Konstruktionen af ​​​​rekombinant Lactobacillus Casei-vaccine af PEDV og dens immunrespons i mus

Abstrakt

Baggrund: Porcin epidemisk diarré (PED) er en smitsom tarmsygdom forårsaget af svineepidemi diarrévirus (PEDV) karakteriseret ved opkastning, diarré, anoreksi og dehydrering, som har forårsaget enorme økonomiske tab rundt om i verden. På nuværende tidspunkt er vaccineimmunitet stadig den mest effektive metode til at kontrollere spredningen af ​​PED'er. I denne undersøgelse har vi konstrueret en ny rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS-stamme, der udtrykker PEDVS-proteinet fra PEDV og OMP16-proteinet fra Brucella abortus-stammen. For at kende immunogeniciteten af ​​den rekombinante L. casei-OMP16-PEDVS-kandidatvaccine blev den sammenlignet med BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS og BL21-PEDVS rekombinant protein.

Resultater: Resultaterne viste, at vi kunne påvise højere niveauer af IgG, neutraliserende antistof, IL-4, IL-10 og INF- i serum og IgA i fæces af L. casei-OMP16- PEDVS-immuniserede mus, hvilket indikerede, at L. casei-OMP16-PEDVS-kandidatvaccine kunne inducere højere niveauer af humoral immunitet, cellulær immunitet og slimhindeimmunitet.

Konklusion: Derfor er L. casei-OMP16-PEDVS en lovende kandidatvaccine til profylakse af PEDV-infektion.

Nøgleord: PEDV, Lactobacillus casei-vaccine, PEDV S-protein, OMP16, Immunresponser

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Introduktion

Porcin epidemisk diarré (PED) er forårsaget af den porcine epidemiske diarrévirus (PEDV) med symptomer som diarré, opkastning, anoreksi, dehydrering og vægttab hos smågrise [1, 2]. Grise i alle aldre kan blive smittet med forskellige symptomer, og dødeligheden hos smågrise er op til 100 % [3], hvilket har ført til enorme økonomiske tab over hele verden. For at kontrollere spredningen af ​​PEDV konstrueres de fleste slags vacciner, såsom aluminiumhydroxid-adjuveret inaktiveret vaccine, bivalent inaktivt stemplet Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) og PEDV-vaccine og svækket PEDV-vaccine [4]. Selvom disse vacciner spiller en vigtig rolle i at kontrollere PED'er, har de alle deres defekter. Inaktiverede vacciner kan ikke aktivere cellulære immunresponser, svækket vaccine er ikke særlig sikker, og de kan ikke inducere tilstrækkelig produktion af virusspecifikke IgA-antistoffer af slimhindeimmunresponser. Derfor er det nødvendigt og presserende at udvikle en ny vaccine til at kontrollere PED'er.

Lactobacillus casei anses ofte for at være en slags sikkert vektorsystem til målrettet levering af antigener ved oral immunisering med gavnlige virkninger på menneskers og dyrs sundhed [5]. I mellemtiden kan det bruges som et leveringssystem til at regulere T-hjælpercelleresponset og stimulere udskillelsen af ​​specifikke IgA'er til slimhindeimmunitet [6]. På den anden side er den rekombinante Lactobacillus casei-vaccine lettere at administrere, mindre chance for overfølsomhedsreaktion og er mere omkostningseffektiv sammenlignet med traditionelle vacciner. Baseret på rapporterne er Lactobacillus casei rekombinante vacciner blevet anvendt med succes til forebyggelse og kontrol af humant papillomavirus, Streptococcus pneumoni og Escherichia coli [7-9]. Der er også nogle lignende forsøg på at designe PED-vacciner. Forskerne fandt ud af, at en rekombinant Lactococcus lactis-stamme, der udtrykker et variant af svinepidemi-diarrévirus S1-gen, kunne inducere høje niveauer af IL-4 og IFN- i immuniserede mus [10]. Lactobacillus casei-baseret anti-PEDV-vaccine, der udtrykker mikrofold-cellemålrettet peptid Co1 fusioneret med COE-antigenet fra PEDV, kunne også inducere et effektivt immunrespons [11]. For at forbedre effektiviteten af ​​PEDV-vaccinen. I denne undersøgelse konstruerer vi en ny Lactobacillus casei rekombinant vaccine af PED, som kan stimulere stærkere slimhinde-, humorale og cellulære immunresponser mod PEDV-infektion via oral administration. PEDV, et medlem af coronaviridae-familien, består af fire strukturelle proteiner, som indeholder 150-220 kDa glycosylated spike (S) protein, 20-30 kDa membran (M) protein, 7 kDa kappe (E) protein, 58 kDa nukleocapsid (N) protein [12]. Der kan S-proteinet opdeles i S1 (1-735 aminosyre) og S2 (736-sidste aminosyre) domæner [13], og S1-proteinet inkluderer den receptorbindende region og de vigtigste neutraliserende epitoper [ 14]. Vaccineadjuvans virker som en immunmodulator og kan inducere og forstærke immunresponser mod co-leverede antigener. OMP16-protein fra Brucella abortus-stammen blev verificeret til at aktivere dendritiske celler in vivo, inducere et th1-immunrespons og var en lovende selvadjuverende vaccine [15-17]. Derfor blev OMP16-proteinet indsat i Lacto bacillus case rekombinante vaccine i vores undersøgelse. Indtil videre er der rapporteret få undersøgelser af den rekombinante Lactobacillus casei-vaccine af PEDV. Derfor sigter denne undersøgelse på at konstruere en ny Lactobacillus casei-kandidat oral vaccine, som kan levere bedre humoral immunitet, cellulær immunitet og slimhindeimmunitet for at forhindre spredning af PED.

Kinesisk urt cistanche plante-Antumor

Materialer og metoder

Bakteriestammer, vira, dyrkningsbetingelser, plasmider og primere

Cistanche pulver

De bakteriestammer, plasmider og primere, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i tabel 1. Standardreferencestammen af ​​Lactobacillus casei ATCC 393 blev dyrket i de Man Rogosa og Sharpe (MRS) bouillon ved 37 grader [18]. BL21 (DE3) og DH5 blev dyrket i Luria-Bertani (LB) medium ved 37 grader [19]. De rekombinante Lactobacil lus casei-, BL21- (DE3)- og DH5-stammer blev dyrket i det tilsvarende medium med henholdsvis passende antibiotika. Brucella abortus blev dyrket i Tryptic Soy Broth (TSB) eller Tryptic Soy Agar (TSA) medium (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) ved 37 grader. Vero-cellerne inficeret med PEDV-stammer blev dyrket i DMEM (Gibco, Langley, VA, USA) suppleret med 10 ug/mL trypsin (Gibco, Langley, VA, USA) [20]. pVE5523- og pET28a(+)-plasmiderne var ekspressionsvektorer af henholdsvis Lactobacillus casei og Escherichia coli.

Tabel 1 Karakteristika for bakteriestammer, plasmider og primere anvendt i denne undersøgelse

Konstruktionen af ​​rekombinante Lactobacillus casei og BL21 stammer

De rekombinante ekspressionsplasmider blev konstrueret baseret på plasmiderne og primerne i tabel 1. Først blev den partielle sekvens af PEDV S-genet (493-708 aminosyrer), den partielle sekvens af PEDV S'-genet (493-708 aminosyrer), og den partielle sekvens af Brucella abortus OMP16-genet (26-168 aminosyrer) blev amplificeret under anvendelse af henholdsvis primerpar PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 og OMP16-F/R. Efterfølgende blev overlapsforlængelsemetoden brugt i OMP16 og PEDVS' fragmenter til at konstruere et nyt fragment OMP16-PEDVS med linkerpolypeptid (GGGGSGGGGGGGGGGS) sat fast i midten. Derefter blev fragmenterne PEDVS indsat i pET28a-plasmidet med EcoRI/Xbal-restriktionsenzymer for at generere rekombinant plasmid pET28a-PEDVS, og de nye fragmenter OMP16-PEDVS blev indsat i pET28a- og pVE5523-SalI/XbaI-/EcoV-/XbaI-plasmiderne restriktionsenzymer til at generere henholdsvis rekombinant plasmid pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS. De rekombinante plasmider (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS) blev transformeret til BL21 (DE3) eller Lactobacillus casei ATCC393 ved transformation eller elektroporation det rapporterede papir [21].

Analyse af proteinekspression ved Western blot

Proteinekspressionen af ​​BL21-pET28a-PEDVS-, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS- og L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS-stammer var detekteret baseret på den rapporterede metode med en vis modifikation [21-23]. De rekombinante stammer BL21-pET28a-PEDVS og BL21-pET28a OMP16-PEDVS blev dyrket i LB bouillon, og IPTG blev brugt til at høste til pET28a-PEDVS og pET28a-OMP{{22} } PEDVS-proteiner. Blankvektoren blev anvendt som en negativ kontrol. Efter cellelyse og centrifugering blev supernatanten og sedimentet opsamlet. Derefter blev målproteinerne oprenset ved hjælp af nikkelaffinitetskromatografisøjlen baseret på den tidligere undersøgelse [24]. I mellemtiden blev den kulturelle supernatant af den rekombinante L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS-stamme også høstet ved centrifugering ved 9000 xg i 10 minutter ved 4 grader. Hvorefter prøverne med natriumdodecylsulfat (SDS)-belastningsbuffer blev kogt i 10 minutter. Proteinerne blev adskilt ved 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter overført til PVDF-membraner (Millipore, Mississauga, ON, Canada). Membraner blev blokeret med 5 % skummetmælk i 2 timer ved 37 grader og derefter inkuberet med murint monoklonalt antistof af S-protein natten over ved 4 grader og HRP-konjugeret gede-anti-muse-IgG (ABclonal, Wuhan, Kina) i 2 timer kl. 37 grader. Proteinbåndene blev visualiseret ved brug af Clarity™ Western ECL Blotting Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Immunisering og prøvetagning

Immunogeniciteten af ​​rekombinant Lactobacillus casei-vaccine blev evalueret ved brug af seks uger gamle hunspecifikke patogenfrie (SPF) BALB/c-mus [10, 18], som blev købt fra Shandong Agricultural Universitys dyrecenter. I alt 50 mus blev tilfældigt opdelt i 5 grupper med 10 mus i hver gruppe. Musene blev immuniseret med henholdsvis rekombinant Lactobacillus casei-vaccine og oprenset protein (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freunds komplette adjuvans). Immuniseringsprotokollen blev udført baseret på tabel 2, og en boosterimmunisering blev givet efter 13 dage. Til den serologiske undersøgelse blev serum opsamlet 0, 14 og 28 dage efter immunisering (dpi) via halevenestansning og opbevaret ved -20 grader indtil brug. Afføring blev opsamlet 1 dag før vaccination og hver boostningstid. Til IgA-detektion blev fæces fortyndet (vægt/volumen) med 0,05 M natrium EDTA i forhold 1:4 lige efter opsamling og inkuberet i 14 timer ved 4 grader efter korrekt blanding. Supernatanten blev opsamlet ved 12,000×g centrifugering og opbevaret ved -20 grader indtil brug. Ved 28. dpi; tre mus fra hver gruppe blev aflivet, og tarmen blev behandlet til IgA-detektion ifølge forfatteren beskrevet tidligere [10, 18, 23].

Bestemmelsesanalyse af antistofniveauer

Niveauerne af IgG i sera og IgA i fæces blev målt ved hjælp af ELISA-metoderne med nogle modifikationer [18, 23]. Metoderne var som følger: Polystyren-mikrotiterplader blev coatet natten over ved 4 grader med 100 μL 10 ug/mL PEDVS-protein, OMP16-PEDVS-protein eller 100 μL rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS-stamme . Efter blokering med 5 % skummetmælk blev de indsamlede prøver seriefortyndet i PBS, tilsat i tre eksemplarer og inkuberet ved 37 grader i 1 time. Derefter blev et HRP-konjugeret gede-anti-muse-IgG- eller IgA-antistof (Invi trogen, USA) tilsat til hver brønd (1:5000) og inkuberet i 1 time ved 37 grader. Polystyren-mikrotiterpladerne blev vasket 5 gange under hvert trin. Til sidst blev 100 μL TMB-substrat (tetramethylbenzidin og H2O2) tilsat til hver brønd, og 50 μL stopopløsning blev tilsat efter 10 minutter. OD-værdierne ved 630 nm blev målt ved hjælp af en multimode pladelæser (EnVision).

Virusneutraliseringsassays

De neutraliserende antistoftitre af PEDV i sera blev undersøgt i overensstemmelse med metoderne med nogle modifikationer [25, 26]. Kort fortalt blev det murine serum varmeinaktiveret (56 grader i 30 minutter) og derefter serielt to gange fortyndet i plader med 96 brønde (Corning, USA) med tre eksemplarer af hver prøve. Derefter blev et lige så stort volumen på 200 TCID50/50 μL PEDV-stammer tilsat til plader med 96 brønde og inkuberet i 1 time ved 37 grader. Blandingen blev tilsat til nye 96 brønds plader coatet med Vero celle monolag og inkuberet i 1 time ved 37 grader. Celler blev derefter vasket og inkuberet i vedligeholdelsesmediet ved 37 grader i 5% CO2. Efter 2 dage blev den cytopatiske effekt (CPE) observeret ved hjælp af et omvendt mikroskop, og den neutrale størrelseskoncentration blev defineret som den laveste koncentration af antistoffer i serumet.

Tabel 2 Immunprotokollen for BALB/c-mus

Cytokin påvisning

For at påvise sekretion af cytokiner blev supernatanter opnået fra laboratoriemusene (0, 14 og 28 dage). Niveauer af udskilt IL-4, IL-10 og IFN- blev bestemt ved hjælp af kommercielle ELISA-kits (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) i henhold til henholdsvis producentens anbefalinger. Cytokin blev kvantificeret fra de forskellige standardkurver fremstillet ud fra standardreagenser leveret af henholdsvis kittene, og optisk densitet (OD) værdi blev detekteret ved 450 nm fra hver plade ved hjælp af en multimode pladelæser (EnVision) [23, 27].

Statistisk analyse

Alle data blev opnået fra mindst tre uafhængige eksperimenter, og resultaterne blev præsenteret som middel ± standardafvigelse (SD). Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af to-halede t-tests og envejsanalyse i Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., USA). Den signifikante forskel blev defineret som ∗ p < 0.05, og de forskellige grader af signifikant forskel blev betegnet som ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ og p < 0,001, hhv.

Resultater

Verifikation af rekombinante Lactobacillus casei og BL21 stammer

For at verificere de konstruerede rekombinante plasmider blev de rekombinante ekspressionsplasmider pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS fordøjet under anvendelse af NcoI/XhoI restriktionsenzymer, og enzymfordøjelsesresultater blev vist i fig. 1. Størrelserne af målbånd i elektroforetogrammer var de samme som de forventede resultater, og sekventeringsresultater indikerede, at de rekombinante ekspressionsplasmider ikke udviste nogen mutation. Disse resultater indikerede den vellykkede konstruktion af pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS rekombinante plasmider. Resultaterne af western blot viste, at de rekombinante proteiner pET28a-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS blev udtrykt i supernatanten af ​​BL21-pET28a OMP16-PEDVS og BL21- pET28a-PEDVS-stammer, hhv. pVE5523-OMP16-PEDVS-proteinet blev også verificeret i den kulturelle supernatant af L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS-stammen. De specifikke bånd fra fig. 2 viste, at de rekombinante proteiner pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS alle blev høstet med succes (fig. 2).

Fig. 1 Enzymfordøjelsesresultaterne af rekombinante plasmider. A: Enzymfordøjelsesresultaterne af pVE5523-OMP16-PEDVS-plasmidet. M: D8000 DNA-stigemarkør; 1: pVE5523-OMP16-PEDVS-plasmid. B: Enzymfordøjelsesresultaterne af pet28a-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS plasmid. M: D8000 DNA-stigemarkør; 1: pet28a-OMP16-PEDVS-plasmid; 2: pET28a-PEDVS-plasmid

IgG-antistofniveauerne i serum fra mus immuniseret med kandidatvacciner

For at evaluere den specifikke immunogenicitet af genererede vaccinekandidater blev BALB/c-mus udvalgt og opdelt i 5 grupper. Derefter blev niveauerne af IgG i serum og IgA i fæces målt med kommercielle ELISA-kits. Resultaterne afslørede, at der ikke var nogen væsentlige forskelle i IgG-niveauer blandt de vaccinerede grupper, og næsten intet IgG-antistof blev fundet i alle mus før immunisering. Der blev dog efterfølgende fundet væsentlige forskelle efter den første vaccination, og IgG-antistofniveauer i serum efter 28 dage var højere end efter 14 dage. Blandt 5 gruppemus viste musene immuniseret med L. casei-OMP16- PEDVS og BL21-OMP16-PEDVS-F lignende og højeste immunogenicitet. Derfor kunne L. casei-OMP16- PEDVS og BL21-OMP16-PEDVS-F producere den højeste immunogenicitet efterfulgt af BL21-OMP16- PEDVS og BL21-PEDVS (fig. 3).

cistanche supplement fordele-øge immunitet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

IgA-antistofniveauerne i fæces fra mus immuniseret med kandidatvacciner

For at evaluere den specifikke immunogenicitet af genererede vaccinekandidater blev niveauerne af IgA-antistoffer i fæces fra mus også evalueret. Resultaterne viste, at der ikke eksisterede noget særligt anti-PEDVS IgA-antistof før immunisering. Store mængder af IgA-antistof i fæces af L. casei-OMP16-PEDVS-immuniserede mus BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS og BL21-PEDVS gruppemus 14 dage efter immunisering. 28 dage efter immunisering nåede IgA-antistofniveauerne af L. casei-OMP16-PEDVS-immuniserede mus deres højeste maksimum. I mellemtiden udviste IgA-antistofniveauerne i de tre andre grupper ikke en tydelig stigning. Derfor kunne kandidatvaccinen L. casei OMP16-PEDVS stimulere højere niveauer af antistof i immuniserede mus sammenlignet med BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}}PEDVS- og BL21- PEDVS-immuniserede mus (fig. 4).

Fig. 2 Verifikationen af ​​rekombinante ekspressionsproteiner. M: proteinmarkør; 1: den sekretoriske proteinform rekombinant L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS-stamme; 2: det oprensede protein fra BL21- pET28a-OMP16-PEDVS-stamme; 3: det oprensede protein fra BL21-pET28a-PEDVS-stammen

De neutraliserende antistofniveauer af serum i immuniserede mus

For at evaluere den beskyttende virkning af kandidatvacciner af L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS , og BL21-PEDVS i mus, blev de neutraliserende antistofniveauer målt. Resultater viste, at intet neutraliserende antistof blev påvist før immunisering. Neutraliserende antistof blev påvist 14 dage efter immunisering, og det steg 14 dage efter booster-immunisering. Antistofreaktionen hos mus, der modtog L. casei-OMP16-PEDVS, havde en stærkere anti-PEDV-neutraliserende aktivitet end hos mus, der blev administreret oralt med BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS. Derfor kunne kandidatvaccinen L. casei OMP16-PEDVS stimulere det højeste neutraliserende antistofniveau efterfulgt af BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS og BL21-PEDVS (fig. 5).

Cytokin niveauer

For at sammenligne det cellulære immunresponsniveau for L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, og BL21-PEDVS immuniserede mus, henholdsvis IL- 4, IL-10 og IFN- blev bestemt. Resultaterne viste, at niveauerne af cytokinerne IL-4, IL-10 og IFN- i sera fra mus alle var meget lave og havde ingen signifikant forskel før immunisering. Hvorimod lignende ændringer blev observeret i resultaterne af IL-4, IL-10 og IFN-. 14 dage efter immunisering var niveauet af IL-4, IL-10 og IFN- i L. casei-OMP16-PEDVS im immuniserede mus højere end BL21- OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS immuniserede mus. 14 dage efter boosterimmuniseringen blev der påvist et højere IL-4-, IL-10- og IFN-niveau i L. casei-OMP16- PEDVS-immuniserede mus sammenlignet med det i andre tre grupper. Derfor kunne kandidatvaccinen L. casei-OMP16-PEDVS stimulere de højeste IL-4-, IL-10- og IFN-niveauer efterfulgt af BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS (fig. 6).

Fig. 3 IgG-antistofniveauerne af kandidatvacciner i serum fra immuniserede mus. Serum blev opsamlet på dagene 0, 14 og 28 dage før eller efter immunisering undersøgt via kommercielle ELISA-kits og målt ved en absorbans på 450 nm. Søjler repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse af tre uafhængige eksperimenter. * p < 0.05, ** p < 0,01 og **** p < 0,0001 repræsenterer henholdsvis stigende grader af signifikante forskelle, og ns betyder ingen signifikant forskel

Diskussion

Et storstilet udbrud af PED forårsaget af PEDV-varianter fandt sted i oktober 2010, hvilket har resulteret i enorme økonomiske tab i Kina og hele verden [1]. Traditionelle vacciner er dog alle designet baseret på den klassiske CV777-stamme, som ikke kan give tilstrækkelig beskyttelse til PEDV-varianten [4]. For at kontrollere spredningen af ​​PEDV og reducere økonomiske tab er der også designet nye vacciner af PEDV variantstammer. På nuværende tidspunkt er den PEDV-inaktiverede vaccine og svækkede vaccine af PEDV-variantstammer alle godkendt af den kinesiske regering, og der er alle lovende udsigter til at kontrollere PED. Men defekter findes også i de to slags nye vacciner. PEDV inficerer svin gennem fordøjelseskanalen og har tarmvævstropisme. Derfor er slimhindeimmunitet mere effektiv end systemisk immunitet til at forhindre PEDV-indtrængen i tarmepitelceller, og vacciner skal yde slimhindebeskyttelse effektivt i tarmkanalen. Så i denne undersøgelse konstruerer vi en ny slags vaccine, der kan stimulere stærkere anti-PEDV-specifikke IgG- og IgA-antistoffer. Lactobacillus casei har potentielle immunmodulerende egenskaber som en vaccineleveringsvehikel, og ekspressionen af ​​bioaktive forbindelser på cellevæggen af ​​denne bakterie kan stimulere passende immunresponser [28, 29]. Det bruges i vid udstrækning til at udtrykke adskillige heterol ogøse antigener af humant papillomavirus, Streptococcus pneumoni og Escherichia coli som vacciner i dyremodeller, som alle viste fremragende immunogenicitet [7-9]. Sammenlignet med den inaktiverede vaccine og svækkede vaccine kan Lactobacillus casei vektorvaccinen også stimulere højere IgA-niveauer og cellulært immunrespons. Undersøgelser har vist, at IgA's første forsvarslinje i tarmen ville være bedre end IgG til at beskytte pattegrise mod PEDV-infektion [10, 30]. Derfor er det lovende at udvikle en slags Lactobacillus casei vektorvaccine af PED. Baseret på rapporterne kan S-proteinet af PEDV opdeles i S1- (1-735 aminosyre) og S2 (736-sidste aminosyre) domæner [13], og S1-protein inkluderer den receptorbindende region og vigtigste neutraliserende epitoper [14]. Den kerneneutraliserende epitop (COE) kan inducere stærke neutraliserende antistoffer mod PEDV [31, 32]. Kombineret med antigenicitetsanalysen blev en delvis sekvens af S1-genet (1477-2124 bp) udvalgt til at konstruere det rekombinante plasmid. Det selekterede lille fragment viste sig ikke kun at have god immungenicitet, men også bidrage til den udskilte ekspression af Lactobacillus casei. På den anden side fandt Pasquevich, at Brucella abortus ydre membranprotein 16 kunne aktivere dendritiske celler in vivo, inducerer et th1-immunrespons og var en lovende selvadjuverende vaccine mod systemisk og oral erhvervet brucellose [15]. Lignende forskning, hvor ulipideret ydre membranprotein omp16 fra Brucella spp. da en nasal adjuvans kunne inducere et th1-immunrespons og modulere det th2-allergiske respons på komælksproteiner, blev det også bevist [16]. Derfor blev en delvis sekvens af omp16-genet valgt til at konstruere rekombinant plasmid for at forbedre immunfunktionen i vores undersøgelse. For at vide, om den nye Lactobacillus casei anbefalede vaccine kunne inducere humorale immunresponser, blev IgG-, IgA- og neutraliserende antistofniveauer målt. IgG-antistofniveauet af L. casei-OMP16- PEDVS rekombinant vaccine immuniserede mus havde ingen signifikant forskel med BL21-OMP16-PEDVS-F rekombinant vaccine immuniserede mus. Imidlertid var niveauerne af IgA og neutraliserende antistof højere end i BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S og BL{{47 }}PEDVS rekombinante vaccine-imiserede mus. Resultaterne viste, at L. casei-OMP16-PEDVS kunne inducere stærkere humorale immunresponser, især IgA-antistofniveauer. Undersøgelser har vist, at IgA er den første forsvarslinje i tarmen og ville være bedre end IgG til at beskytte pattegrise mod PEDV-infektion [30]. Forskningen bekræftede også resultatet, at L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant vaccine kunne give bedre immunologisk beskyttelse til PEDV. For at udforske typen af ​​immunrespons induceret af rekombinant L. casei-OMP16-PEDVS blev niveauerne af IL-4, IL-10 og IFN- detekteret for at evaluere aktiviteten af ​​T lymfocytter. Baseret på rapporten, spiller IFN- en vigtig rolle i det cellulære immunrespons forårsaget, når patogener invaderer kroppen, IL-4 spiller en vigtig rolle i det humorale immunrespons og fremmer immuntolerance og slimhindeimmunitet [33], IL -10 spiller en væsentlig rolle i kampen mod mikrobiel slimhindeinfektion og opretholdelse af slimhindebarrierens integritet i tarmen [34]. I mellemtiden viste resultater af cytokindetektion, at musene immuniseret med L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant vaccine kunne inducere stærkere ekspression af IL-4, IL-10 og IFN-, hvilket understøttede resultaterne af, at L. casei-OMP16-PEDVS rekombinant vaccine kunne inducere henholdsvis stærkere humoral immunrespons, IgA-antistofniveau og cellulært immunrespons.

Fig. 5 De neutraliserende antistofniveauer af kandidatvacciner i serum fra immuniserede mus. Serum blev opsamlet på dagene 0, 14 og 28 dage før eller efter immunisering og undersøgt via neutralisationstest. Søjler repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse af tre uafhængige eksperimenter. * p < 0.05, ** p < 0.01 og **** p < 0,0001 repræsenterer henholdsvis stigende grader af signifikante forskelle, og ns betyder ingen signifikant forskel forskel

Fig. 6 Påvisning af cytokinniveauer fra serum fra immuniserede mus. Serum blev opsamlet på dagene 0, 14 og 28 dage før eller efter immunisering og undersøgt via kommercielle ELISA-kits. Absorbansværdien blev målt ved en absorbans på 450 nm for henholdsvis IL-4 (a), IL-10 (b) og IFN- (c). Søjler repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse af tre uafhængige eksperimenter. * p < {{10}},05, ** p < 0,01 og **** p < 0,0001 repræsenterer henholdsvis stigende grader af signifikante forskelle

Konklusion

Sammenfattende, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL{{7 }}PEDVS-kandidatvacciner blev konstrueret i denne undersøgelse. I mellemtiden blev det humorale immunrespons og cellulære immunresponsniveauer af disse kandidatvacciner i mus evalueret. Resultaterne viste, at musene immuniseret med L. casei-OMP16-PEDVS kunne producere højere niveauer af IgG, IgA, neutraliserende antistof, IL-4, IL- 10 og INF- sammenlignet med musene immuniseret med BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS. Derfor kan den rekombinante L. casei OMP16-PEDVS-kandidatvaccine danne grundlag for udviklingen af ​​en sikker, effektiv og bekvem rekombinant slimhindevaccine til profylakse af PEDV-infektion.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Referencer

1. Wang D, Fang L, S X. Porcin epidemisk diarré i Kina. Virus Res. 2016; 226:7-13.

2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, et al. En immunhistokemisk undersøgelse af epidemisk diarré hos svin. J Comp Pathol. 1995;113(1):59-67.

3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. Udbruddet af svinepidemi-diarré hos pattegrise, Kina. Emerg Infect Dis. 2012; 18(1):161-3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. Udvikling af en bi-kombineret svækket vaccine mod overførbart gastroenteritisvirus og svinepidemi-diarrévirus. Chin J Prev Vet Med. 1999;21(6):35-9.

5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. Lactobacillus potentiale som bærer for oral immunisering: udvikling og foreløbig karakterisering af vektorsystemer til målrettet levering af antigener. J Biotechnol. 1996;44(1-3):183.

6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Bioteknologi: De immunmodulerende virkninger af mælkesyrebakterier til forbedring af immunfunktioner og fordele. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, et al. Oral immunisering med en Lactobacillus casei-vaccine, der udtrykker humant papillomavirus (HPV) type 16 E7, er en effektiv strategi til at inducere slimhinde-cytotoksiske lymfocytter mod HPV16 E7. Vaccine. 2010;28(16):2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM, et al. Nasal immunisering af mus med Lactobacillus casei, der udtrykker Pneumokok-overfladeprotein A: induktion af antistoffer, komplementaflejring og delvis beskyttelse mod Streptococcus pneumoniae-udfordring. Mikrober inficerer. 2008;10(5):481-8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK, et al. Immunisering med rekombinante Lactobacillus casei-stammer, der producerer K99- og K88-fimbrialprotein, beskytter mus mod enterotoksigen Escherichia coli. Vaccine. 2012;30(22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, et al. Konstruktion af en rekombinant lactococcus lactis-stamme, der udtrykker et variant af svinepidemi-diarrévirus S1-gen og dets immunogenicitetsanalyse i mus. Viral Immunol. 2019;32(3):144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. Oral immunisering med en Lactobacillus casei-baseret anti-porcin epidemisk diarrévirus (PEDV)-vaccine, der udtrykker mikrofold-cellemålrettet peptid Co1 fusioneret med COE-antigenet fra PEDV. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. Sekvensanalyse af det porcine epidemiske diarrévirusgenom mellem nukleocapsid- og spikeproteingenerne afslører en polymorf ORF. Virologi. 1994;198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Heterogenitet i spidsproteingener af svinepidemi-diarrévirus isoleret i Korea. Virus Res. 2010;149(2): 175–82.

14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, et al. Spike-proteinregionen (aa 636789) af den porcine epidemiske diarrévirus er afgørende for induktionen af ​​neutraliserende antistoffer. Acta Virol. 2007;51(3):149-56.

15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, et al. Proteindelen af ​​Brucella abortus ydre membranprotein 16 er et nyt bakteriepatogen-associeret molekylært mønster, der aktiverer dendritiske celler in vivo, inducerer et Th1-immunrespons og er en lovende selvadjuvanserende vaccine mod systemisk og oral erhvervet brucellose. J Immunol. 2010;184(9):5200.

16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, et al. Ulikvideret ydre membranprotein Omp16 (U-Omp16) fra Brucella spp. da nasal adjuvans inducerer et Th1-immunrespons og modulerer det Th2-allergiske respons på komælksproteiner. PLoS One. 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, et al. Immunitet: Immunisering med rekombinant Brucella art ydre membranprotein Omp16 eller Omp19 i adjuvans inducerer specifikke CD4+ og CD8+ T-celler samt systemisk og oral beskyttelse mod Brucella abortus infektion. Inficer Immun. 2009;77(1):436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, et al. Oral rekombinant Lactobacillus-vaccine rettet mod intestinale mikrofoldceller og dendritiske celler til levering af den kerneneutraliserende epitop af svinepidemi-diarrévirus. Mikrobcellefabrikker. 2018;17(1):20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. Heterolog ekspression og biokemisk karakterisering af assimilerende nitrat- og nitritreduktase afslører tilpasning og potentiale af Bacillus megaterium NCT-2 i sekundær salineringsjord. Int J Biol Macromol. 2017;101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, et al. Caerin1.1 undertrykker væksten af ​​porcin epidemisk diarrévirus in vitro via direkte binding til virussen. Virus. 2018;10:9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Bioteknologi: karakterisering af pMC11, et plasmid med dobbelt replikationsorigin isoleret fra Lactobacillus casei MCJ og konstruktion af shuttle-vektorer med hvert replikon. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, et al. Oral levering af probiotika, der udtrykker dendritisk cellemålrettet peptid fusioneret med porcin epidemisk diarrévirus COE-antigen: En lovende vaccinestrategi mod PEDV. Virus. 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, et al. Konstruktionen af ​​rekombinant Lactobacillus casei, der udtrykker BVDV E2-protein og dets immunrespons i mus. J Biotechnol. 2018;270:51-60.

24. Noi NV, Chung YCJB, Udstyr B. Optimering af ekspression og oprensning af rekombinant S1-domæne af porcin epidemisk diarrévirus spike (PEDV-S1) protein i Escherichia coli. Bioteknologi Bioteknol Udstyr. 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, et al. Cellevedhæftningsdomæner af porcin epidemisk diarrévirus spike-protein er nøglemål for neutraliserende antistoffer. J Virol. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, et al. Oral administration af coatede PEDV-ladede mikrosfærer fremkaldte PEDV-specifik immunitet hos fravænnede smågrise. Vaccine. 2019;09(014):161–6.

27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Virkninger af porcin epidemisk diarrévirus på porcine monocyt-afledte dendritiske celler og intestinale dendritiske celler. Dyrlæge Microbiol. 2016;106:149-58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Immunmodulerende og antiinflammatorisk aktivitet induceret ved oral administration af en probiotisk stamme af lactobacillus casei. Betændelse. 2006;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. Beskyttelse mod stivkrampetoksin efter intragastrisk administration af to rekombinante mælkesyrebakterier: indvirkning af stammens levedygtighed og in vivo persistens. Vaccine. 2002;20(27-28):3304-9.

30. Song DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, et al. Oral effekt af Vero-celle-svækket svineepidemi-diarrévirus DR13-stamme. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, et al. S1-domæne af porcin epidemisk diarrévirus spike protein som et vaccineantigen. Virol J. 2016;13:1.

32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, et al. Celler: Identifikation af epitopområdet, der er i stand til at inducere neutraliserende antistoffer mod svinepidemi-diarrévirus. Mol Cell. 2002;14(2): 295-9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, et al. Differentielle bidrag fra B7-1 og B7-2 til udviklingen af ​​murin eksperimentel allergisk conjunctivitis. Immunol Lett. 2007;108(1):62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, et al. IL-22 undertrykker infektionen af ​​porcine enteriske coronavirusser og rotavirus ved at aktivere STAT3-signalvejen. Antivir Res. 2017;142:68–75.