Den orale hypoxi-inducerbare faktor Prolyl Hydroxylase-hæmmer Enarodustat modvirker ændringer i nyreenergimetabolisme i de tidlige stadier af diabetisk nyresygdom

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Introduktion

Afdeling for nefrologi og endokrinologi, University of Tokyo Graduate School of Medicine, Tokyo, Japan; Forskningsstipendium for unge forskere, Japan Society for the Promotion of Science, Tokyo, Japan; Biologiske og farmakologiske forskningslaboratorier,

Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japan; Institut for Systemfarmakologi, University of Tokyo Graduate School of Medicine, Tokyo, Japan; Laboratory for Synthetic Biology, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Suita, Japan; og WPI International Research Center for Neurointelligence, University of Tokyo Institutes for Advanced Study (UTIAS), University of Tokyo, Tokyo, Japan.

Hypoxia-inducerbar faktor (HIF) prolylhydroxylasehæmmere, også kendt som HIF-stabilisatorer, øger endogen erythropoietinproduktion og tjener som nye terapeutiske midler mod anæmi ikronisknyresygdom. HIF inducerer ekspressionen af ​​forskellige gener relateret til energimetabolisme som en adaptiv reaktion på hypoxi. Det er dog stadig uklart, hvordan det metaboliske omprogrammerende indre væv ved HIF-stabilisering påvirker patofysiologien afnyre sygdomme. Tidligere undersøgelser tyder på, at systemiske metaboliske lidelser såsom hyperglykæmi og dyslipidæmi forårsager ændringer i nyremetabolismen, hvilket fører til nyreinsufficiens, herunder diabetisk nyresygdom. Her analyserer vi virkningerne af enarodustat (JTZ-951), en oral HIF-stabilisator, på nyreenergimetabolisme i de tidlige stadier af diabetisk nyresygdom ved hjælp af streptozotocin-inducerede diabetiske rotter og alloxan-inducerede diabetiske mus. Transkriptomanalyse afslørede, at enarodustat modvirker ændringerne i diabetisk nyremetabolisme. Transkriptomanalyse viste, at fedtsyre- og aminosyremetabolismen blev opreguleret i diabetisk nyrevæv og nedreguleret af enarodustat, hvorimod glukosemetabolismen blev opreguleret. Disse symmetriske ændringer blev bekræftet ved metabolomanalyse. Mens metabolitter af glykolyse og tricarboxylsyrecyklus blev akkumuleret og aminosyrer reduceret i nyrevævet hos diabetiske dyr, blev disse metaboliske forstyrrelser mildnet af enarodustat. Desuden øgede enarodustat forholdet mellem glutathion og glutathiondisulfid og lindre oxidativ stress i nyrevævet hos diabetiske dyr. HIF-stabilisering modvirker således ændringer i nyreenergimetabolismen, der forekommer i begyndendediabetikernyresygdom.

Cistanche er meget godt for nyrefunktionen

Oversættelseserklæring

Hypoxia-inducerbar faktor (HIF) prolylhydroxylasehæmmere (også kendt som HIF-stabilisatorer) øger endogen erythropoietinproduktion og tjener som nye terapeutiske midler mod anæmi ikronisknyresygdom. Vores transkriptom- og metabolomanalyser af nyrevæv i rotte- og musediabetiske modeller har afsløret, at enarodustat (JTZ-951), en oral HIF-stabilisator, modvirker ændringer i nyreenergimetabolismen i de tidlige stadier af diabetisk nyresygdom. Resultaterne giver vigtige data til at ekstrapolere virkningerne af HIF-stabilisatorer på nyreenergimetabolisme i kliniske omgivelser, selvom der er behov for yderligere undersøgelser for at afklare, hvordan denne nyremetabolisme-omprogrammering af HIF-stabilisatorer påvirker progressionen afdiabetikernyresygdom.

Introduktionen

Hypoxia-inducerbar faktor (HIF) prolylhydroxylasehæmmere øger endogen erythropoietinproduktion og tjener som nye terapeutiske midler mod anæmi i kroniskenyresygdom. Celler er udstyret med en defensiv mekanisme mod hypoxi, og HIF er en masterregulator af dette forsvar. Nyrerne er fysiologisk udsat for hypoxi, og kronisk hypoxi er anerkendt som en sidste fælles vej, der fører til nyresygdom i slutstadiet. I betragtning af at HIF inducerer ekspressionen af ​​forskellige gener relateret til hypoxiresponser, kan HIF-stabilisatorer have pleiotrope virkninger på progressionen afnyresygdommesamt forbedring af anæmi hos kroniskenyresygdom. Interessant nok inducerer HIF ekspressionen af ​​glykolytiske gener og pyruvatdehydrogenasekinase, som hæmmer pyruvatdehydrogenase i at bruge pyruvat til at brænde den mitokondrielle tricarboxylsyre (TCA) cyklus.6,7 Denne metaboliske omprogrammering fra TCA-cyklussen er afgørende for at undertrykke iltforbruget og undertrykke oxygenglykolyse. til tilpasning af celler udsat for hypoxiske miljøer. Det er dog stadig uklart, hvordan den metaboliske omprogrammering af nyrevæv ved HIF-stabilisering påvirker patofysiologien afnyre sygdomme. Diabetisk nyresygdom (DKD) er den vigtigste årsag til nyresygdom i slutstadiet. Systemiske metaboliske lidelser såsom hyperglykæmi og dyslipidæmi forårsager ændringer i nyremetabolismen, hvilket fører til nyreinsufficiens inklusive DKD. Tidligere undersøgelser har vist øget metabolisk flux og akkumulering af glukose- og TCA-cyklusmetabolitter i diabetisk nyrebarkvæv, hvilket kan være relateret til mitokondriel dysfunktion og DKD-progression. Vi antog, at HIF-stabilisatorer kunne vende metabolismeændringerne i diabetisk nyrebarkvæv i betragtning af, at HIF, som en adaptiv reaktion på hypoxi, reducerer metabolisk flux i celler for at undertrykke iltforbruget. Ved at bruge transkriptom- og metabolomanalyser gennemførte vi således en proof-of-concept-undersøgelse for at forstå, hvordan enarodustat (JTZ-951), en oral HIF-stabilisator, påvirker nyremetabolismeændringer, der forekommer i de tidlige stadier af DKD.

RESULTATER: Enarodustat inducerer metabolisk omprogrammering fra TCA-cyklussen til glykolyse i nyreproksimale tubuliceller

Da nyrebarken hovedsageligt består af proksimale tubuli, undersøgte vi først virkningerne af enarodustat på den metaboliske flux af renale proksimale tubuliceller in vitro. Først blev Mito Stress Test (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) og Glycolytic Rate Assay (Agilent) udført i dyrkede HK-2-celler, en human proksimal tubuli-epitelcellelinje (Figur 1a). Enarodustat reducerede markant mitokondriel respiration (TCA-cyklus) og øget basal glykolyse, hvilket indikerer metabolisk omprogrammering fra TCA-cyklussen til glykolyse (figur 1; Supplerende figur S1). Vi udførte også et eksperiment med lille interfererende RNA (siRNA) for HIF -1 (figur 2; Supplerende figur S2). HIF-1 knockdown af siRNA reverserede metaboliske ændringer (basal respiration, maksimal respiration, reserverespiratorisk kapacitet og adenosintriphosphat [ATP] produktion) induceret af enarodustat, som viste, at den metaboliske omprogrammering hovedsageligt var gennem HIF-1 stabilisering (figur 2; Supplerende figur S2). Pyruvatdehydrogenaseaktivitet, en vigtig faktor for celler til at bruge pyruvat til at brænde TCA-cyklussen, blev også reduceret af enarodustat (figur 2f), som var kompatibel med de tidligere offentliggjorte observationer.

Baggrundsdata for streptozotocin-inducerede diabetiske rotter

Fra resultaterne af in vitro-eksperimenter antog vi, at HIF-stabilisatorer kunne lindre metabolismeændringer i diabetisk nyrebarkvæv gennem metabolisk omprogrammering fra TCA-cyklus til glykolyse. Vi valgte først streptozotocin (STZ)-inducerede diabetiske rotter som model for proof-of-concept-eksperimentet for at teste den ovennævnte hypotese. I denne model induceres diabetes hurtigt, hvilket giver os mulighed for at observere nettoeffekterne af diabetes og HIF-stabilisatorer på energimetabolismen i nyrevæv inden for en kort periode. Undersøgelsesprotokollen og grundlæggende data fra forsøg med STZ-inducerede diabetiske rotter er vist i figur 3a. Vi inddelte rotterne i 3 grupper: gruppe A (sham), gruppe B (DKD) og gruppe C (DKD þ enarodustat). Blodplasmaglukose, glykosyleret hæmoglobin HbA1c, triglycerid og totale kolesterolniveauer på dag 14 var signifikant øget i diabetiske grupper sammenlignet med gruppe A, hvorimod der ikke var signifikante forskelle mellem gruppe B og C (figur 3d-g). Selvom plasmakreatininniveauer ikke var forskellige mellem grupperne, var urinalbuminudskillelsen signifikant øget, og glomerulomegali var mærkbar i gruppe B sammenlignet med gruppe A, og enarodustat havde en tendens til at vende disse ændringer (figur 4). Nitrogenniveauer af urinstof i blodet var højere i diabetikergrupper, hvilket afspejler dehydrering på grund af diabetes. Sammenfattende repræsenterer nyrerne af STZ-behandlede rotter i vores undersøgelse de tidlige stadier af DKD. Transkriptom- og metabolomanalyser blev udført under anvendelse af det renale kortikale væv fra disse rotter.

Transkriptomanalyse af nyrebarkvæv

Resultaterne af transkriptomanalyse af nyrebarkvæv er vist i figur 5 og 6. Hovedkomponentanalyse og hierarkisk klyngeanalyse indikerede, at grupperne A, B og C blev adskilt i henholdsvis forskellige klynger (figur 5a og b). Differentielt udtrykte gener blev udvalgt ved │log2 fold-change (FC) │ Større end eller lig med 0.5 og Q-værdi < 0.05.="" genontologi="" og="" kanoniske="" pathway-analyser="" afslørede,="" at="" gener="" relateret="" til="" fedtsyremetabolisme="" var="" opreguleret="" i="" gruppe="" b="" sammenlignet="" med="" gruppe="" a.="" i="" modsætning="" hertil="" blev="" gener="" relateret="" til="" glukosemetabolisme="" og="" hypoxirespons="" inklusive="" hif-1-netværket="" opreguleret="" i="" gruppe="" c="" sammenlignet="" med="" gruppe="" b="" (figur="" 5c="" og="" d).="" vi="" udførte="" også="" gensætberigelsesanalyse="" (gsea)="" under="" anvendelse="" af="" de="" transkriptomiske="" data="" (figur="" 6,="" tabel="" 1="" og="" 2).="" gensæt="" af="" fedtsyre-="" og="" aminosyremetabolisme="" blev="" opreguleret="" i="" gruppe="" b="" sammenlignet="" med="" gruppe="" a="" (figur="" 6).="" i="" modsætning="" hertil="" blev="" disse="" gensæt="" nedreguleret,="" og="" gensæt="" af="" glucosemetabolisme="" blev="" opreguleret="" i="" gruppe="" c="" sammenlignet="" med="" gruppe="" b,="" hvilket="" viser,="" at="" enarodustat="" reverserede="" metabolismeændringer="" induceret="" af="" diabetes="" (figur="" 6).="" desuden="" blev="" gensæt="" af="" tca-cyklus="" nedreguleret="" i="" gruppe="" c="" sammenlignet="" med="" gruppe="" b="" (tabel="" 2),="" hvilket="" er="" foreneligt="" med="" begrebet="" enarodustat-induceret="" metabolisk="" omprogrammering="" i="" proksimale="" tubuli="" observeret="" i="" vores="" in="" vitro-undersøgelse.="" sammenfattende="" modvirkede="" enarodustat="" ændringer="" i="" diabetisk="" nyremetabolisme="" fra="" transkriptomiske="">

Metabolomanalyse af nyrebarkvæv

Vi målte de absolutte koncentrationer af 116 energirelaterede metabolitter i nyrebarkvæv fra rotter (n =4, for hver gruppe) tilfældigt udvalgt fra hver gruppe (Supplerende tabel S1; Supplerende figur S3). Partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse (PLS-DA) blev udført for at vurdere betydningen af ​​klassediskrimination (figur 7). Vi udførte metabolite set enrichment analyse (MSEA) ved hjælp af metabolitter med PLS-DA variabel betydning i projektion (VIP) score $ 1. Forskelle i metabolisme af aminosyrer, såsom glycin, serin, methionin, aspartat, glutamat, arginin, prolin, og b-alanin mellem gruppe A og B blev noteret. Forskelle i aminosyremetabolisme blev også observeret mellem gruppe B og C. Desuden viste glucosemetabolismeprocesser, såsom glykolyse og gluconeogenese, forskellige tendenser mellem gruppe B og C (figur 7).

Visualisering af transkriptom- og metabolomdata på energimetaboliske pathway-kort

Vi visualiserede transkriptom- og metabolomdata for en omfattende forståelse af energimetabolismeændringer (figur 8). Glykolyse- og TCA-cyklusmetabolitter blev fundet at være akkumuleret i gruppe B sammenlignet med gruppe A, hvilket kan skyldes den overdrevne glucosetilstrømning og opregulering af fedtsyremetabolismen i DKD. Aminosyrekoncentrationen blev reduceret i gruppe B sammenlignet med gruppe A, hvilket afspejler opreguleringen af ​​aminosyremetabolismen (figur 8a). I modsætning hertil blev akkumuleringen af ​​glykolysemetabolitter lindret af enarodustat på grund af det lette flow af glykolyse. Enarodustat vendte også diabetes-inducerede ændringer i TCA-cyklusmetabolitter og aminosyrer (figur 8b). Desuden lindrede enarodustat akkumuleringen af ​​glutathiondisulfid (GSSG) i diabetisk nyrevæv og viste således et højere glutathion/GSSG-forhold, hvilket antydede, at enarodustat lettede oxidativt stress i DKD (figur 8a og b). Reduktionen i oxidativt stress blev bekræftet af niveauerne af lipidperoxidationsmarkøren malondialdehyd i nyrebarkvæv: enarodustat vendte akkumuleringen af ​​malondialdehyd i diabetisk nyrebarkvæv (Supplerende figur S4). Sammenfattende har integration af transkriptom- og metabolomdata vist, at enarodustat modvirker ændringer i nyreenergimetabolisme, der forekommer i de tidlige stadier af DKD.

Symmetriske metabolismeændringer (diabetes vs. enarodustat) bekræftes i en alternativ model

Vi udførte transkriptomanalyse i alloxan-inducerede diabetiske mus, en anden dyremodel for diabetes, for at bekræfte vores resultater i rottemodellen. Undersøgelsesprotokoller og baggrundsdata for musemodellen er vist i figur 9. Urinalbuminudskillelse var signifikant øget i gruppe B sammenlignet med gruppe A, som blev reverseret af enarodustat (figur 9d). Derudover anvendte vi omfattende 3-dimensionsanalyse (Clear, Unobstructed Brain/ Body Imaging Cocktails og Computational analysis [CUBIC]–nyre)16 for at visualisere glomeruli i nyren. Glomerulomegali var mærkbar i gruppe B sammenlignet med gruppe A, som blev vendt af enarodustat (figur 9e). Transkriptomanalyse af nyrevæv i alloxan-inducerede diabetiske mus viste symmetriske metabolismeændringer (diabetes vs. enarodustat) på samme måde som i den STZ-inducerede diabetiske rottemodel (figur 10): fedtsyremetabolismen blev opreguleret af diabetes, hvorimod glukose metabolisme blev opreguleret af enarodustat. Endvidere blev aminosyremetabolismen opreguleret af diabetes og nedreguleret af enarodustat. Enarodustat modvirkede således ændringer i nyreenergimetabolisme, der opstod i de tidlige stadier af DKD i den alloxan-inducerede diabetiske musemodel såvel som i den STZ-inducerede diabetiske rottemodel.

DISKUSSION

I denne undersøgelse har vi vist, at enarodustat (JTZ-951), en oral HIF-stabilisator, modvirker ændringer i nyreenergimetabolisme, der forekommer i de tidlige stadier af DKD i rotte- og musemodeller af diabetes. Transkriptom- og metabolomanalyser har vist symmetriske metabolismeændringer i nyrevæv (diabetes vs. enarodustat): fedtsyre- og aminosyremetabolisme blev opreguleret i DKD, hvorimod enarodustat nedregulerede disse veje og yderligere opregulerede glukosemetabolismen (figur 5-10).

Det er ikke fuldt ud klarlagt, om HIF-stabilisering har beskyttende virkninger på patofysiologien af ​​DKD eller ej. Tidligere undersøgelser har vist, at diabetisk nyrevæv udsættes for hypoxi17, og HIF-ekspression i diabetisk nyrevæv er utilstrækkelig til at reagere på deres hypoxiske tilstande, som delvist er forårsaget af oxidativt stress.18 HIF-stabilisering med cobaltchlorid forbedrede oxidativ stress-status og reduceret proteinuri og tubulointerstitiel skade i STZ-induceret DKD.19 Dyreundersøgelsesresultater indikerede også, at HIF-stabilisering beskyttede mod udvikling af fedme,20 forbedrede insulinfølsomhed,20 og sænkede serumkolesterolniveauer.21 Disse resultater tyder på de beskyttende virkninger af HIF-stabilisering i udviklingen af DKD. I modsætning hertil blev suprafysiologisk HIF-stabilisering ved von Hippel-Lindau-deletion rapporteret at inducere nyrefibrose.22 Rollen af ​​HIF-stabilisering i DKD-progression kan være kontekstafhængig givet de pleiotrope virkninger af HIF og eksistensen af ​​forskellige DKD-fænotyper. Formålet med denne undersøgelse var at klarlægge nettoeffekterne af HIF-stabilisering på energimetabolisme i diabetiske nyrer. Tidligere rapporter har indikeret, at ændringer i energistofskiftet forekommer i DKD. Sas et al.10 viste øget energimetabolisk flux og akkumulering af glukosemetabolitter i diabetisk nyrebarkvæv, hvilket kan være relateret til mitokondriel dysfunktion. Du et al.23 rapporterede, at fumarat, en TCA-cyklusmetabolit, blev akkumuleret i diabetisk nyrevæv, og det bidrog direkte til udviklingen af ​​DKD. Vi har tidligere vist, at TCA-cyklus-metabolitter akkumulerede i diabetisk nyrevæv, hvilket blev reverseret af natrium-glucose-cotransporter 2-hæmning eller kalorierestriktion.11 Desuden viste Qi et al.24, at enzymer i glykolytiske veje, herunder pyruvatkinase M2 (PKM2), var opreguleret hos type 1-diabetespatienter uden DKD sammenlignet med patienter med DKD. PKM2-aktivering vendte akkumuleringen af ​​glykolysemetabolitter og genoprettede mitokondriel funktion, delvist ved at øge glykolytisk flux.24,25 Disse tidligere rapporter tyder på, at akkumulering af glykolyse- og TCA-cyklusmetabolitter kan påvirke progressionen af ​​DKD, som kan afbødes ved faciliteret PKM2-glykolyse, herunder aktivering. I vores undersøgelse vendte HIF-stabilisering af enarodustat ændringer i energimetabolisme og mindskede akkumuleringen af ​​glykolyse og TCA-cyklusmetabolitter i diabetisk nyrebarkvæv (figur 8). Ekspressionen af ​​glykolytiske enzymer inklusive PKM2 blev også opreguleret af enarodustat (Supplerende figur S4B). Desuden lindrede enarodustat GSSG-akkumulering og øgede glutathion/GSSG-forholdet, hvilket tyder på, at enarodustat lettede det oxidative stress i DKD (figur 8). Denne enarodustat-inducerede reduktion i oxidativ stress blev også bekræftet af ændringer i malondialdehydniveauer i nyrebarkvæv (Supplerende figur S4A). Disse resultater tyder på, at HIF-stabilisering bør have beskyttende roller på patofysiologien af ​​DKD i det mindste fra metaboliske perspektiver. Det er sikkert, at vi ikke kan undersøge, om den metaboliske omprogrammering ved HIF-stabilisering har direkte effekter på DKD-progression, fordi det kan være umuligt at skelne nettoeffekterne af metabolismeændringer på nyreudfaldet på grund af HIF's pleiotrope rolle. I vores undersøgelse blev mild albuminudskillelse i urin og nyrepatologiske abnormiteter (glomerulomegali og glomerulær basalmembranfortykkelse) induceret af diabetes dog mildnet af enarodustat i forbindelse med normaliseringen af ​​nyreenergimetabolismen. Vi ekstraherede generne, hvis ekspressionsændringer korrelerede med urinalbuminniveauer (257 prober; 232 gener) fra mikroarray-dataene i den alloxan-inducerede diabetiske musemodel og udførte pathway-berigelsesanalyse (Supplerende figur S5). Som et resultat heraf opreguleres veje relateret til mitokondriel membran og respiratorisk elektrontransport forbundet med urinalbuminniveauer, hvilket indikerer, at mitokondriel byrde er tæt forbundet med urinalbuminudskillelse. Der er således en mulighed for, at den metaboliske normalisering af diabetisk nyrevæv med HIF-stabilisatorer kan reducere mitokondriel byrde og mindske progressionen af ​​DKD. Vores data antyder patofysiologien af ​​DKD fra metaboliske perspektiver som følger: Hyperglykæmi skaber energibehov for glukosereabsorption i renale proksimale tubuli; TCA-cyklus i mitokondrier er således tvangsaktiveret for at imødekomme energibehovet i de tidlige stadier af DKD (opregulering af fedtsyre- og aminosyremetabolisme). Og HIF-stabilisatorer kan mildne denne mitokondrielle byrde ved den metaboliske omprogrammering fra TCA-cyklus til glykolyse (nedregulering af fedtsyre- og aminosyremetabolisme og opregulering af glykolyse), som kan have beskyttende roller mod DKD-progression. Yderligere undersøgelser, herunder enkeltcellede omics, er nødvendige for at afklare, hvordan mitokondriebelastningen i nyrevæv direkte påvirker patofysiologien af ​​DKD. Et andet interessant spørgsmål er, om HIF-stabilisatorer direkte påvirker glukoseabsorptionen i proksimale tubuli. Vores in vitro-data viste, at ATP-produktion reduceres signifikant af enarodustat gennem metabolisk omprogrammering fra TCA-cyklussen til glykolyse (figur 1 og 2). I betragtning af, at ATP er påkrævet for glukosereabsorption af natrium-glucose cotransporter 2, antog vi først, at glukosereabsorption kunne inaktiveres af enarodustat. Uringlukoseniveauer var dog ikke signifikant forskellige mellem gruppe B og gruppe C i begge dyremodeller (Supplerende figur S6). Sandsynligvis er reduktionen i ATP-produktion med enarodustat meget mildere i en fysiologisk situation sammenlignet med dens virkning in vitro; HIF stabilisering påvirker således ikke glukoseabsorption gennem natrium-glucose cotransporter 2, i det mindste i vores dyreforsøg. Vores undersøgelse havde 2 begrænsninger. Først brugte vi STZ-inducerede diabetiske rotter og alloxan-inducerede diabetiske mus som tidlige DKD-modeller og observerede de kortsigtede virkninger af diabetiske tilstande. I det kliniske miljø vil HIF-stabilisatorer dog blive administreret til patienter med anæmi i DKD i det sene stadie. Flere undersøgelser er nødvendige for at forstå effekten af ​​HIF-stabilisering på nyremetabolismeændringer i DKD i det sene stadie. For det andet manglede undersøgelsen tilstrækkelig statistisk kraft med hensyn til spredningen af ​​metabolitternes koncentrationer i metabolomdataene, hvorimod transkriptomdataene havde statistisk kraft, der var stor nok til at afklare hele billedet af energimetabolisme. Fordi ikke mange metabolitter viste en signifikant forskel mellem grupperne, udførte vi PLS-DA og udvalgte metabolitterne med en PLS-DA VIP-score større end eller lig med 1 for MSEA. Selvom det er vanskeligt at krydsverificere en metabolisk ændring ved brug af metabolomiske data alene, var resultaterne af metabolomanalyse kompatible med de transkriptomiske data (figur 7 og 8), hvilket gav yderligere støtte til de observerede virkninger af transkriptomændringer på nyreenergimetabolisme. Afslutningsvis modvirker enarodustat (JTZ-951), en oral HIF-stabilisator, ændringer i nyreenergimetabolismen i de tidlige stadier af DKD. Vores undersøgelse tyder på, at HIF-stabilisering kan tjene som en potentiel intervention, der retter sig mod den dysregulerede nyreenergimetabolisme i DKD.

METODER

Mito Stress Test og Glycolytic Rate Assay

HK-2-celler blev podet på en mikroplade med 96-brønd ved en tæthed på 1 * 10⁴celler/brønd. Den næste dag blev metabolisk flux målt i realtid af Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) ved hjælp af Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) eller Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100; Agilent). Koncentrationer af glucose, pyruvat og glutamin i dyrkningsmedier var henholdsvis 10 mmol/l, 1 mmol/l og 2 mmol/l.

siRNA-transfektion

HIF-1 knockdown blev udført af Stealth RNAi for human HIF1A (HSS104774 [#1] og HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Stealth RNAi siRNA negativ kontrol Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) blev brugt som den negative kontrol.

Western blotting

Primære antistoffer anvendt til farvning var anti-humant HIF-1-antistof (kanin polyklonalt, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) og anti-humant actin-antistof (kanin polyklonalt, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Et sekundært antistof var det peberrodsperoxidase-konjugerede gede-anti-kanin-IgG-antistof (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Dyreforsøg

Crl: CD (Sprague Dawley) rotter og Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) mus blev opnået fra Charles River Laboratories Japan Inc. (Yokohama, Japan). Alle eksperimenter blev godkendt af University of Tokyo Institutional Review Board (godkendelsesnummer P17-110). Alle dyreprocedurer blev udført i henhold til retningslinjerne fra National Institutes of Health (Guide for pleje og brug af laboratoriedyrene). Undersøgelsesprotokoller er vist i figur 3 og 9.

Transkriptomanalyse

Totalt RNA fra nyrebarkvæv blev isoleret ved hjælp af GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). Total RNA (100 ng) blev mærket ved hjælp af Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent) og derefter hybridiseret til SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (til rotten; Agilent) og SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }} x60K Microarray (til mus), hhv. Alle mikroarray-eksperimenter blev udført af DNA Chip Research Inc. (Tokyo, Japan). Rådata blev behandlet med R-pakkens limma i Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) for at udføre baggrundskorrektion og datanormalisering ved hjælp af kvantilnormaliseringsmetoden. Batch-effekter blev fjernet med ComBat (Bioconductor) i rotteforsøget. Differentielt udtrykte gener blev bestemt ved │log2 FC│ Større end eller lig med 0,5 og Q-værdi < 0,05.="" genontologi="" og="" kanoniske="" pathway-analyser="" blev="" udført="" ved="" hjælp="" af="" basespace="" correlation="" engine="" (illumina,="" san="" diego,="" ca).="" microarray-data="" er="" blevet="" deponeret="" i="" national="" center="" for="" biotechnology="" information="" gene="" expression="" omnibus="" som="" serier="" gse131221="" (rotte)="" og="" gse139317="">

Gensætberigelsesanalyse

GSEA er en beregningsmetode, der bestemmer, om et a priori-defineret sæt af gener viser statistisk signifikante, overensstemmende forskelle mellem 2 biologiske tilstande. GSEA blev udført ved hjælp af GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Vejene med en falsk opdagelsesrate < 0.25="" blev="" betragtet="" som="">

Metabolomanalyse

Metabolommålinger blev udført af Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Japan). Metabolitkoncentrationer blev beregnet ved at normalisere toparealet af hver metabolit i forhold til arealet af den interne standard og ved at bruge standardkurver, som blev opnået fra 3-punktkalibreringer. Se også de supplerende metoder.

Metabolitsæt berigelse analyse

Analysen af ​​metabolomics-data blev udført ved hjælp af den integrerede webbaserede platform MetaboAnalyst 4.0. PLS-DA blev udført og tilhørende VIP-score blev beregnet. Metabolitterne med PLS-DA VIP-score større end eller lig med 1 blev brugt til MSEA.

Kvantificering af glomerulære områder i nyrepatologier

Vi tog tilfældigt 3 patologiske billeder fra hver prøves periodiske syre-Schiff-farvningsbillede og målte hvert glomerulære område ved hjælp af Fiji (en fordeling af ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

KUBIK-nyre

Omfattende 3-dimensionel billeddannelse af glomeruli i nyrevæv blev udført ved hjælp af CUBIC ifølge vores tidligere artikler. Kort fortalt blev fikserede musenyrer nedsænket i CUBIC-L til delipidering og derefter udsat for immunfluorescerende farvning. Endelig blev brydningsindekset matchet af placeringen af ​​prøverne i CUBIC-R plus. Omfattende 3D-dimensionelle billeder fra gennemsigtige nyrer blev erhvervet med specialbygget lysark-fluorescensmikroskopi (MVX10-LS; Olympus, Tokyo, Japan). Det primære antistof anvendt til farvning var anti-podocin-antistoffet (kanin polyklonalt, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). Det sekundære antistof var Alexa Flour 555- konjugeret æsel anti-kanin IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

Statistisk analyse

For flere sammenligninger blev der anvendt {{0}}-måde-variansanalyse efterfulgt af Tukey-testen for flere sammenligninger, hvis det var relevant. Alle statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism 7-software (GraphPad Software, San Diego, CA). P < 0,05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="" signifikant.="" data="" præsenteres="" som="" middelværdi="" ±="">

AFSLØRING

MN har modtaget honorarer, rådgivningshonorarer eller forskningsmidler fra KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim , og Alexion. TT har modtaget et forskningslegat fra JT. Enarodustat (JTZ-951) blev leveret af JT, Tokyo, Japan. EAS og HRU er medopfindere af patenter ejet af RIKEN. En del af denne undersøgelse blev udført i samarbejde med Olympus Corporation og venlig software understøttet af Bitplane. Den anden forfatter erklærede ingen konkurrerende interesser.

ANKENDELSER

Vi er taknemmelige over for Dr. Shuhei Yao og Dr. Shinji Tanaka for værdifulde diskussioner. Vi takker også Dr. Tsuyoshi Inoue, Dr. Satoru Fukuda og Ms. Kahoru Amitani for deres tekniske support. Dette arbejde blev delvist udført under støtte fra Isotope Science Center, University of Tokyo. Dette arbejde blev støttet af Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellow (JSPS KAKENHI-bevilling 19J11928 til SH), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (JSPS KAKENHI-bevilling 18H02824 til MN ), Grant-in-Aid for videnskabelig forskning (C) (JSPS KAKENHI-bevilling 17K09688 til TT), og Grant-in-Aid til videnskabelig forskning på innovative områder (KAKENHI-bevilling 26111003 til MN).