Serum amyloid P aflejring er et følsomt og specifikt træk ved membranlignende glomerulopati med maskerede IgG Kappa aflejringer

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 og John M. Arthur2

SØGEORD:glomerulonefritis; maskerede aflejringer; massespektrometri; membranøs glomerulopati; subepitelaflejringer

Cistanche kan forbedre nyrefunktionen

Membranøs glomerulopati med maskerede IgG kappa-aflejringer (MGMID) er et nyligt beskrevet mønster af glomerulonefritis med unik histopatologi. Mønsteret er kendetegnet ved subepitel og/eller mesangialimmunaflejringer, der er "maskeret", til immunoglobulinfarvning ved rutinemæssig immunfluorescens, men stærkt plet for IgG og kappa lyskæde efter proteasefordøjelse. Patienter med dette mønster af glomerulonefritis er oftest unge kvinder, der præsenterer med proteinuri og en vag historie med autoimmun sygdom, såsom antinukleære antistoffer med lav titer. Her sammenlignede vi massespektrometriprofilen for laserfangstmikrodissekerede glomeruli fra ni MGMID-nyrebiopsier med otte biopsier, der viser andre mønstre af membranøs glomerulopati. Proteinet, der mest markant steg i MGMID, var serum amyloid P. Immunostaining viste serum amyloid P colokaliseret med IgG i glomeruli af MGMID, men ikke med PLA2R-associeret membranøs glomerulopati. Serum amyloid P var positiv i glomeruli af alle 32 MGMID biopsier, men negativ i biopsier af andre typer membranøse glomerulopatier såsom dem, der er forbundet med PLA2R og THSD7A. Der var fire biopsier med glomerulær serum amyloid P farvning blandt de 173 biopsier, der ikke opfyldte kriterierne for MGMID eller amyloidose. Alle fire af disse biopsier med positiv serum amyloid P farvning havde et membranøst mønster af glomerulopati med IgG kappa aflejringer, der kun adskiller sig fra MGMID ved manglen på "maskering". Således identificerer positiv farvning inden for glomerulære aflejringer for serum amyloid Pidentififi en unik form for glomerulonefritis, der sandsynligvis deler en fælles patofysiologisk sygdomsmekanisme.

Membranøs glomerulopati med maskerede IgG kappa-aflejringer (MGMID) er et histopatologisk mønster af glomerulonefritis beskrevet i 2014, som var den første beskrivelse af det, der er blevet betegnet maskerede glomerulære aflejringer.1 Den karakteristiske histopatologi af denne sygdom omfatter tilstedeværelsen af mesangiale og subepitelaflejringer med IgG kappa-begrænsning. Mærkeligt nok, selvom komplementkomponenten 3 (C3) farvning ofte er tydelig ved rutinemæssig immunflfluorescens på frosset væv, maskerer Ig-farvningen ofte, hvilket betyder, at den viser falsk negativ farvning ved rutinemæssig immunofluorescens, men positiv farvning, når den gentages på paraffinindlejret væv efter proteasefordøjelse. Medmindre patologen opretholder et højt mistankeindeks for denne enhed, kan det således fejldiagnosticeres som C3-glomerulopati. Andre enheder, der er blevet beskrevet for at vise dette maskeringsfænomen i glomerulære aflejringer, omfatter membranoproliferativ glomerulonefritis med maskerede monotypiske Ig-aflejringer og kryoglobulinemisk glomerulonefritis.2,3

Patienter, der viser sig at have MGMID på biopsi, er oftest unge kvinder<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologiske undersøgelsesresultater såsom antinukleare antistoffer, selv om få bærer en diagnose af en veldefineret autoimmun sygdom såsom lupus.4 Gennemsnitlig proteinuri i en nylig case-serie på 41 patienter var 3,5 g / 24 timer, og gennemsnitlig serumkreatinin viste sig at være 1,4 mg / dl.4 Aflejringerne af alle rapporterede tilfælde, der kunne testes for IgG-underklassen, var af IgG1 kappa-underklassen. På trods af denne monotypiske farvning på biopsi var langt størstedelen af de undersøgte patienter (>95 %) negative for monoklonale Igs ved serumproteinelektroforese, og der er ikke set tilfælde i forbindelse med en underliggende hæmatologisk malignitet.4

Det blev antaget, at de delte klinisk patologiske fund blandt MGMID-patienter kunne være tegn på en fælles molekylær patofysiologisk mekanisme, der driver deres sygdom. Vores hensigt med den første rapportering af denne enhed var at definere en kohorte til yderligere analyse.1 Vi beskriver her tilstedeværelsen af proteinserum-amyloid p-komponenten (SAP), der findes unikt i aflejringerne af MGMID glomeruli. Immunfædning for SAP i glomerulære aflejringer er en følsom og specificeret teknik til diagnosticering af MGMID, der også giver patogen indsigt.

Figur 1 | Serum amyloid P-komponent (SAP) er signifificant beriget i mikrodissekerede glomeruli fra patienter med membranøs glomerulopati med maskerede IgG kappa aflejringer. Normaliserede intensitetsbaserede absolutte kvantificeringsværdier fra MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Tyskland) blev brugt til statistisk analyse. Stiplede linjer viser heuristiske afskæringer til foldændring og P-værdi. (a) Et vulkanplot, der sammenligner 3 phospholipase A2-receptor (PLA2R) - positive membranøse tilfælde med andre identificerer 2 proteiner, der er klare outliers i øverste højre kvadrant. (b) Vulkanplot, der sammenligner 2 trombospondin type 1 domæneholdige 7A (THSD7A) - positive membranøse tilfælde med andre identificerer 2 proteiner, der er klare outliers med THSD7A, der viser den største foldændring. c) Et vulkanplot, der sammenligner prøver af membranlignende glomerulopati med maskerede IgG kappa-aflejringer med alle andre typer membranøse tilfælde, identificerer 6 proteiner, der er klare outliers i øverste højre kvadrant. C6, komplementkomponent 6; C7, supplement komponent 7; CFHR1, komplementfaktor-H-relateret protein 1; HP1BP3, heterochromatinprotein 1 bindende protein 3; HPRT1, hypoxanthinphosphoribosyltransferase 1; IGHG3, Ig tung konstant gamma 3.

RESULTATER

Massespektrometri af laserindfangning mikrodissekerede glomeruli

Massespektrometrianalyse af laserindfangningsmikrodissekerede glomeruli fra 9 tilfælde af MGMID blev sammenlignet med 8 tilfælde af membranøs glomerulopati (MG), herunder 3 tilfælde af phospholipase A2-receptor (PLA2R)-positiv MG, 2 tilfælde af trombospondin type 1-domæneholdig 7A (THSD7A)-positiv MG og 3 tilfælde af lupus MG. I alt 1695 proteiner blev identificeret i denne analyse. En proof-of-principle analyse blev udført for at teste, om proteiner involveret i sygdomspatogenesen af MG kunne påvises ved massespektrometri. For hver kendt membranøs type blev proteindifferentiel overflod sammenlignet med de resterende grupper ved hjælp af normaliserede intensitetsbaserede absolutte kvantificeringsværdier (iBAQ). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Welchs t-test, og resultaterne blev visualiseret på et vulkanplot. PLA2R var markant mere rigelig i tilfælde af PLA2R-associeret MG og viste den stærkeste foldændring (figur 1a). THSD7A viste de stærkeste foldændringer i THSD7A-associeret MG, omend med en større P-værdi på grund af den lave prøvestørrelse i denne gruppe (n 1/4 2; Figur 1b). Samlet set viste denne proof-of-principle-analyse, at massespektrometri af laserfangstmikrodissekerede glomeruli kan identificere proteiner, der betyder patogenese af sygdom i membranøs glomerulopati.

Vi forsøgte derefter at identificere proteiner, der potentielt var involveret i MGMID-patogenese ved hjælp af denne tilgang. I alt 6 proteiner var markant mere rigelige i MGMID-prøverne i forhold til de andre grupper (tabel 1). Proteinet med den højeste foldændring var SAP (figur 1c). De resterende proteiner bestod af IgG Kappa, 3 komplementproteiner og heterochromatinproteinet 1-bindende protein 3 (HP1BP3). SAP blev betragtet som den bedste kandidat, da det blev påvist i alle MGMID-prøver og viste den største forskel i overflod i forhold til ikke-MGMID-prøver. Alle IG'er identificeret ved massespektrometri i laserindfangningsmikrodissekerede glomeruli fra tilfælde af membranlignende glomerulopati med IgG kappa-aflejringer er vist i supplerende tabel S1. Spektrale tællinger ved prøveudtagning af alle proteiner, der viste en $ 1 log2 øget overflod i MGMID-prøver og en P-værdi # 0,1 er vist i supplerende tabel S2.

Cistanchekan forbedrenyrefunktion

SAP-farvning i tilfælde af membranøs glomerulopati

Et polyklonalt kaninantistof mod SAP-proteinet (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) viste stærk positiv farvning langs de glomerulære kældermembraner i tilfælde med MGMID, der colokaliserede med IgG ved konfokal analyse. SAP viste ikke colokalisering med IgG i glomeruli fra PLA2R-associeret MG (figur 2). Et polyklonalt kaninantistof mod HP1BP3 blev testet i 4 biopsier med MGMID og viste negativ farvning i de glomerulære aflejringer i alle 4 tilfælde.

SAP-farvning blev udført på i alt 211nyreBiopsiermed glomerulonefritis (tabel 2). I alt 36 tilfælde med immuntypeaflejringer farvet positive for SAP. Alle de tilfælde, der farvede positive, delte visse histopatologiske træk, herunder tilstedeværelsen af mesangiale og subepitelaflejringer med IgG kappa-begrænsning og ingen endocapillære eller membranoproliferative ændringer ved lysmikroskopi. SAP var negativ i alle tilfælde med maskerede aflejringer, der ikke var MGMID, herunder 3 tilfælde af kryoglobulinemisk glomerulonefritis og 3 tilfælde af maskeret membranoproliferativ glomerulonefritis. Det var også negativt i alle 19 tilfælde af proliferativ glomerulonefritis med monoklonale Ig-aflejringer (PGNMID), herunder tilfælde med IgG1 kappa (4 tilfælde), IgG2 lambda (1 tilfælde), IgG 3 kappa (8 tilfælde) og IgG3 lambda (6 tilfælde). Alle 30 tilfælde af polyklonal membranøs glomerulopati (PLA2R, THSD7A, lupus og segmental) var negative for SAP. Yderligere former for glomerulonefritis blev også undersøgt og var negative. Blandt de infektionsrelaterede glomerulonefritis var der 7 positive for IgG-farvning og 6, der havde tegn på subepitel-pukkelaflejringer. Som forventet viste alle 6 tilfælde af amyloidose positiv farvning i amyloidaflejringer. Det smudsede aflejringsmønster stod imidlertid i skarp kontrast til den granulære farvning, der var til stede i tilfælde af MGMID. Repræsentative fotomikrografer af glomeruli på SAP-plet fra en række forskellige nyresygdomme er vist i supplerende figur S1.

Alle 32 tilfælde, der tidligere var identificeret som MGMID, var positive for SAP. Derudover var der positiv farvning for SAP i glomeruli fra 4 af 25 tilfælde af membranøs glomerulopati med monotypisk IgG-aflejring, der ikke maskerede rutinemæssigt

immunofluorescens, herunder 4 ud af 13 tilfælde med IgG1 kappa, 0 af 2 tilfælde med IgG1 lambda, 0 af 5 tilfælde med IgG2 kappa, 0 af 4 tilfælde med IgG3 kappa og 0 af 1 tilfælde med IgG4 kappa. Samlet set blev 32 ud af 36 (89 %) af SAP-positiv glomerulopati maskeret og fifit i kategorien MGMID, mens de øvrige 4 ud af 36 (11 %) blev afmaskeret og diagnosticeret som MG med IgG1 kappa-aflejringer. Patienter med monotypisk membranøs glomerulopati, der ikke maskerede, men var positive for SAP, havde en gennemsnitsalder på 33 år med et forhold mellem kvinder og mænd på 4:0. Tilfælde med monotypisk membranøs glomerulopati, der ikke maskerede, men var negativ for SAP, havde en gennemsnitsalder på 59,3 år med et forhold mellem kvinde og mand på 15:4.

Tabel 1 | Proteiner øges markant i glomeruli hos patienter medmembranøs glomerulopatimed maskerede IgG kappa-aflejringer, som vist ved massespektrometri

Serumreaktivitet over for SAP

Sera fra 22 patienter med MGMID, 12 med PLA2R-positiv membranøs glomerulopati og 6 normale kontroller blev testet for IgG-reaktivitet over for SAP ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). Selvom der var en vis variabilitet blandt patienter i hver gruppe, var der ingen signifificant forskel i IgG-reaktivitet over for SAP mellem grupperne (supplerende figur S2).

Figur 2 | Colokalisering af IgG og serum amyloid P-komponent (SAP). (a-c) Immunofluorescensforsøg udført på en nyrebiopsiprøve fra en patient diagnosticeret med membranøs glomerulopati med maskerede IgG kappa-aflejringer viser granulær glomerulær kældermembranfarvning for (a) SAP og (b) IgG. (c) Der er stærk colokalisering af SAP og IgG i de glomerulære kældermembranaflejringer. (d-f) Immunofluorescensforsøg udført på en nyrebiopsiprøve fra en patient med 3 phospholipaser A2-receptorpositive membranøse glomerulopatier viser (d) negativ glomerulær kældermembranfarvning for SAP og (e) positiv granulær glomerulær kældermembranfarvning for IgG. (f) Der er mangel på colokalisering hos denne patient med 3 phospholipaser A2-receptorassocierede membranøse glomerulopatier. For at optimere visningen af dette billede henvises til onlineversionen af denne artikel i tabel 2 | Resultater af serum amyloid p komponent (SAP) farvning i nyrebiopsier

AA, amyloid A; AL, amyloid lyskæde; C3, supplement komponent 3; GBM, glomerulær kældermembran; MG, membranøs glomerulopati; MGMID, membranøs glomerulopati med maskerede IgG kappa-aflejringer; MPGN, membranoproliferativ; glomerulonefritis; PGMNID, proliferativ glomerulonefritis med monoklonale IgG kappa-aflejringer; PLA2R, phospholipase A2-receptor; THSD7A, trombospondin type 1 domæneholdig 7A.

DISKUSSION

MGMID er et nyligt beskrevet og unikt mønster af glomerulopati karakteriseret ved subepitel- og mesangiale aflejringer, der pletter for IgG kappa ved paraffin IF (figur 3). Patienter med dette mønster af glomerulopati har tendens til at være unge kvinder (alder<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP er et 25-kDa pentamerisk protein inden for pentraxinfamilien, der er kodet af APCS-genet og er rigeligt i serum og som en bestanddel af den glomerulære kældermembran.5 Selvom den nøjagtige funktion af SAP er uklar, er det kendt at interagere i plasma med en lang række proteiner, herunder komplementkomponenter, apolipoproteiner og regulatorer af koagulation og proteolyse.6 Det danner stabile calciumafhængige interaktioner med dets ligander, herunder proteiner, lipoproteiner og DNA, der beskytter dem mod nedbrydning. SAP fungerer som et opløseligt mønstergenkendelsesmolekyle, der er involveret i det medfødte immunrespons, der genkender en række patogen- og skadesrelaterede molekylære mønstre, herunder mikrobielle komponenter og apoptotisk celleaffald.7 SAP's interaktion med patogen- eller skadesrelaterede molekylære mønstre fremmer komplementmedieret clearance af apoptotisk celleaffald ved direkte binding til komplementkomponent 1q (C1q) og aktivering af den klassiske komplementvej. På trods af komplementaktivering er SAP kendt for at give immunregulering, faldende neutrofilbetændelsei væv gennem reduceret endoteladhæsion,8 reduceret elastasefunktion,9 og reduceret homing til væv.10 SAP er også kendt for at være det vigtigste bindende protein for DNA og kromatin i plasmaet.11

I sygdom er SAP bedst kendt for at være en del af aflejringerne af amyloidose. Selvom det er mindre godt undersøgt, er der også tegn på, at det kan spille en rolle i menneskelige og dyremodeller af autoimmun sygdom. SAP-antistoffer er blevet identificeret hos patienter medautoimmunsygdomme, og reduceret SAP-udtryk har vist sig at fremmeAutoimmuniteti murine modeller. Antistoffer mod SAP identificeres hos 44 % af patienterne med systemisk lupus erythematosus, hvor antistoftitre korrelerer med sygdomsaktivitet.12 SAP-mangel viste sig at resultere i udvikling af spontan autoimmunitet hos autoimmun-tilbøjelige C57BL/6-mus og hos ikke-autoimmune tilbøjelige 129/Sv-mus, når de krydses med C57BL/6-mus (129/Sv x C57BL/6 F2)13, men ikke i 129/Sv-stammen alene, hvilket tyder på, at underliggende genetisk modtagelighed kan være nødvendig for SAP-mangel for at fremkalde autoimmunitet.14 Musene viser produktion af antinukleære antistoffer, anti-enkeltstrenget DNA, anti-dobbeltstrengede DNA-antistoffer og reumatoide faktorer. De udvikler en proliferativimmunkompleksmedieret glomerulonefritis, oftere hos kvinder.13 I en murinmodel af lupus nefritis, hvor glomerulonefritis induceres ved injektion af aktiveret selv-DNA i serum, reducerede SAP-genterapi med en plasmidvektor produktionen af anti-dobbeltstrengede DNA-antistoffer, immunkompleksaflejring og nyreinflmmation og forhindrede udbrud af lupus nefritis.15

Figur 3 | Nyrebiopsififindings i membranøs glomerulopati med maskerede IgG kappa-aflejringer. Fotomikrografer fra biopsien vist i figur 2 er vist her. (a) Segmentelle pigge er til stede langs de glomerulære kældermembraner, af Jones methenamin sølvplet (original forstørrelse×400). (b) Elektronmikroskopi afslører subepitelaflejringer, der er til stede langs den glomerulære kældermembran (original forstørrelse×12.000). c) Glomeruli-pletteregativ for IgG ved rutinemæssig immunflfluorescens på frisk væv (direkte immunoflfluorescens, original forstørrelse×400). d) Glomeruli fra samme tilfælde plet positiv på paraffinindlejret væv efter proteasefordøjelse (direkte immunoflfluorescens; original forstørrelse×400). e) Glomeruli viser farvning for kappa og f) ikke lambda på det proteasefordøjede paraffinindlejrede væv (direkte immunoflfluorescens; original forstørrelse×400). For at optimere visningen af dette billede, se venligst onlineversionen af denne artikel på www.nyre-international.org.

På trods af den lyskædebegrænsning, der ses på biopsi, er der i øjeblikket ingen tegn på, at denne enhed er forbundet med underliggende lymfoproliferative lidelser eller cirkulerende monoklonale Igs.4 MGMID bør således ikke anses for at være inden for spektret af monoklonal gammopati af nyrebetydning på nuværende tidspunkt. SAP-autoantistoffernes rolle er også usikker. I modsætning til andre former for membranøs glomerulopati med et protein, der specifikt er til stede i immunaflejringerne, såsom PLA2R-associeret sygdom,16 synes MGMID ikke at være drevet af autoantistoffer rettet mod SAP, da vi ikke kunne påvise serumantistofreaktivitet mod SAP hos MGMID-patienter. En alternativ forklaring er, at IgG kappa er til stede som et resultat af normal interaktion mellem disse 2 proteiner snarere end en autoimmun antigen-antistofinteraktion, da Ig kappa-kæden vides at være en del af det normale interaktom af serum SAP.6 Derfor, selvom det er nyttigt til vævsdiagnostik af denne enhed, tjener test for SAP-antistoffer i serumet ikke som en ikke-invasiv diagnostik på nuværende tidspunkt, og den underliggende drivkraft for denne sygdom forbliver et mysterium.

Kliniske resultater i MGMID er ekstremt variable, lige fra spontan remission til progression til slutfasenyresygdommed gentagelse i transplantation. Retrospektiv analyse har ikke vist nogen sammenhæng mellem den anvendte behandling og det kliniske resultat.4 Opdagelsen af SAP-involvering i denne sygdom har potentielt konsekvenser for terapi. Behandlinger, der er direkte rettet mod SAP, har vist tidligt løfte i behandlingen af amyloidose.17,18 Derudover indikerer massespektrometriresultaterne, at terapier rettet mod komplementkaskaden kan være nyttige til behandling af denne form for glomerulonefritis, da de fleste af de proteiner, der blev øget i MGMID glomeruli, er komplementrelaterede. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at identificere biomarkører for aktivitet for denne sygdom såvel som terapier.

Årsagen til maskering af immunaflejringer i MGMID-biopsier på rutinemæssig immunflfluorescens forbliver et mysterium. Tilstedeværelsen af SAP i indskuddene rejser nye mulige forklaringer på dette fænomen i tilfælde af MGMID. For eksempel er interaktioner af SAP-proteinet kendt for at være stærkt Ca2þ-afhængige,6 og mange af de transportmedier og buffere, der anvendes til behandling af nyrebiopsivæv til immunoflfluorescens, er blottet for Ca2þ. Dette in vitro-fravær af Ca2þ kan resultere i forstyrrelse af immunaflejringer, så de ikke længere er tilgængelige til påvisning ved immunoflfluorescens på det frosne væv. De immunkomplekse aflejringer vil dog fortsat være tilgængelige til påvisning i det formalinfikserede væv som følge af de formalinducerede kovalente kemiske bindinger mellem proteiner i væv.

Vi beskriver her for første gang den unikke tilstedeværelse af SAP i MGMID's glomerulære indskud. Derudover viser vi, at farvning afnyreBiopsierfor SAP identificerer tilfælde med klinisk patologiske træk svarende til dem i MGMID, uden maskering, ved rutinemæssig immunflfluorescens. I betragtning af disse resultater mener vi, at positiv farvning inden for glomerulære aflejringer for SAP identificerer en unik form for glomerulonefritis, der deler en fælles patofysiologisk sygdomsmekanisme. Indtil den seneste beskrivelse af MGMID blev disse tilfælde diagnosticeret i adskillige forskellige kategorier, der spænder fra C3-glomerulopati til infektionsrelateret glomerulonefritis til atypisk membranøs glomerulopati.1 Den hurtige udvikling af de diagnostiske kriterier og vores forståelse af denne form for glomerulonefritis fremhæver massespektrometriens evne til at give patofysiologisk indsigt i immunmedieret glomerulonefritis.

METODER

Teknikker til behandling af nyrebiopsi

Standard renal biopsi behandlingsteknikker blev anvendt, herunder lys, immunoflfluorescens og elektronmikroskopi.19,20 Alle lette mikroskopiprøver blev farvet med hæmatoxylin og eosin, Jones methenamin sølv, Masson trichrom og periodisk syre-Schiff reagens. Alle direkte immunoflfluorescenssektioner blev skåret ved 4 mm og reageret med flfluorescein-mærkede polyklonale kanin-anti-humane antistoffer mod IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrinogen og k-, og l-lyskæder (Dako, Carpenteria, CA) i 1 time og skyllet; et dækslip blev påført ved hjælp af vandige monteringsmedier. Udvalgte tilfælde blev farvet for flfluorescein-mærkede polyklonale mus anti-humane antistoffer mod IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Paraffinimmunfluorescens blev udført efter proteasefordøjelse som tidligere beskrevet.2,3 I alt 9 MGMID-biopsier og 8 sammenligningskontrolbiopsier med membranøs glomerulopati af andre typer blev udvalgt til massespektrometrianalyse. Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af Solutions Institutional Review Board og var i overensstemmelse med Helsinki-erklæringens principper.

Cistanche kantonifynyre

Massespektrometri af laserindfangning mikrodissekerede glomeruli

Nyrebiopsivæv fra formalinfast paraffinindlejret væv blev skåret i en tykkelse på 10 mm på Leica PET-membranrammedias (Leica, Wetzlar, Tyskland). Disse dias blev derefter farvet med hæmatoxylin. Glomeruli blev mikrodissekteret i mikrocentrifugerør ved hjælp af et Leica DM6000B-mikroskop. De mikrodissekerede glomeruli blev lyseret i 2% natriumdodecylsulfat og 0,1M dithiothreitol ved 99 °C i 1 time og behandlet ved filterassisteret prøveforberedelse (FASP).21 Det klare lysat blev overført til Vivacon 500-koncentratorer (MWCO på 30 kDa; Sartorius, Göttingen, Tyskland). Natriumdodecylsulfat blev fjernet ved gentagne vaske med 8 M urinstof i 0,1 M tris(hydroxymethyl)-aminomethan/Cl, pH 8,5; prøverne blev derefter alkyleret med 0,05 M iodoacetamid. Iodoacetamid blev fjernet ved 3 vaske med 8 M urinstof/0,1 M tris(hydroxymethyl)- aminomethan/Cl, pH 8,5, efterfulgt af 3 vaske med 0,05 M ammoniumbicarbonat. Proteiner blev fordøjet med trypsin (sekventeringskvalitet, Promega, Madison, WI) i et forhold på 40:1 w/w ved 37 °C i 16 timer. Peptider blev indsamlet ved centrifugering og afsaltet på C18-trins spidser (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Fordøjede peptider blev analyseret af NanoLC-tandem massespektrometri ved anvendelse af et Thermo Orbitrap Fusion Lumos massespektrometer (Thermo Scientific). Peptiderne blev lagt på en omvendt fasefældesøjle (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) indeholdende 2,5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) ladet overfladehybridharpiks koblet til en 150 mm X 0,075 mm analytisk kolonne indeholdende den samme omvendte faseharpiks som anvendt i fælden. Et nanoAcquity ultraperformance væskekromatografisystem (Waters Corp.) blev derefter brugt til at generere en 60-minutters gradient fra 98:2 til 60:40 buffer A: B-forhold (buffer A 1/4 0,1% myresyre, 0,5% acetonitril; buffer B 1/4 0,1% myresyre, 99,9% acetonitril).

Peptider blev elueret fra søjlen med en integreret sprøjtespids (Picofrit, New Objective) og ioniseret ved elektrospray (2,0 kV) efterfulgt af tandemmassespektrometrianalyse ved anvendelse af kollisionsinduceret dissociation med højere energi (HCD). Undersøgelsesscanninger af peptidprækursorer blev udført i 240K opløsning (ved 400 m / z) med et 5×10⁵ iontællingsmål. Tandemmassespektrometri blev udført ved isolering ved 1,6 Th med quadrupolen, HCD-fragmentering med en normaliseret kollisionsenergi på 30 og hurtig scanningsmassespektrometrianalyse i ionfælden. De opnåede tandemmassespektrometridata blev søgt i den seneste Humane Uniprot-database, der indeholder både Swiss Prot- og TREMBLE-posterne ved hjælp af

MaxQuant (Max Planck Institut for Biokemi, Planegg, Tyskland). Visualisering af data blev udført ved hjælp af Stillads v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Den falske opdagelsesrate blev sat til 1% for peptid-til-spektrum-kampene. Normaliserede iBAQ-værdier fra MaxQuant blev brugt til kvantisering. iBAQ-fordelingerne for hver prøve blev medianjusteret for at kontrollere for forskelle i belastning. iBAQ-værdier svarende til nul blev fjernet fra datasættet. Til statistisk hypotesetest blev der udført en 2-prøve Welchs t-test for hvert protein ved anvendelse af normaliserede iBAQ-værdier for de 2 grupper. Hvis et protein kun blev påvist i en gruppe, blev der udført en 1-prøve Welchs t-test ved anvendelse af den mindste påviste iBAQ-værdi som nulhypotesen.

SAP farvning

Formalinfikerede paraffinindlejrede sektioner, skåret ved 3 mm, blev deparaffifiniseret, og antigenhentning blev udført ved 99 ° C. Sektionerne blev reageret med kaninpolyklonalt anti-SAP polyklonalt antistof (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) efterfulgt af en Rhodamin rød X-konjugeret ged anti-kanin sekundær, som blev fastfase adsorberet for at sikre minimal krydsreaktion med human IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Hver sag blev kørt med positive og negative kontroller. Pletten blev evalueret ved standard immunoflfluorescensmikroskopi. Det blev vurderet til at være positivt, hvis der var positiv granulær kapillær sløjfefarvning i glomeruli, og negativt, hvis der ikke var nogen kapillærsløjfe

farvning i glomeruli. Colokalisering af IgG og SAP i de glomerulære kældermembraner blev undersøgt ved konfokal mikroskopi ved hjælp af et Zeiss LSM 880 konfokal laserscanningsmikroskop (Zeiss Microscopy, Jena, Tyskland). Til denne analyse, polyklonal (flfluorescein isothiocyanat-konjugeret) kanin anti-human IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) blev reageret med det varmehentede væv efter farvningen for SAP som beskrevet ovenfor. Negative kontroller blev udført for at sikre antistofs specificitet ved at udelade primære antistoffer. Fire tilfælde af MGMID blev testet for tilstedeværelsen af HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) ved immunoperoxidasefarvning.

Test for serumantistoffer mod SAP

SAP-protein (R & D Systems, Minneapolis, MN; 1948-SAB-050) blev fortyndet til 3 ng/ml i karbonat-bicarbonatbuffer (pH 9,6) og belagt på en 96-brønds Immulon H2-plade (Thermo Scientific) natten over ved 4 ° C. Pladerne blev vasket x3 ved hjælp af 200 ml vaskebuffer (1×phosphatbufret saltvand og 0,05% tween) og blokeret i 2 timer med blokerende buffer (1×phosphatbufret saltvand, 0,05% tween, 1% fiskegelatine). Pladerne blev derefter vasket×3 med 200 ml vaskebuffer. Tyve mikroliter fortyndet serum (1:100 i vaskebuffer) blev tilsat pr. Brønd og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Pladerne blev vasket×7 med 200 ml vaskebuffer efterfulgt af tilsætning af detektionsantistoffet, anti-Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Pladerne blev vasket×7 med 200 ml vaskebuffer. Dernæst blev 3,3',5,5'-tetramethylbenzidinperoxidasesubstrat og peroxidasesubstrat Sol B blandet i forholdet 1:1, og 100 ml blev tilsat pladen. Reaktionen blev stoppet ved at tilsætte 100 ml 2M H2SO4, efterladt på bænken i 20 minutter før læsning ved 450 nm. Til kontrol for at sikre, at SAP-proteinet er bundet til pladen, brugte vi kaninanti-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) i en seriel fortynding efterfulgt af anti-kanin IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories; 111-035-144). Kontrollen viste en god sammenhæng mellem fortyndingen af antistoffet og absorbansen med en gennemsnitlig R-kvadreret værdi på 0,95.

Cistanche til forbedringnyrefunktion

OFFENTLIGGØRELSE

Alle forfatterne erklærede ingen konkurrerende interesser.

SUPPLERENDE

MATERIALE Supplerende fil (PDF)

Figur S1. Repræsentative billeder af glomerulær SAP-farvning fra en række nyresygdomme.

Figur S2. Anti-SAP seroreaktivitetsundersøgelser ved enzymbundet immunosorbentassay.

Tabel S1. Alle Ig'er identificeret ved massespektrometri i laserfangst mikrodissekerede glomeruli fra tilfælde af membranøs glomerulopati med IgG kappa-aflejringer.

Tabel S2. Spektrale tællinger ved en prøveudtagning af alle proteiner viste en $ 1 log2 øget overflod i MGMID-prøver og en P-værdi # 0,1.

REFERENCER

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et al. Membranøs glomerulopati med maskerede IgG kappa-aflejringer.NyreInt. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Paraffin immunoflfluorescens i nyrepatologisk laboratorium: mere end en bjærgningsteknik. Mod Pathol. 2015;28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD, et al. Membranoproliferativ glomerulonefritis med maskerede monotypiske immunoglobulinaflejringer. 2015;88:867-873.

4. Larsen CP, Koger CL, Cossey LN, et al. Klinisk patologiske træk ved membranøs glomerulopati med maskerede IgG kappa-aflejringer. 2016;1:299-305.

5. Emsley Jørgensen, Hvid HE, O'Hara BP, et al. Struktur af pentamerisk human serum amyloid P komponent. Natur. 1994;367:338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, et al. Serumamyloid P-komponent (SAP) interaktom i humant plasma indeholdende fysiologiske calciumniveauer. Biokemi. 2017;56:896–902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, et al. Mønstergenkendelse af pentraxiner. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98-116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, et al. Pentraxinerne PTX3 og SAP i medfødt immunitet, regulering af inflflammation og vævsombygning. Jørgen Hepatol. 2016;64:1416–1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Human amyloid P-komponent: en elastasehæmmer. Scand Jørgensen Immunol. 1984;20:219–226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Serum amyloid P: en systemisk regulator af det medfødte immunrespons. J Leukoc Biol. 2014;96:739-743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Beskyttende molekyler - C-reaktivt protein (CRP), serumamiyloid P (SAP), pentraxin3 (PTX3), mannosebindende lektin (MBL) og apolipoprotein A1 (Apo A1) og deres autoantistoffer: prævalens og klinisk betydning i autoimmunitet. J Clin Immunol. 2005;25:582–591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. Anti-serum amyloid komponent P antistoffer hos patienter med systemisk lupus erythematosus korrelerer med sygdomsaktivitet. 2005;64:1698-1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, et al. Serum amyloid P komponent styrer kromatin nedbrydning og forhindrer antinukleær autoimmunitet. Nat Med. 1999;5:694-697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert Jørgensen, et al. Autoimmunitet og glomerulonefritis hos mus med målrettet deletion af serum-amyloid P-komponentgenet: SAP-mangel eller stammekombination? Immunologi. 2004;112:255–264.

15. Zhang W, Wu Jørgensen, Qiao B, et al. Forbedring af lupus nefritis ved serum amyloid P komponent genterapi med forskellige mekanismer varierede fra forskellige stadier af sygdommen. PloS One. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, et al. M-type phospholipase A2-receptor som målantigen i idiopatisk membranøs nefropati. N Engl Jørgensen Med. 2009;361:11-21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, et al. Terapeutisk clearance af amyloid af antistoffer mod serum amyloid P komponent. N Engl Jørgensen Med. 2015;373:1106-1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV, et al. Gentag doser af antistof mod serum amyloid P-komponent klare amyloidaflejringer hos patienter med systemisk amyloidose. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Praksis retningslinjer for nyrebiopsi. Mod Pathol. 2004;17:1555–1563.

20. Walker PD. Nyrebiopsien. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:181-188.

21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. Universal prøveforberedelsesmetode til proteomanalyse. Nat metoder. 2009;6: 359–362.