Den diagnostiske biomarkør for diabetiske nyresygdomme: mikroRNA-ekspression

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

DEL Ⅰ: MikroRNA-ekspressionsprofilering ved diabetisk nyresygdom

HIROKIISHII,SHOHEI KANEKO,KATSUNORI YANAl,AKINORI AOMATSU,KEIJ HIRAl, SUSUMU OOKAWARA & YOSHIYUKI MORISHITA

INTRODUKTION

Forekomsten af ​​diabetisk nyresygdom (DKD) vokser hurtigt på verdensplan og er relateret til betydelige økonomiske og sociale byrder, fordi det er den førende årsag til nyresygdom i slutstadiet og er forbundet med udviklingen af ​​forskellige vaskulære komplikationer¹. For at forbedre prognosen for DKD(diabetisk nyresygdom), dets tidlige diagnose og specifikke behandlingsmidler er påkrævet. Begge er dog ikke etableret.

Den endelige diagnose af DKD (diabetisk nyresygdom) kræver histologisk analyse af nyrebiopsier. Imidlertid er nyrebiopsi invasiv, det er vanskeligt at få diagnostiske prøver, og det er ikke egnet til gentagne procedurer. Derfor er adskillige serum- eller urinmolekyler, såsom kollagen IV, COOH-terminalt propeptid af kollagen VI og tumornekrosefaktorreceptor 1 af 2, blevet vurderet til brug som diagnostiske markører for DKD(diabetisk nyresygdom),^2-4 men ingen er endnu blevet etableret til klinisk brug.^5-7

Vedrørende behandlingen af ​​DKD(diabetisk nyresygdom), har flere lægemidler, såsom renin-angiotensin-systemblokkere, natrium-glucose cotransporter 2-hæmmer og glukagon-lignende peptid-1-analoger, vist sig at have beskyttende virkning i DKD(diabetisk nyresygdom),^8-10 men ingen er ideelle. Der er således et presserende behov for identifikation af diagnostiske biomarkører og terapeutiske midler for DKD(diabetisk nyresygdom).

drage urter cistanche

MikroRNA'er(miRNA'er) har tiltrukket sig opmærksomhed som sygdomsspecifikke biomarkører og terapeutiske mål for forskellige sygdomme, såsom kræft og flere inflammatoriske sygdomme.^11,12miRNA'er(MikroRNA'er) er små, ikke-kodende RNA'er med en længde på ca. 22 nukleotider, der fungerer som post-transkriptionelle regulatorer af målgener og deres afledte proteiner ved at inducere messenger RNAmiR-nedbrydning og/eller translationel repression.^13,14 NAs are thought to be responsible for the regulation of >60 procent af alle proteinekspressionsniveauer og spiller derved en afgørende og forskelligartet rolle i patofysiologiske processer i forskellige sygdomme¹⁵.

Tidligere undersøgelser har vist, at flere miRNA'er(MikroRNA'er)er involveret i patogenesen af ​​DKD(diabetisk nyresygdom), og følgelig kan de repræsentere nyttige biomarkører for eller terapeutiske mål for DKD(diabetisk nyresygdom).^16.17 Men yderligere undersøgelser for at undersøge miRNA'ers regulerende roller(MikroRNA'er)i DKD(diabetisk nyresygdom)er nødvendige, og disse miRNA'er(MikroRNA'er)kan udvikles som diagnostiske biomarkører og terapeutiske midler til DKD(diabetisk nyresygdom). Derfor undersøgte vi i denne undersøgelse miRNA'er(MikroRNA'er)involveret i DKD(diabetisk nyresygdom)og bestemt deres potentiale som specifikke biomarkører eller terapeutiske midler for DKD(diabetisk nyresygdom).

cistanche stamme fordele

MATERIALER OG METODER

Dyremodel.Mus blev anbragt i et rum med kontrolleret temperatur og fugtighed under antivirale og antistoffrie mikroisolatorbetingelser. Db/db hanmus (C57BLKS/J lar - plus Leprdb/ plus Leprdb) og deres normale kuldkammerat m/m mus (C57BLKS/J Iar-m plus /m plus ) blev købt fra Institute for Animal Reproduction (Ibaraki, Japan) . AKITA-hanmus (C57BL/6-Ins2Akita/J-mus) og deres normale kuldkammerater (C57BL/6J) blev opnået fra Japan SLC, Inc. (Tokyo, Japan).

Renal iskæmi og reperfusion blev udført som tidligere beskrevet.¹⁸ Kort fortalt blev C57BL/6J-hanmus (Tokyo Laboratory Animals Science, Tokyo, Japan) bedøvet med isofluran, og den højre nyrepedikel blev identificeret, ligeret, og en højre nefrektomi blev udført. Den venstre renale pedikel blev derefter identificeret og fastspændt med en ikke-traumatisk mikrovaskulær klemme i 45 min. Klemmerne blev fjernet, efter at perioden med iskæmi var afsluttet, og vellykket reperfusion blev bekræftet visuelt. Sham-opererede mus gennemgik den samme kirurgiske procedure uden fastklemning af nyrepedikelen. Dyrene blev aflivet 24 timer efter reperfusion.

Unilateral ureterisk obstruktion blev udført som tidligere rapporteret.¹⁹Kort fortalt blev C57BL/6J-hanmus (Tokyo Laboratory Animals Science) bedøvet ved hjælp af isofluran, og derefter blev venstre urinleder eksponeret gennem et abdominalt midtlinjesnit, fuldstændig ligeret med 4-0 silke på to punkter og sektioneret mellem disse. Den sham-opererede gruppe undergik ikke ligering. Musene blev aflivet, og deres venstre nyrer blev opsamlet 7 dage efter operationen.

Han-ældningsaccelererede mus (SAMP1/YitFcsJ) og kontrolmus (SAMR/YitFcsJ) blev købt fra SLC Japan.²⁰Disse mus blev aflivet i en alder af 48 uger. HIGA-hanmus (HIGA/NscSlc) og BALB/cCrSlc-mus, som blev udvalgt som kontrolstammen på grund af deres lave serum-IgA-koncentrationer, blev opnået fra Japan SLC.

Nyrer og blod blev opsamlet, serum blev opnået, og størstedelen af ​​vævene blev opbevaret i -80 grad. De venstre nyrer blev brugt til histologisk analyse og de højre nyrer blev brugt til mRNA og miRNA(MikroRNA'er)kvantificering. Til biokemiske analyser blev mus overført til individuelle metaboliske bure til indsamling af 24-h urinprøver. Urinalbumin- og kreatininkoncentrationer blev målt ved hjælp af henholdsvis et LBIS Muse Urinary Albumin Assay Kit (S-type) (Fujifilm Wako, Shibayagi, Gunma, Japan) og et Lab-Assay Creatinin Kit (Fujifilm Wako, Osaka, Japan).

Patienter og raske forsøgspersoner.Vi rekrutterede patienter med kronisk nyresygdom, som gennemgik nyrebiopsi på Saitama Jichi Medical University mellem maj 2016 og maj 2019. Femogtyve patienter blev rekrutteret til DKD(diabetisk nyresygdom)gruppe og blev sammenlignet med patienter, der havde andre nyresygdomme end DKD (n=50 patienter; IgA nefropati 17, membranøs nefropati 9, minimal forandring nefrotisk syndrom 6, nefrosklerose 4, interstitiel nefritis 3, IgG4-associeret nefropati 3, lupus nefritis 2 og andre nyresygdomme 6) og blev matchet for deres baseline-karakteristika. Hvert tilfælde blev gennemgået af flere erfarne patologer for at sikre, at biopsiprøverne viste patologiske ændringer, der var passende for sygdomskategorien, og ikke viste signifikante ændringer, der er karakteristiske for andre sygdomme. DKD(diabetisk nyresygdom)blev diagnosticeret ved hjælp af de karakteristiske fund af en stigning i den mesangiale matrix, nodulær glomerulosklerose, diffus glomerulær basalmembranfortykkelse og samtidig hyalinose af afferente og efferente arterioler.²¹ Diabetes mellitus blev diagnosticeret ved hjælp af American Diabetes Association criteeGFR blev estimeret ved hjælp af Diæten i Renal ria.²² Sygdomsmetode (MDRD), modificeret til japansk (ml/min/følger: befolkning, eGFR,as;1x serumkreatinin1,73m²）=0.881×186.3×alder-0.2{{9 }}3×(×0,742 for kvinder).^23,24

Microarray analyse.Analyse af miRNA(MikroRNA'er)ekspression blev udført af Hokkaido System Science (Hokkaido, Japan). Detaljerne i mikroarray-analysen er blevet beskrevet andetsteds.²⁵Kort fortalt blev RNA'et dephosphoryleret og derefter ligeret til Cy3-pCp ved hjælp af et miRNA(MikroRNA'er)Komplet mærkningsreagens og Hyb-kit (Agilent Technologies, CA, USA) og et miRNA(MikroRNA'er)Spike-in Kit (Agilent Technologies). miRNA(MikroRNA'er)Komplet mærkningsreagens og Hyb-kit blev brugt til at hybridisere cRNA'erne. Efter hybridisering blev mikrostrålerne vasket ved hjælp af en Gene Expression Wash Pack (Agilent Technologies) og scannet med en Agilent Microarray Scanner. Signalintensiteter blev evalueret med Agilent Feature Extraction ver.12.0.3.1.mRNA-ekspressionsanalyse blev også udført af Hokkaido System Science. RNA'et blev Cy3-mærket ved hjælp af et Low-Input Quick-Amp Labeling Kit, One-Color (Agilent Technologies). De mærkede cRNA-prøver blev hybridiseret til et muse miRNA(MikroRNA'er)Microarray 8×60K rel.21.0(Agilent Technologies) ved 65 grader i 17 timer ved brug af et genekspressionshybridiseringskit (Agilent Technologies). Efter hybridisering blev mikroarrayerne vasket med komponenter fra Gene Expression Wash Buffers Pack (Agilent Technologies) og scannet med en Agilent Microarray Scanner. Signalintensiteter blev evalueret ved hjælp af Agilent Feature Extraction ver.12.0.3.1. Normalisering blev opnået ved hjælp af 90. percentilforskydningsmetoden, en almindeligt anvendt metode til mikroarray, som tidligere beskrevet.²⁶ The results were analyzed using GeneSpring software v12.1(Agilent Technologies). Statistical analysis was carried out using one-way ANOVA with a post hoc Tukey honestly significant difference test. Fold changes with a cut-off value>4 og en P-værdi<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistically="" significant="" differences.="" the="" genespring="" single="" experiment="" analysis="" (sea)bioinformatics="" tool="" was="" used="" for="" computational="" analysis="" to="" identify="" potential="" curated="" canonical="" pathways="" that="" were="" enriched="" in="" the="" transcript="" list="" showing="" a="" significant="" gene="" expression="" difference="" between="" the="" control="" mice,db/db="" mice,db/db="">(MikroRNA'er)-181b-5p-mimic-PEI-NP'er og db/db-mus plus kontrol-miRNA(MikroRNA'er)-PEI-NPs-grupper ved hjælp af WikiPathways-databasen Forudsagt mål. FmRNA'er af miRNA'er blev søgt ved hjælp af Target Scan-software.

Tabel I.Liste over miRNA'er(MikroRNA'er)differentielt udtrykt i nyrerne af AKITA-mus ved mikroarray-analyse

Kvantitativ revers transkription-PCR i realtid.Detaljerne i de kvantitative real-time reverse transcription-PCR(qRT-PCR) assays til måling af mRNA og miRNA(MikroRNA'er)ekspression i nyrerne hos mus er blevet beskrevet tidligere.²⁷At måle miRNA(MikroRNA'er)ekspression blev nyreprøver homogeniseret under anvendelse af en glashomogenisator og en filtersøjle-shredder (QIA shredder column; Qiagen, Hilden, Tyskland), derefter blev RNA ekstraheret ved hjælp af et miRNeasy Mini Kit (Qiagen). Et mikrogram af hver RNA-prøve blev omvendt transskriberet til cDNA ved anvendelse af miRScript PCR System (Qiagen). qRT-PCR blev derefter udført ved hjælp af et miScript SYBR Green PCR Kit og specifikke primere for miRNA-20a-5p, miRNA-34a-5p,miRNA{{6} }b-5p,miRNA-129-1-3p, miRNA-129b-5p,miRNA-142a-3p,miRNA{{13} }a-5p, miRNA-181b-5p, miRNA-223-3p,miRNA-146a-5p, rmiRNA{{20} }p,miRNA-652-3p,miRNA-342-3p,rmiRNA-6401 og miRNA-6980-5p(miScript Primer Assays; Qiagen), i henhold til producentens instruktioner. Ekspressionsniveauerne blev normaliseret til det for U6-snuRNA og blev beregnet som foldforskelle (2-△ACT) fra de normale kontrolekspressionsniveauer. Ekspressionsniveauerne af U6 var ikke statistisk forskellige mellem alle grupper i denne undersøgelse.

At måle miRNA(MikroRNA'er)niveauer i humant og museserum blev RNA fremstillet ud fra 300 μL prøver af serum ved hjælp af en NucleoSpin miRNA Plasma-søjle (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland) og et miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen). Derefter blev det isolerede RNA revers-transskriberet ved hjælp af et miScript I RT Kit (Qiagen).qRT-PCR blev udført ved hjælp af et miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen).Primere for miRNA-20a-5p ,miRNA-34a-5p,miRNA-125b-5p,miRNA-129-1-3p,

miRNA(MikroRNA'er)-142a-3p,miRNA-1129b-5p,miRNA-142a-5p,miRNA-146a{{ 7}}p,miRNA-181b-5p,miRNA-455-5p,miRNA-342-3p,n miRNA-223-3p, miRNA-652-3 p,miRNA-6401 og miRNA-6980-5p blev købt fra Qiagen. Niveauerne af hvert miRNA blev normaliseret til niveauerne for miRNA-16 som en endogen kontrol. Serumekspressionsniveauerne for miRNA-16a-5p var ikke statistisk forskellige mellem alle grupper i denne undersøgelse.

For at måle mRNA-ekspression blev nyreprøver homogeniseret ved hjælp af en glashomogenisator og en filtersøjle-shredder (QIA-shredder-søjle; Qiagen). RNA blev isoleret ved hjælp af et RNeasy Total RNA Isolation-kit (Qiagen), og 1 ug af hver RNA-prøve blev omvendt transskriberet ved brug af SuperscriptII First Strand synthe-sis-systemet (Life Technologies, MA, USA).qRT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR GreenER qPCR SuperMix (Life Technologies).Primere til musekollagen Type I Alpha 1 Chain, kollagen Type IV Alpha 1 Chain blev købt hos Takara Bio (Shiga, Japan). Ekspressionen af ​​hvert mål-mRNA blev normaliseret til ekspressionen af ​​beta-actin som referencegenet.

Fig 1.Varmekort over de differentielt udtrykte miRNA'er(MikroRNA'er)i nyrerne hos AKITA mus. Varmekortet viser den hierarkiske klyngedannelse og systemiske variationer i ekspressionen af ​​miRNA'er(MikroRNA'er)i nyrer fra mus fra hver gruppe (n=4 pr. gruppe). miRNA'er vist med rødt viste høj ekspression, og dem vist med grønt viste relativt lav ekspression. (Farveversion af fifigure er tilgængelig online.)

Forberedelse af miRNA(MikroRNA'er)-181b-5p mimik.miRNA(MikroRNA'er)-181b-5p og krypteret lille RNA (kontrol-miRNA) blev syntetiseret af Ajinomoto Bio-Pharma Services (Osaka, Japan). Sekvensen af ​​miRNA'et-181b{{5} }p mimic var 5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG-GUU-3' og kontrol-miRNA'et(MikroRNA'er)var 5'-GGUUCGUACGUACACUGUUCA-3'.

Levering af miRNA(MikroRNA'er)-181b-5p-PEI-NP'er til nyrerne.At undersøge virkningerne af miRNA(MikroRNA'er)-181b-5p mimic treat-ment, lineære PEI-baserede NP'er (in vivo jet PEI; Polyplus-transfection, llkirch-grafenstaden, Frankrig) blev brugt som beskrevet tidligere.²⁷Kort sagt, miRNA(MikroRNA'er)-PEI-NPs （miRNA∶ 50 ug, forhold mellem nitrogen （N） i polymeren til fosfat (P) i nukleinsyrerne=6) blev opløst i 200μL 5 procent glucoseopløsning og injiceret i db/db mus via en halevene, i henhold til producentens protokol. Følgende grupper fungerede som kontroller: (1) normale kuldkammerater (m/m), (2) ubehandlede db/db mus og (3) db/db mus injiceret med kontrol-miRNA(MikroRNA'er)-PEI-NP'er, der bruger den samme protokol. At vurdere det terapeutiske potentiale af miRNA-181b-5p for DKD(diabetisk nyresygdom), injicerede vi miRNA-181b-5p-PEI-NP'er eller kontrol-miRNA-PEI-NP'er i 10-ugegamle db/db-mus ugentligt i 10 uger.

Fig 2.Varmekort over de differentielt udtrykte miRNA'er(MikroRNA'er)i nyrerne på db/db mus. Varmekortet viser den hierarkiske klyngedannelse og systemiske variationer i ekspressionen af ​​miRNA'er i nyrerne i hver gruppe (n=4 pr. gruppe). Rødt, højere udtryk; blåt, lavere udtryk. (Farveversion af fifigure er tilgængelig online.)

Histologi,Fluorescens og Immunohistokemi.Efter dissektion af nyrerne blev en repræsentativ del af hver nyre straks fikseret i PBS-pufret 4% paraformaldehyd og indlejret i paraffin. Sektioner (5 μm) blev brugt til immunfarvning og periodisk syre-Schiff (PAS) farvning. Mesangial ekspansion blev evalueret i PAS-farvede sektioner ved at beregne det mesangiale indeks (M) i henhold til Animal Model of Diabetic Com-plications (AMDCC) protokol: areal (antal pixels) af PAS-farvning/samlet areal (antal pixels) af glomeruli. MI blev beregnet for mindst 20 glomeruli pr. gruppe (3-4 glomeruli pr. mus og seks mus dobbeltstrenget e pr. gruppe). Cy3-mærkede oligonukleotider(Cy3-miRNA(MikroRNA'er);Takara Bio) blev brugt til at evaluere nyrefordelingen af ​​intravenøst ​​injiceret miRNA(MikroRNA'er)-PEI-NP'er, som tidligere beskrevet.²⁷Kort, Cy3-miRNA(MikroRNA'er)blev kompleksbundet med PEI-NP'er og intravenøst ​​injiceret i db/db mus, hvorefter nyrerne blev fjernet 1 time senere. Sektioner (5- μm tykke) blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med fluorescein-mærket Lotus tetragonolobus lectin (Vector Laboratories, CA, USA), og DAPI blev brugt som modfarvning. Niveauet af fluorescens blev derefter vurderet ved fluorescensmikroskopi (BZ-X710; Keyence, Osaka, Japan) og BZ-X_analysesoftware (Keyence). Til den immunkemiske undersøgelse, muse mAbs mod kollagen I(NB{{ 10}}, Novus Biologicals, CO, USA) og IV(NB120-6586, Novus Biologicals), og gedepolyklonalt sekundært antistof mod mus og kanin HRP(PI-1000, Vector Laboratories) blev brugt . Vævsprøverne blev indlejret i Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan) og frosset i flydende nitrogen. Kryostatsektioner (5- μm tykke) blev monteret på silanbelagte objektglas (Matsunami Glass Ind, Osaka, Japan).

In situ hybridisering.ISH for miRNA(MikroRNA'er)-125b-5p og miRNA-181b-5p blev udført ved hjælp af dobbelt digoxigenin-mærkede miRCURY LNA-detektionsprober (Qiagen). En forvrænget probe tjente som en negativ kontrol og U6 tjente som en positiv kontrol. Proceduren blev udført i henhold til producentens protokol.²⁸Kort fortalt blev paraffinindlejrede musenyresektioner (5- μm) afparaffineret, vasket i PBS og behandlet med proteinase K i 10 minutter ved 37 grader C. Objektglassene blev derefter inkuberet med en LNA-digoxigenin-mærket probe (40 nM) i et fugtigt kammer natten over ved 60 grader. Efter vask blev sektionerne inkuberet natten over med antidigoxigenin-antistof konjugeret til alkalisk phosphatase ved 4 grader. Derefter blev objektglassene fremkaldt under anvendelse af nitroblåt tetrazoliumchlorid/5-brom{{9 }}chlor-3'-indolyphosphatase ptoluidin-saltopløsning (Life Tech-nologies) natten over i mørke ved stuetemperatur. Der blev taget mikrofotografier under et lysmikroskop (BZ-X710; Keyence).

Tabel II.Liste over miRNA'er(MikroRNA'er)differentielt udtrykt i nyrerne af db/db mus ved mikroarray-analyse

Studiegodkendelse.Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen og blev godkendt af den etiske komité ved Jichi Medical University (godkendelsesnummer 17-023, 11. oktober 2017). Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere. Dyreforsøgene blev godkendt af den dyreetiske komité ved Jichi Medical University og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for brug og pleje af forsøgsdyr fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

Statistikker.Dataene blev analyseret ved hjælp af JMP-software (version 13.0.0; SAS Institute Inc, Cary, NC, USA). Resultaterne er udtrykt som middelværdier ± SD'er. Middelværdierne blev sammenlignet ved hjælp af envejsvariansanalyse, og hvis der var statistisk signifikante forskelle, blev Tukeys test udført post hoc for at sammenligne middelværdierne for to forskellige grupper. For kategoriske variable blev forskelle analyseret ved hjælp af chi-kvadrat-testen. Logistisk regression blev udført, og AUC'er blev beregnet.P<0.05 was="" considered="" to="" represent="" statistical="">

KLIK HER FOR AT DEL Ⅱ & Ⅲ

Forkortelser:BMI= kropsmasseindeks; DAPI=4,6-diamidino-2-phenylindol; FITC= fluorescein-isothiocyanat; DKD=diabetisk nyresygdom; eGFR= estimeret glomerulær fltrationshastighed; HDL high-density lipoprotein; HIGA= højt immunglobulin A; IRI= iskæmi-reperfusionsskade;LDL= lavdensitetslipoprotein; ns= ikke signifikant; PEI-NPs= polyethyleniminnanopartikler;RNU6=U6 Small Nuclear 1; SAMP=ældelsesaccelereret mus; SAMR=kontrol for den alderdomsaccelererede mus; UACR= urin albumin-til-kreatinin-forhold; UUO=unilateral ureteral obstruktion

cistanche plante

Bemærk: Den traditionelle kinesiske lægeurt cistanche (også kendt som "drageurten" og "ørkenginseng"), vokser kun i de tørre og varme ørkener. Som en af ​​de ni udødelige urter indeholder Cistanche (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/ørkenlevende cistanche/cistanche salsa) rige effektive ingredienser såsom echinacosid, acteosid, totale phenylethanoid glycosider, flavonoider, polysaccharider og effektive ingredienser fremstillet af disse cistaner osv. nærende urter og madmateriale til menneskers immunitet, indre organer og hjerneceller og neuroner osv. De moderne farmakologiske undersøgelser har bekræftet følgende virkninger af cistanche (fordele ved cistanche): forbedre immuniteten; forbedre seksuel funktion og nyrefunktion; anti-træthed; anti aldring; forbedre hukommelsen; anti-Parkinsons sygdom; anti-Alzheimers sygdom; antioxidation; let-forstoppelse; anti-inflammatorisk; fremme knoglevækst, blegning af hud; beskytte leveren; etc.

hvad er en cistanche