation-induceret PTC-død udelukkende ekstracellulær PGE). Således er iPGE en ny aktør i patogenesen af ​​hypoxi-induceret tubulær skade, og PGT kan være et nyt terapeutisk mål til forebyggelse af hypoxi-afhængige læsioner i nyresygdomme.

Det er veletableret, at tubulær hypoxi er en relevant faktor for både akut og kronisknyre sygdom'2 Proksimale tubulære celler (PTC) er meget aktive med hensyn til iltforbrug på grund af deres energikrævende aktiviteter med reabsorption, og de er følgelig sårbare over for hypoxi. Det er blevet vist, at apoptose spiller en relevant rolle i dyrket PTC, der er udsat for hypoxi, men de signalveje, der er ansvarlige for aktiveringen af ​​det apoptotiske maskineri, er ikke blevet undersøgt. Vi og andre har fundet ud af, at prostaglandin E, (PGE,), en vigtig lipidmediator for adskillige fysiologiske og patologiske processer inyre, spiller en relevant rolle i signaleringen, der fører til PTC-apoptose ved behandling med cisplatin7, albumin8eller leptin og gentamycin. I alle tilfælde viste stigningen i PGE sig at være afhængig af øget ekspression af cyclo-oxygenase-2(COX-2)(cyclo-oxygenase), et inducerbart enzym, som sammen med COX-1l ​​er det hastighedsbegrænsende trin i syntesen af ​​prostaglandiner. I mennesketnyre, basal COX-2(cyclo-oxygenase)udtryk er mindre intenst end COX-1. COX-2(cyclo-oxygenase)er blevet identificeret i podocytter og dele af loopen i Henle og renal vaskulatur under fysiologiske forhold10. I patologiske tilstande kan COX-2-immunreaktivitet dog findes i mange flere celletyper inden fornyreherunder PTC, og bidrager muligvis til nyreskade. Interessant nok øger hypoxi ekspressionen af ​​COX-2(cyclo-oxygenase)og/eller produktion af PGE,12-i7 i mange celletyper. Faktisk har vi tidligere fundet ud af, at hypoxi øger det intracellulære indhold i PGE, såvel som dets frigivelse til det ekstracellulære medium8. Derfor er det teoretisk muligt, at PGE medierer den apoptotiske effekt af hypoxi på PTC.

De fleste undersøgelser af PGE, afhængig apoptose har i det væsentlige været fokuseret på mekanismer, der involverer ekstracellulær PGE, fordi det er almindeligt accepteret, at PGE udøver sine biologiske virkninger gennem aktivering af plasmamembranspændende G-protein koblede PGE, receptorer (E-serie prostaglandin receptorer) EP1-4)1. Ikke desto mindre er intracellulær PGE,(iPGE,) i nogle modeller relevant ved apoptotisk celledød720-22. Dette indebærer, at for at inducere apoptose, skal PGE nå det intracellulære medium igen og aktivere en undergruppe af EP-receptorer, som er placeret inde i cellen (iEP-receptorer). Fordi opgaven med at fange PGE, hovedsageligt udføres af prostaglandinoptagelsestransportøren (PGT)23-26, resulterer PGT-hæmning i forebyggelse af iPGE-medieret apoptotisk celledød7.

Med denne baggrund i betragtning undersøgte vi i dette arbejde, om en COX-2(cyclo-oxygenase)-afhængig stigning i iPGE, niveauer medierer hypoxi-induceret apoptose i PTC.

Klik til økologisk Cistanche til nyresygdom

Metoder

Reagenser.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, krystalviolet, trypanblå opløsninger, Bromosulfophthalein (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-benzylindazol (YC1), og actinomycin D blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Z-VAD-FMK og celecoxib var fra henholdsvis Calbiochem (Darmstadt, Tyskland) og Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). TriReagent blev købt fra Vitro (Madrid, Spanien), og PVDF-membraner og Western blotting luminol-reagens blev erhvervet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. USA). ProLong Gold antifade-reagens med 4,6-diamidino{{14 }}phenylindol (DAPI), annexin-V-FITC(fluorescein isothiocyanat)/propidiumiodid (PI) apoptosedetektionskit og 2',7'-dichlorfluoresceindiacetat(DCFH-DA)probe blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) og Molecular Probes (Oregon, USA). Antistoffer blev opnået fra følgende kilder: anti-PGE og anti-COX-2(cyclo-oxygenase)antistoffer var fra Abcam (Cambridge, UK); anti-Bax og anti-Bcl-2 var fra Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la-antistof og -kanin-Alexa-Fluor 488 var fra henholdsvis BD Biosciences (Palo Alto, CA, USA) og Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); anti- -aktin- og kanin-anti-muse-IgG-peroxidasekonjugat blev købt fra Sigma (St.Louis, MO, USA).

Cellekultur og eksperimentelle forhold.

Humane proksimale rørformede HK-2-celler blev købt fra American Type Culture Collection(ATCC) (Rockville, MD, USA). Cellerne blev holdt i 5 procent CO, ved 37 grader Cin DMEM/F12 suppleret med 10 procent føtalt kvæg serum(FBS), 1 procent penicillin/streptomycin/amfotericin B og 1 procent glutamin (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) og 1 procent insulin-transferrin-selen (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA).I alle eksperimenter, celler blev udpladet ved 70-90 procent konfluens, og når de var fuldstændigt fastgjorte, blev de dyrket under hypoxiske (1 procent oxygen) eller normoxiske forhold (21 procent oxygen).Hypoxieksperimenter blev udført i en In vivo200hypoxiarbejdsstation (Ruskin Technology, West Yorkshire, Storbritannien). Tilhypoxi/reoxygeneringsforsøg, celler blev udsat forhypoxii 24 timer, og derefter blev celler inkuberet under normoksiske betingelser i op til 3 timer (reoxygeneringsperiode).

Immunfluorescensanalyse af iPGE og Western blot-analyse af COX-2(cyclo-oxygenase)og HIF-1 .

Celler til immunfluorescensanalyse og Western blot-analyse blev henholdsvis delt på glasdækglas (4x104 celler/glasdækglas) eller i seks-brøndsplader (15x104 celler/brønd) og inkuberet som beskrevet i "Resultater". Derefter blev immunfluorescens- og immunoblotting-analyse udført i det væsentlige som beskrevet tidligere. Anti-stof-arbejdsfortyndinger var: 1/50 for PGE,,1/1000 for COX-2(cyclo-oxygenase)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 og 1/5000 for -actin. Immunfluorescensdetektion blev udført ved hjælp af et Leica SP5 konfokalmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) gennem Confocal Microscopy Service (ICTS 'NANBIOSIS'U17) fra Biomedical Research Networking Center for Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN på Universitetet i Alcal, Madrid, Spanien)

Forbigående transfektion.

Forbigående transfektion med siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), pattedyrsekspressionsvektoren pcDNA3, der indeholder cDNA'et fra den vildtype humane 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenase (p15-PGDH) eller luciferase reporter plasmidkonstruktioner til human COX-2(cyclo-oxygenase)phPES2-Luc, menneskehypoxiresponselement (HRE)p9HIF1-Luc og R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) og bestemmelse af luciferaseaktivitet blev udført som beskrevet andetsteds27,28.

Celletal og celle/kerne-morfologi.

Antallet af adhærente celler blev bestemt spektrofotometrisk med en modificeret krystalviolet farvningsmetode2. For at påvise tegn på apoptose blev cellemorfologi observeret ved anvendelse af fasekontrastmikroskopi. Cellekerner blev visualiseret efter DNA-farvning med DAPI som tidligere beskrevet 0. Typisk apoptotisk morfologi, der blev undersøgt, omfattede cellulær svind, nuklear kondensation og fragmentering og dannelse af apoptotiske legemer. Til kvantificering blev seks felter undersøgt i hver eksperimentel tilstand på en blind måde for at estimere procentdelen af ​​kerner med apoptose-lignende udseende.

Flowcytometri apoptoseassay og cellelevedygtighedsassay ved trypanblåt farveeksklusionstest.

Vedhæftende celler til pladen blev løsnet ved trypsinisering og blev sammen med de løsrevne celler, der tidligere var udvundet fra dyrkningsmediet, anvendt til assayet.

Annexin-V-FITC/PI apoptosedetektionskit muliggjorde flowcytometridetektion af apoptotiske og nekrotiske HK-2-celler, som tidligere beskrevet7. Tidlige og sene apoptotiske celler var henholdsvis positive over for annexin V-farvning og begge og annexin V farvning. Nekrotiske celler var kun positive over for PI, og levende HK-2-celler viste ingen farvning.

Trypanblåt farveeksklusionstest blev brugt til at vurdere cellelevedygtighed. Levedygtige celler (hvide) og døde celler (blå) blev talt ved hjælp af et lysmikroskop og et hæmocytometer.

Statistisk analyse.

Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange. Resultaterne er udtrykt som middel ±SEM. De blev udsat for en envejsvariansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Bonferronis test for flere sammenligninger. Signifikansniveauet blev sat til P Mindre end eller lig med 0.05.

Resultater

Hypoxi inducerer proksimal tubulær HK-2 celledød.

Hypoxireducerede antallet af HK-2-celler, som vurderet ved krystalviolet assay (fig. la), og inducerede også celleafrunding og løsrivelse fra pladen (fig. lb, øverste panel). Som forventet,hypoxiudløste en model for celledød med klare morfologiske karakteristika for apoptose (se nuklear farvning med DAPI i Fig. lb, nederste panel, venstre) såsom cellekrympning med betydelig nuklear kondensation, fragmentering og dannelse af apoptotisk-lignende legemer.Hypoxi-induceret apoptose blev yderligere bekræftet af stigningen af ​​annexin V-FITC-farvning, som vurderet ved flowcytometri, og dens forebyggelse med pan-caspase-hæmmer Z-VAD-FMK (fig. lc).Hypoxibestemte også et fald i antallet af levedygtige celler, men inducerede ikke statistisk signifikante ændringer i antallet af nekrotiske celler (fig. lc, indsat).

Figur 1. Hypoxi inducerer proksimal tubulær HK-2 celledød.(a) Formindsket celletal (krystalviolet assay). (b) Morfologiske karakteristika ved apoptose. Repræsentative mikrofotografier med fasekontrast (øvre panel, original forstørrelse, 10×) DAPI-farvningsmikrofotografier (nedre panel, original forstørrelse, 40×). (c) Stigning i apoptose (flowcytometriundersøgelser). Annexin V plus-celler omfatter Annexin V plus/propidiumiodid-celler (dvs. tidlige apoptotiske celler med bevaret plasmamembranintegritet) og annexin V plus/propidiumiodid plus-celler (dvs. sene apoptotiske celler). Indsat: Typer af cellepopulationer (Annexin V-/propidiumiodid plus-celler er nekrotiske celler og annexin V-/propidiumiodid-celler er levende). Resultater er udtrykt som procenter i forhold til det samlede antal hændelser. Generel information:(1) Celler blev inkuberet i 24 timer i normoxiske (21 procent O2) eller hypoxiske (1 procent O,) tilstande, som angivet i "Methods?. pan-caspase-hæmmer Z-VAD-FMK (25 μM) var tilføjet 1 time før påbegyndelse af eksponering tilhypoxi. (2) Mikrofotografier er repræsentative eksempler på tre uafhængige eksperimenter. Søjler og fejlsøjler i grafer: Hver søjle repræsenterer middelværdien±SEM for 3 forskellige eksperimenter *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hypoxi;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hypoxiplus ZVAD.

COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE,/EP-receptorpathway medierer proksimal tubulær HK-2-celledød induceret af hypoxi.

For at vurdere COX'ens rolle-2(cyclo-oxygenase)/iPGE2/EP-receptorvej ihypoxi-induceret HK-2 celledød, præ-inkuberede vi først celler med celecoxib, en COX-2(cyclo-oxygenase)inhibitor1; AH6809, en antagonist af EP1-, EP2- og EP3-receptorer eller GW627368X, en antagonist af EP4-receptor33; eller med bromocresol green eller bromosul-fophthale i begge inhibitorer af PGT435. PGT blev også slået ned gennem transfektion med siRNA.

Figur 2. COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE,/EP receptor pathway medierer hypoxi-induceret proksimal tubulær HK-2 celledød.(a) Forebyggelse af celledød med inhibitorer af pathwayen. Øvre panel; Søjlerne viser procentdelen af ​​total celledød (venstre) eller procentdelen af ​​apoptotisk annexin V plus celler (højre). Inden man bliver udsat forhypoxi, celler blev præ-inkuberet i 1 time med 3 μM celecoxib (COX-2(cyclo-oxygenase)inhibitor); 10 μuM AH6809, （EP1-3-receptorantagonist）, 10 μM GW627368X (EP4-receptorantagonist); eller med 50 μM bromocresol grøn (BG) eller 25 μM bromosulfophthalein (BrS), to PGT-hæmmere. Nederste panel: Venstre: Forebyggelse af celledød ved at slå PGT ned gennem transfektion med siRNA (trypanblåt dykkeeksklusionstest). Indsat: Effektiviteten af ​​nedbrydningen af ​​PGT (Western blot-analyse) Højre: Koncentrationsafhængighed af den forebyggende effekt af bromcresolgrøn (BG). (b)Forebyggelse af celledød ved transfektion med en pattedyrsekspressionsvektor indeholdende prostaglandin-inaktiverende enzym 15-hydroxy-prostaglandin dehydrogenase(15-PGDH) cDNA(trypanblåt farveeksklusionstest). Indsat: Ekspression af {{ 11}}PGDH (Western blot-analyse) i transficerede celler. (c)Hypoxiinducerer en PGT-følsom stigning i iPGE, Venstre: PGE, afhængig immunfluorescens alene eller fusioneret med nuklear farvning med DAPI er vist (oprindelig forstørrelse, 40×) Højre: Kvantitativ tilgang til billederne præsenteret i venstre panel ved hjælp af Image J-software. (d) Inhibitor af EGFR-aktivering AG1478 forhindrer ikke HK-2 celledød EGFR. Celler blev præ-inkuberet i 1 time med l μM AG1478, før de blev udsat forhypoxi. （e） PGT-hæmmer BG modificerer ikke ekspressionen af ​​Bax og Bcl-2 i HK-2-celler underhypoxi(Western blot-analyse). (f) Forebyggelse afhypoxi/reoxygeneringsinduceret celledød af inhibitorer af pathwayen (trypanblåt farveeksklusionstest). Celler blev præ-inkuberet med inhibitorer af pathwayen og udsat forhypoxisom i (a). Derefter blev celler udsat for normoxia i 3 timer. Generel information:(1) Celler blev inkuberet i 24 timer i normoxiske (21 procent O,) eller hypoxiske (1 procent O,) tilstande, som angivet i "Metoder". (2) Mikrofotografier er repræsentative eksempler på tre uafhængige eksperimenter. (3) Inhibitorernes opløsningsmidler (luL/ml medium) ændrede ikke virkningen afhypoxipå celledød (resultater vises ikke). (4) Western blot-analyse: Ens protein blev bekræftet ved at sondere med et anti- -aktin eller et anti-GAPDH-antistof. (5) Søjler og fejlbjælke i grafer: Hver søjle repræsenterer middelværdien±SEM for 3 forskellige eksperimenter.*P<0.01><0.01>hypoxiellerhypoxi/reoxygenering.

Som vist i fig. 2a,hypoxi-induceret proksimal tubulær celledød blev forhindret i alle tilfælde. Hæmning af apoptose af celecoxib indikerede, at COX-2(cyclo-oxygenase)spiller en relevant rolle ihypoxi-induceret apoptotisk celledød (fig. 2a, øverste panel, højre). Mere specifikt viser det faktum, at apoptose blev forhindret af antagonisme af EP-receptorer, at apoptose medieres af COX-2(cyclo-oxygenase)-afhængig produktion af PGE. På den anden side er det højst sandsynligt, at iPGE, bidrager tilhypoxi-induceret HK-2 celledød, fordi den blev forhindret af;(i) hæmning af PGT(fig. 2a) eller(i) overekspression af 15-PGDH(fig. 2b), som inaktiverer iPGE2 gennem sin oxidation25 (bemærk, at selve transfektionsproceduren øgede følsomheden af ​​HK-2 celler over forhypoxi: celledød var 45-55 procent for transfektion under kontrolforhold sammenlignet med 15-20 procent i ikke-transficerede celler). Yderligere støtte til bidraget fra iPGE, tilhypoxi-induceret HK-2 celledød, er vores tidligere resultater, derhypoxibestemmer en stigning i celleindholdet af iPGE,1, og at denne stigning blev forhindret af PGT-hæmmere (fig. 2c).

MAPK-signalveje kan inducere apoptose, fordi iEP-receptorer transaktiverer epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR)36, hvilket fører til aktivering af MAP-kinaserne ERK1/2 og p38 i HK-2-celler0, spurgte vi, om præ -inkubation af HK-2-celler med inhibitoren af ​​EGFR-aktivering AG1478 forhindrethypoxi-induceret celledød. Vi fandt negative resultater (fig.2d), og derfor er det usandsynligt, at transaktivering af EGFR medierer HK-2 celledød underhypoxi.

I flere eksperimentelle modeller er reduktionen af ​​mitokondrie-afledt ATP underhypoxiforårsager en stigning i det pro-apoptotiske protein Bax til anti-apoptotisk protein Bcl-2 ekspressionsforhold, hvilket fører til cytochrom C-frigivelse i cytosolen, aktivering af caspase 9 og efterfølgende spaltning og aktivering af nedstrøms effektor caspases37,38. Dog præ-inkubation med PGT-hæmmer BG i HK-2-celler underhypoxiresulterede ikke i ændringer, der var kompatible med et anti-apoptotisk skift i balancen mellem ekspressionen af ​​Bc-2 og Bax(fig.2e), hvilket ikke understøtter disse proteiners rolle i HK-2-cellen død underhypoxi.

Efter hypoxisk eksponering kan episoder med reoxygenering (iskæmi/reperfusionsskade) inducere yderligere celleskade. "Paradokset" ved reoxygenationsskade kan forstås under hensyntagen til, at celler gennemgår specifikke ændringer i enzymaktiviteter, mitokondriefunktion, cytoskeletstruktur, membrantransport og antioxidantforsvar som reaktion påhypoxi, som så kollektivt disponerer for reoxygenationsskade39. Reoxygenering bidrager til akut nyreskade under iskæmisk slagtilfælde, nyretransplantation, kredsløbssvigt eller nyre- og kardiovaskulær kirurgi. I denne sammenhæng er den potentielle terapeutiske værdi af hæmningen afhypoxi/reoxygenationsinduceret proksimal tubulær celledød gennem intervention i COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE,/iEP-receptorvejen er tydelig. Derfor spurgte vi, om iPGE specifikt formidlerhypoxi-induceret celledød eller også mediererhypoxi/reoxygeneringsinduceret celledød (en in vitro-model, som efterligner in vivo nyreiskæmi/reperfusionsskade). Som vist i Fig.2f blev celledød (som vurderet ved trypanblåt dykkeeksklusionstest) forhindret af COX-2(cyclo-oxygenase)inhibitor celecoxib samt af EP-receptorantagonister AH6809 eller GW627368X. Samme som for Fig.2a tyder disse resultater på, at COX-2 spiller en relevant rolle ihypoxi/reoxygenation-induceret celledød og mere specifikt, at celledød medieres af COX-2(cyclo-oxygenase)-afhængig produktion af PGE, da det blev forhindret af antagonisme af EP-receptorer. Men fordi celledød ikke blev forhindret af PGT-hæmmere bromocresol green eller bro-mosulfophthalein (fig. 2f og supplerende figur 2d), er det mere sandsynligt, athypoxi/reoxygenation-induceret HK-2 celledød medieres udelukkende af ekstracellulær PGE.

HIF-1 -afhængig transkriptionel regulering af COX-2(cyclo-oxygenase)genekspression bidrager til enhypoxi-induceret stigning i iPGE, i proksimale tubulære HK-2-celler. PGE, biosyntese involverer frigivelse fra membranglycerophospholipider af arachidonsyre ved hjælp af phospholipase A, efterfulgt af omdannelse af COX-isoenzymer af arachidonsyre til prostaglandin H, og endelig ved isomerisering af prostakirtlen i H, til PGE, ved hjælp af prostaglandin E såsom mikrosomal PGE-syntase-1 (mPGES-1)19. Det har vi fundethypoxi-induceret apoptose i HK-2-celler er højst sandsynligt medieret af en COX-2(cyclo-oxygenase)-afhængig stigning i produktionen af ​​PGE,(fig.2). I betragtning af at COX-2(cyclo-oxygenase)er et enzym, hvis ekspression kan induceres afhypoxi, vi antog, at enhypoxi-induceret stigning i PGE, produktion i HK-2-celler kan være konsekvensen af ​​en stigning i ekspressionen af ​​COX-2(cyclo-oxygenase). For at bekræfte vores hypotese undersøgte vi (i) effekten afhypoxipå udtrykket af COX-2(cyclo-oxygenase)protein og mRNA og (ii) effekten af ​​COX-2(cyclo-oxygenase)hæmmer celecoxib påhypoxi-induceret stigning i iPGE, vores resultater indikerede dethypoxibestemt på en forbigående måde transkriptionel opregulering af COX-2(cyclo-oxygenase)udtryk(fig. 3a,b)og at COX-2(cyclo-oxygenase)hæmning sløvede stigningen i iPGE, i HK-2-celler underhypoxi(Fig. 3c). Interessant nok,hypoxibestemte også forbigående opregulering af mPGES-1-proteinekspression (fig. 3a, indsat), men påvirkede ikke mPGES-1-mRNA-ekspression (fig. 3b. indsat). Disse resultater indikerede, at øget ekspression af COX-2(cyclo-oxygenase)og mPGES-1 er ansvarlig forhypoxi-induceret stigning i iPGE.

Figur 3. HIF-la-afhængig transkriptionel regulering af COX-2(cyclo-oxygenase)genekspression bidrager til den hypoxi-inducerede stigning i iPGE i proksimale tubulære HK-2-celler.(a) Udtrykket af COX-2(cyclo-oxygenase)protein øges forbigående medhypoxi(Western blot-analyse). Indsat: Expression mPGES-1-protein er også forbigående opreguleret afhypoxi. (b) Udtryk COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA øges forbigående medhypoxi. Indsat: Ekspression af mPGES-1 mRNA er upåvirket afhypoxi. (c)Forebyggelse af celecoxib, en COX-2(cyclo-oxygenase)inhibitor, af stigningen i iPGE, induceret afhypoxi. Celler blev præinkuberet i 1 time med 3 μM celecoxib. Venstre∶PGE, afhængig immunfluorescens alene eller kombineret med nuklear farvning med DAPI er vist (oprindelig forstørrelse, 40×). Højre: Kvantitativ tilgang til billederne præsenteret i venstre panel ved hjælp af Image J-software. (d) Bidrag af transkriptionelle mekanismer. Til venstre: Transkriptionel inhibitor actinomycin D(Act. D) forhindrer enhypoxi-induceret stigning i COX-2(cyclo-oxygenase)proteinekspression (Western blot-analyse). Celler blev forbehandlet i lh med 1 ug/ml Act. D før de bliver udsat forhypoxii 3 timer. Højre: Stigning i aktiviteten af ​​en COX-2(cyclo-oxygenase)reporter konstruktion. (e) Inhibitor af HIF-la YC-1 forhindrerhypoxi-induceret transkriptionel COX-2(cyclo-oxygenase)opregulering. Celler blev præinkuberet i 1 time med 0.5 uM YC-1. Venstre: Forebyggelse af COX-2(cyclo-oxygenase)opregulering. Celler blev udsat forhypoxii 8 timer. Center: Forebyggelse af stigningen i aktiviteten af ​​en COX-2(cyclo-oxygenase)reporter konstruktion. Til højre: Hæmning af aktiviteten af ​​en HRE-drevet reporterkonstruktion. Celler blev udsat forhypoxii 8 timer.(f) øger HIF-la-hæmmer YC-1 apoptotisk celledød (flowcytometriundersøgelser). Inden man bliver udsat forhypoxi, blev celler præ-inkuberet i 1 time med 0.5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 hæmmerhypoxi-induceret stigning i HIF-1a-ekspression (Western blot-analyse). Generel information:(1) Celler blev inkuberet i 24 timer under normoxiske (21 procent O,) eller hypoxiske (1 procent O,) betingelser, som angivet i "Metoder". (2) Mikrofotografier er repræsentative eksempler på tre uafhængige eksperimenter. (3)Western blot-analyse: Lige protein blev bekræftet ved at sondere med et anti- -aktin-antistof (4) Søjler og fejlsøjler i grafer: Hver søjle repræsenterer middelværdien±SEM af 3 forskellige eksperimenter *P<0.01 vs.="" other="">

For yderligere at undersøge bidraget fra transskriptionelle mekanismer til stigningen i COX-2(cyclo-oxygenase)proteinekspression underhypoxi, udtryk for COX-2(cyclo-oxygenase)blev vurderet i HK-2-celler, som blev præ-inkuberet med transkriptionshæmmeren actinomycin D, før de blev udsat forhypoxii 5 timer. Som vist i fig. 3d,hypoxi-induceret stigning i COX-2(cyclo-oxygenase)proteinekspression blev forhindret af actinomycin D. Desuden,hypoxihar også bestemt en stigning i aktiviteten af ​​en COX-2(cyclo-oxygenase)promotorkonstruktion tidligere transficeret i HK-2-celler (fig. 3d til højre). Tilsammen antyder resultaterne vist i fig. 3d, at transkriptionelle mekanismer bidrager til enhypoxi-induceret stigning i COX-2(cyclo-oxygenase)protein ekspression. Ikke desto mindre var der en uoverensstemmelse mellem tidspunktet for aktiveringen af ​​COX-2-promotoren og tidspunktet for maksimal COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA-ekspression: mens den forbigående stigning i COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA-ekspression var maksimal efter 2 timer (fig. 3b), COX-2-promotoren blev aktiveret efter 3 timer (fig. 3d), hvilket sandsynligvis afspejler bidraget fra post-transkriptionelle mekanismer til stigningen i COX{{6 }}(cyclo-oxygenase)udtryk4. Derfor spekulerer vi i, at COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA er stabiliseret underhypoxi, hvilket ville resultere i øgede niveauer af COX-2(cyclo-oxygenase)mRNA-ekspression uden bidrag (på det tidspunkt) af øget aktivitet af COX-2(cyclo-oxygenase)promotor. Det er dog også muligt, at en tidsforskydning mellem aktivering af promotoren og akkumulering af målbart substrat også kan bidrage til uoverensstemmelsen mellem tidspunktet for aktiveringen af ​​COX-2-promotoren og tidspunktet for maksimal COX{{1 }}(cyclo-oxygenase)mRNA-ekspression.

HIF-1 er en heterodimer transkriptionsfaktor sammensat af den oxygenafhængige -underenhed og den konstitutivt udtrykte -underenhed. Underhypoxi, HIF-l akkumuleres og kommer ind i kernen, hvor den genererer transkriptionsfaktoren HIF-1 efter dimerisering med HIF-1. HIF-1 fremmer derefter ekspressionen af ​​dets målgener ved at binde sig tilhypoxi-responsive elementer (HRE'er) til stede i deres regulatoriske region og orkestrerer efterfølgende cellulære adaptive reaktioner til kamphypoxi 3. I betragtning af dethypoxikan aktivere COX-2(cyclo-oxygenase)udtryk på en HIF-1-afhængig måde gennem en funktionel HRE til stede i COX-2 promotorsekvensen2, undersøgte vi HIF-l's rolle i enhypoxi-induceret stigning i COX-2(cyclo-oxygenase)udtryk. Vi så også på aktiviteten af ​​en COX-2-promotorkonstruktion transficeret i HK-2-celler. Som vist i fig. 3e, præinkubation med HIF-1a-hæmmeren YC-1, som gjorde stumphypoxi-induceret stigning i HIF-la-ekspression og aktivitet af en HRE-reporterkonstruktion, resulterede i forebyggelse af stigningen i både ekspression af COX-2(cyclo-oxygenase)og COX'ens aktivitet-2(cyclo-oxygenase)promotorkonstruktion i HK-2 udsat forhypoxi. Sammenfattende er resultaterne vist i figur 3a-e understøtter ideen om, at HIF-1 -afhængig transkriptionel opregulering af COX-2(cyclo-oxygenase)er ansvarlig forhypoxi-induceret stigning i iPGE2.

Selvom konsekvenserne af aktiveringen af ​​HIF-1a onhypoxi-induceret apoptose er kontroversielle (sandsynligvis fordi de kan være kontekstafhængige), analyserede vi (på en foreløbig måde) HIF-1as rolle i vores eksperimentelle system. Da vi tidligere har fundet dette indgreb i COX-2(cyclo-oxygenase)/iPGE, EP receptor pathway hæmmer stigningen i HIF-la ekspression udløst afhypoxi8,56 spurgte vi, om hæmning af HIF-la resulterer i forebyggelse afhypoxi-induceret HK-2 celle apoptose. Som vist i fig. 3f steg præ-inkubation med YC-1, en HIF-l-hæmmer, faktiskhypoxi-induceret apoptose. Derfor er det usandsynligt, at HlF-la

Diskussion

Vævhypoximenes at være kritisk relevant i patofysiologien af ​​både kronisk nyresygdom og akut nyreskade, idet PTC er den mest modtagelige del af nyretubuli modhypoxi. Her undersøgte vi PGE's rolle i skaden påført afhypoxitil human PTC og fandt, at øget produktion af iPGE stammede fra HIF-la-afhængig opregulering af COX-2(cyclo-oxygenase)genekspression og øget ekspression af mPGES-1, bidrager tilhypoxi-induceret apoptotisk celledød i HK-2-celler. I betragtning af at tubulær hypoxi er en relevant faktor for både akut og kronisk nyresygdom-2, peger disse resultater på prostaglandintransporter PGT som et nyt terapeutisk mål ved nyresygdomme.

Hypoxiøger ikke kun iPGE, men også dets frigivelse til det ekstracellulære medium8, således at udskilt (ekstracellulært) PGE også kan spille en rolle ihypoxi-induceret apoptose (for eksempel udløsning af apoptotiske kaskader gennem den kanoniske aktivering af EP-receptorer placeret ved cellemembranen). To tidligere undersøgelser har vist, at celledød underhypoxiskyldtes også COX-2(cyclo-oxygenase)-afhængig produktion af PGE,1345. På den anden side, i visse celletyper (fibroblaster, mikroglia, neuroner og akut lymfoblastisk leukæmi-cellelinjer), medieres PGE.-induceret apoptose af PGE, afhængig aktivering af EP-receptorer46-48. Det har vi fundet herhypoxi-induceret HK-2-celleapoptose blev også forhindret af antagonisme af EP-receptorer (fig. 2a, øverste panel, højre). Men fordi EP-receptorer klassisk er blevet beskrevet som plasmamembranreceptorer - så de er utilgængelige for iPGE2-, spekulerer vi i, at de EP-receptorer, der medierer den apoptotiske virkning af iPGE, i hypoxiske HK-2-celler er en undergruppe lokaliseret intracellulært (dvs. iEP-receptorer).

I modsætning til iPGE2's rolle ihypoxi-induceret apoptose i HK-2-celler, fandt vi ud af, at kun ekstracellulær PGE mediererhypoxi/reoxygenation-induceret HK-2 celledød, fordi den ikke blev forhindret af inhibitorer af PGT (fig. 2f). Selvom de patologiske mekanismer af cellulær skade efterhypoxi/reoxygenering ikke er fuldstændigt forstået, er det accepteret, at celledød i vid udstrækning sker gennem produktion af overdreven reaktive oxygenarter (ROS). Dette gælder især for HK-2-celler49,50. Dog selv omhypoxikan også øge produktionen af ​​ROS, så vidt vi ved, er der ingen beviser for, at ROS spiller en relevant rollehypoxi-induceret HK-2 celledød. Dette tyder på, at de dødelige virkninger af hypoxi og hypoxi/reoxygenering i HK-2-celler medieres af forskellige mekanismer, hvilket kan forklare, hvorfor BG og BS er beskyttende modhypoximen ikke imodhypoxi/reoxygenering. Som følge heraf kan inhibering af PGT give terapeutiske fordele i PTC mod hypoxi-induceret celleskade, men ikke mod den skadelige virkning afhypoxi/reoxygenering.

HIF-1 -afhængig opregulering af COX-2(cyclo-oxygenase)var en kritisk begivenhed forhypoxi-induceret HK-2-celleapoptose (fig. 3e). Vores observation af, at HIF-hæmmer YC-1 øgede apoptotisk celledød (Fig.3f) er imidlertid forvirrende, selvom tidligere rapporter allerede har vist lignende resultater1. En mulig forklaring er et hypotetisk scenarie, hvor HIF-la ikke kun formidler den pro-apoptotiske opregulering af COX-2(cyclo-oxygenase)men også opregulering af beskyttende molekyler. Faktisk regulerede HIF-1-ekspression af beskyttende molekyler imodhypoxisåsom lang ikke-kodende RNA DARS-AS1' og mikroRNA-2103 er specifikt fundet i HK-2 celler. Men selvom disse beviser understøtter vores hypotetiske scenario, bør der udføres specifikke eksperimenter for at bekræfte det.

Undersøgelse af nyrecellernes respons påhypoxikan forbedre vores forståelse af nyrepatologi. Vi har undersøgt, skønt på en foreløbig måde, rollen af ​​en stigning i det pro-apoptotiske protein Bax til anti-apoptotisk protein Bcl-2 ekspressionsforhold ihypoxi-induceret apoptose i HK-2 celler. Vores resultater indikerede, at inhibering af PGL ikke resulterede i ændringer, der var kompatible med et anti-apoptotisk skift i balancen mellem ekspressionen af ​​Bcl-2 og Bax (fig. 2e), hvilket ikke understøtter disse proteiners rolle i iPGE-afhængig HK-2 celledød underhypoxi. Så vidt vi ved, er der kun to undersøgelser om implikationen af ​​Bcl{{0}}/Bax-aksen i hypoxi-induceret apoptose i PTC, og begge involverede anoxiske" eller næsten anoxiske O-koncentrationer5 Når PTC blev udsat for 0,2 procent O., forblev Bax-ekspression uændret, og apoptose var forbundet med nedsat Bcl-2-ekspressionsgrad. Imidlertid var ekspression af Bcl-2 upåvirket af 1 procent O, på trods af tilstedeværelse af apoptose, hvilket er sammenfaldende med vores resultater. Derfor bør andre mekanismer, der ikke nødvendigvis involverer kvantitative ændringer i Bcl-2- eller Bax-ekspression, overvejes: for eksempel kræver induktion af apoptose i dyrkede gliomceller med iPGE2 kun dens fysiske forbindelse med Bax, som udløser translokationen af ​​Bax til mitochondria202. Derfor fortjener den mekanisme, hvorigennem iPGE, bidrager til HK-2 celleapoptose, yderligere undersøgelse.

Vores gruppe har fundet ud af, at en COX-2(cyclo-oxygenase)-afhængig stigning i iPGE, medierer apoptotisk død i HK-2-celler udsat for cisplatin', apoptotiske legemer7" oghypoxi(vores nuværende resultater). Fordi PGE hurtigt frigives til ydersiden af ​​cellen efter at være blevet svnthesized2, spiller dets indadgående transport af PGl en kritisk rolle i iPGE-induceret apoptose i HK-2-celler. Derfor, når denne PTC-skade medieres af iPGE, kan behandling med inhibitorer af PGT være en nyttig terapeutisk tilgang med potentielle anvendelser såsom forebyggelse af cisplatin-induceret PTC-skade, hæmning af udbredelsen af ​​tubulær skade gennem apoptotiske legemer eller begrænsning af skadelig virkning afhypoxipå PTC.