Salmonella Enterica Serovars i fravær af TtrA- og PduA-gener forbedrer celleimmunresponset under kyllingeinfektioner

Salmonella spp. er en af ​​de største fødevarebårne patogener, der er ansvarlige for at forårsage økonomiske tab for fjerkræindustrien og også have konsekvenser for folkesundheden. Både patogenets overlevelsesevne i tarmmiljøet under inflammation såvel som deres forhold til værtens immunsystem spiller en nøglerolle under infektioner hos fjerkræ. Formålet med denne undersøgelse var at kvantificere tilstedeværelsen af ​​makrofager og CD4+ /CD8+ cellepopulationer ved hjælp af immunhistokemi-teknikken i kommercielle slægter af kyllinger eksperimentelt inficeret med vildtype- og mutantstammer af Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium mangler ttrA- og pduA-gener. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA udløste en højere procentdel af det farvede område end vildtypen, med undtagelse af lette æglæggende høner. Salmonella Typhimurium vildtype-stamme og Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA-infektioner fører til et lignende mønster, hvor ved 1 og 14 dpi viste tonsiller og ileum hos fugle et mere ekspressivt farvet område sammenlignet med 3 og 7 dpi. I alle undersøgte slægter blev der observeret fremtrædende infiltration af makrofager i sammenligning med CD4+- og CD8+-celler. Samlet set udviste dyr inficeret med mutantstammen et positivt farvet område højere end vildtypen. Sletninger i både ttrA- og pduA-gener resulterede i en mere intens infiltration af makrofager og CD4+- og CD8+-celler i værtsfuglene, hvilket tyder på ingen patogen-dæmpning, selv i forskellige Salmonella-stammer.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Salmonella enterica er et fødevarebåren patogen, der fremkalder tab for husdyr samt direkte indvirkning på folkesundheden. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) og Typhimurium (Salmonella Typhimurium) har hovedsageligt været forbundet med fødevareinfektioner i årtier. Mellem 1995 og 2010 blev Salmonella Enteritidis identificeret i 34,2 % af alle prøver positive for Salmonella spp1. Udover det publicerede Winter et al.2 en omfattende undersøgelse, der undersøgte den tetrathionat-kodende genrolle, idet de valgte serotypen Salmonella Typhimurium, men brugte mus som en eksperimentel model. Med dette i betragtning kan uddybning af vores viden om vært-patogen-interaktion hjælpe med at forbedre kontrol- og udryddelsesmålinger. Adskillige faktorer er involveret i salmonellose-patogenesen, såsom patogenets evne til at replikere i et betændt slimmiljø, afhængigt af næringsstofoptagelse og anaerob respiration2. Tilgængeligheden af ​​næringsstoffer garanterer dog ikke bakteriel overlevelse i et konkurrencepræget miljø tæt befolket af andre mikroorganismer. Salmonella entericas evne til at metabolisere tetrathionat ved at anvende tetrathionatreduktase til at producere 1,2-propandiol som energikilde giver således en fitnessfordel. Dette enzym består af TtrA, TtrB og TtrC. Den første citerede underenhed tilhører molybdopterin (MPT)-superfamilien og har et FeS-grænsende domæne, der er involveret i reduktionen af ​​tetrathionat til thiosulfat (S2O3 2-)2-4. Te 1,2-propandiol bruges af bakterielle mikrokompartmenter (MCP). Denne struktur består af syv forskellige proteiner, blandt hvilke PduA er hovedkomponenten i MCP-strukturen5. For det første omdannes 1,2-propandiol til propionaldehyd, som igen reduceres til propanol og propionat ved propandioldehydrataseaktivitet. Denne proces genererer ATP ved phosphorylering, en elektron (1-propanol) gradient til NAD-regenerering og et mellemled (propionyl-CoA), der kan bruges som kulstof og energikilde i hele methylcitrat via, idet den er afhængig af syntetiseret B12-vitamin på en endogen måde6. Under kyllingeinfektioner efterfølges Salmonella enterica serovars evne til at invadere og overleve i tarmepitelcellerne og makrofagerne af immunresponsunddragelse7. I den sammenhæng er infektionen en kritisk fase, der afhænger af interaktionen mellem bakterie- og værtsceller og bakteriens evne til at overvinde tarmepitelbarriererne for at garantere dens kolonisering og replikation. Ikke desto mindre aktiverer det de inflammatoriske og immunresponser8, der fører til endocytose og fagocytose af henholdsvis epitelceller og antigenpræsenterende celler (APC'er). Den antimikrobielle aktivitet af disse celler udløser en medfødt respons via makrofager, og den adaptive immunresponssamling er afhængig af CD4+- og CD8+-aktivering9. For at kaste lys over vært-patogen-interaktionerne bag tarminfektionen af ​​Salmonella hos kyllinger, evaluerer vi populationen af ​​immunsystemceller under tarmkolonisering og systemisk infektion i fugle af kommercielle slægter udfordret af vildtype mutantstammer af Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium , der bærer deletioner i gener relateret til metaboliseringen af ​​tetrathionat (ttrA) og 1,2-propandiol (PDU).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Resultater

Eksperiment 1—Salmonella Enteritidis udfordring.

Resultaterne af kvantificering af tilstedeværelsen af ​​immunresponscellerne i caecal tonsiller, caecum, ileum og lever fra slagtekyllinger, lette æglæggende høner og halvtunge æglæggende høner er vist i tabel 1, 2 og 3. Vi fandt flere CD'er 4+ og makrofagcelleinfiltration fra slagtekyllinger udfordret med Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA) end fra slagtekyllinger udfordret med Salmonella Enteritidis vildtype-stamme (wt-SE) eller ikke-inficerede fugle i alle evaluerede væv. En undtagelse blev fundet for CD4+ celleinfiltration ved 3 dpi i caecal tonsiller, ileum og lever, og for makrofaginfiltration ved 3 og 14 dpi i leveren fra SEΔttrAΔpduA udfordrede slagtekyllinger. Desuden blev antallet af infiltrerede CD8+-celler observeret i en større mængde fra fugle udsat for SEΔttrAΔpduA ved 1 og 7 dpi i blindtarmen og leveren, ved 3 dpi i caecal-mandlerne og 14 dpi i ileum. I modsætning hertil havde wt-SE-udfordrede fugle høj infiltration af CD8+-celler i ileum og caecal tonsiller ved henholdsvis 1 og 7 dpi (Tab. 1; Supplerende Fig. S1). Tabel 2 og Supplerende Fig. S2 viser CD4+ og CD8+ og makrofaginfiltration fundet i væv fra halvtunge æglæggende høner. Generelt var der stor variation mellem områderne af celleinfiltrater vedrørende både udfordringsstammen og de undersøgte væv. Fugle udfordret med SEΔttrAΔpduA viste højere områder dækket af CD4+-celler (i ileum ved 1 og 14 dpi og lever ved 7 dpi) og makrofager (i ileum ved 7 dpi og lever ved 3, 7 og 14 dpi), end i det samme væv af wt-SE-udfordrede fugle. På den anden side blev CD8+-celler fundet i større mængder i caecal-mandler (ved 1 og 7 dpi) og blindtarm (ved 3 dpi) hos fugle, der var udsat for wt-SE-stamme. Forskelligt observeret hos slagtekyllinger og halvtunge æglæggende kyllinger, udløste Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA et mindre intenst immunrespons celleområder end vildtypen i udfordringen fra lette æglæggende høner. Wt-SE-udfordrede fugle viste større CD4+ infiltrationsområder i caecal mandler (ved 1 og 3 dpi), caecum (ved 3, 7 og 14 dpi), ileum (ved 1 og 7 dpi) og lever (ved 14 dpi). Tilsvarende har udfordringer med SEΔttrAΔpduA resulteret i reducerede infiltrationsområder af både CD8+ i caecal mandler (ved 1 dpi) og ileum (ved 7 og 14 dpi), og makrofager i caecal tonsiller og caecum (ved 3 dpi), i sammenligning med wt-SE-udfordrede fugle. Der blev ikke observeret nogen signifikante ændringer af immunsystemets cellers område af CD8+ og makrofagceller i leveren fra både SEΔttrAΔpduA og wt-SE-udfordrede fugle. De detaljerede resultater af udfordringen med lette æglæggende høner er vist i tabel 3 (se Supplerende Fig. S3).

Tabel 1. Repræsentation af den signifikante forskel relateret til den kvantitative fordeling af forskellige immunresponsceller i organer fra slagtekyllinger inficeret med Salmonella Enteritidis vilde og mutante stammer på forskellige dage efter infektion. DPI, dage efter infektion; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis vildtype; ns, ingen væsentlig forskel. Inden for hvert organ og DPI betyder * forskel ved to-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis sammenligningstest mellem værdier af vilde og mutante stammer (*P Mindre end eller lig med 0.05; **P Mindre end eller lig med 0.01; ***P Mindre end eller lig med 0,001; ****P Mindre end eller lig med 0,0001). Den stamme, der er vist i tabellen (∆-SE eller wt-SE) som signifikant inden for organet og DPI, er den, der er vist det største infltrationsområde for hver celle.

Tabel 2. Repræsentation af den signifikante forskel relateret til den kvantitative fordeling af forskellige immunresponsceller i organer fra semi-tunge æglæggende høner inficeret med Salmonella Enteritidis vilde og mutante stammer på forskellige dage efter infektion. DPI, dage efter infektion; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis vildtype; ns, ingen væsentlig forskel. Inden for hvert organ og DPI betyder * forskel ved to-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis sammenligningstest mellem værdier for vilde og mutante stammer (*P Mindre end eller lig med 0.{{10}}5 ; **P Mindre end eller lig med 0.01; ***P Mindre end eller lig med 0,001; ****P Mindre end eller lig med 0,0001). Den stamme, der er vist i tabellen (∆-SE eller wt-SE) som signifikant inden for organet og DPI, er den, der er vist det største infltrationsområde for hver celle.

Tabel 3. Repræsentation af den signifikante forskel relateret til den kvantitative fordeling af forskellige immunresponsceller i organer fra lysæglæggende høner inficeret med Salmonella Enteritidis vilde og mutante stammer på forskellige dage efter infektion. DPI, dage efter infektion; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis vildtype; ns, ingen væsentlig forskel. Inden for hvert organ og DPI betyder * forskel ved tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis sammenligningstest mellem værdier for vilde og mutante stammer (*P Mindre end eller lig med 0.{{10}}5 ; **P Mindre end eller lig med 0.01; ***P Mindre end eller lig med 0,001; ****P Mindre end eller lig med 0,0001). Stammen præsenteret i tabellen (∆-SE eller wt-SE) som signifikant inden for organet og DPI er, der viser det største infiltrationsområde til hver celle.

cistanche planteforøgende immunsystem

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Eksperiment 2—Salmonella Typhimurium-udfordring.

Resultaterne af kvantificering af tilstedeværelsen af ​​immunresponscellerne i cecal tonsiller, caecum, ileum og lever fra slagtekyllinger, halvtunge æglæggende høner og lette æglæggende høner er vist i henholdsvis tabel 4, 5 og 6. Samlet set udviste slagtekyllinger inficeret med mutantstammen et positivt markant område, der var højere end dem, der var udsat for Salmonella Typhimurium-vildtype-stamme (wt-STM) på alle fire prøveudtagningsdage. Desuden blev der ikke observeret nogen ændringer af immunresponsceller i de uinficerede kontrolgrupper. CD4+-celleområderne i alle væv fra slagtekyllinger nåede en statistisk forskel ved 1 dpi, med større infiltrationer for udfordringen med Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). En signifikant forskel mellem arealet af det kvantificerede immunrespons fra STM∆ttrA∆pduA- og wt-STM-udfordrede fugle havde været, med større infiltrationer, når udfordringen var med mutantstammen i blindtarmen og ileum ved 1 dpi og lever ved 14 dpi (CD8+ celler); i blindtarmen, ileum og leveren ved 1 og 14 dpi (makrofager) (tabel 4; Supplerende Fig. S4). Resultaterne fra halvtunge æglæggende fugle viste ingen statistisk forskel mellem mutant- og vildtype-stammeudfordringer for CD4+-celler i blindtarmen og CD8+-celler i caecal-mandler og ileum i alle 4 dage efter infektioner evalueret (tabel 5; Supplerende Fig. S5). Når der imidlertid blev observeret et signifikant koncentrationsområde af immunsystemceller, blev de halvtunge æglæggende høns udfordret af STM∆ttrA∆pduA: større makrofagers infiltrationsområde i alle undersøgte væv (ved 1 og 14 dpi); et større infiltrationsområde af CD4+-celler i caecal-mandlerne og leveren (ved 1, 7 og 14 dpi) (tabel 5; Supplerende Fig. S5). Tabel 6 og Supplerende Fig. S6 viser CD4+, CD8+ og makrofaginfiltration fundet i væv fra lette æglæggende høner. Fugle udfordret med STM∆ttrA∆pduA viste store immunsystemcellers område af CD4+ og makrofagceller i caecal tonsiller og caecum (ved 14 dpi) og ileum (ved 1 og 14 dpi) i sammenligning med immunresponsceller område af det samme væv fra wt-STM-udfordrede fugle. Der var ikke fundet nogen statistisk forskel for CD8+-infiltrationsområdet i caecal tonsiller, caecum og ileum fra udfordrede fugle. I modsætning til resultater opnået i andre væv havde leveren fra STM∆ttrA∆pduA-udfordrede fugle et mere udtryksfuldt farvet område af immunresponsceller for CD4+- og CD8+-celler ved alle fire dpi, og makrofager ved 1 og 14 dpi.

Tabel 4. Repræsentation af den signifikante forskel relateret til den kvantitative fordeling af forskellige immunresponsceller i organer fra slagtekyllinger inficeret med Salmonella Typhimurium vilde og mutante stammer på forskellige dage efter infektion. DPI, dage efter infektion; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium vildtype; ns, ingen væsentlig forskel. Inden for hvert organ og DPI betyder * forskel ved to-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis sammenligningstest mellem værdier af vilde og mutante stammer (*P Mindre end eller lig med 0.05; **P Mindre end eller lig med 0.01; ***P Mindre end eller lig med 0,001; ****P Mindre end eller lig med 0,0001). Den stamme, der er vist i tabellen (∆-STM eller wt-STM) som signifikant inden for organet og DPI, er den, der er vist hovedinfltationsområdet for hver celle.

Tabel 5. Repræsentation af den signifikante forskel relateret til den kvantitative fordeling af forskellige immunresponsceller i organer fra halvtunge æglæggende høner inficeret med Salmonella Typhimurium vilde og mutante stammer på forskellige dage efter infektion. DPI, dage efter infektion; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium vildtype; ns, ingen væsentlig forskel. Inden for hvert organ og DPI betyder * forskel ved to-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis sammenligningstest mellem værdier for vilde og mutante stammer (*P Mindre end eller lig med 0.{{10}}5 ; **P Mindre end eller lig med 0.01; ***P Mindre end eller lig med 0,001; ****P Mindre end eller lig med 0,0001). Den stamme, der er vist i tabellen (∆-STM eller wt-STM) som signifikant inden for organet og DPI, er den, der er vist hovedinfltationsområdet for hver celle.

Tabel 6. Repræsentation af den signifikante forskel relateret til den kvantitative fordeling af forskellige immunresponsceller i organer fra lysæglæggende høner inficeret med Salmonella Typhimurium vilde og mutante stammer på forskellige dage efter infektion. DPI, dage efter infektion; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium vildtype; ns, ingen væsentlig forskel. Inden for hvert organ og DPI betyder * forskel ved tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis sammenligningstest mellem værdier for vilde og mutante stammer (*P Mindre end eller lig med 0.{{10}}5 ; **P Mindre end eller lig med 0.01; ***P Mindre end eller lig med 0,001; ****P Mindre end eller lig med 0,0001). Stammen præsenteret i tabellen (∆-STM eller wt-STM) som signifikant inden for organet og DPI, der viser det største infiltrationsområde for hver celle.

Diskussion

Bakterier kan, når de udsættes for anaerobe forhold, bruge tetrathionat og 1,{1}}propandiol metaboliske substrater til energi- og respirationskilder10. Salmonella spp. har længe været genstand for undersøgelser af, hvordan deletion af gener, der vides at være ansvarlige for disse veje, ville påvirke deres overlevelse i værten. Så vidt vi ved, blev kun én undersøgelse, der undersøgte tetrathionat- og propandiol-kodende genroller, offentliggjort. Vores forskningsgruppe rapporterede virkningerne af disse deletioner ved at evaluere systemisk infektion og fækal udskillelse af Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium i kommercielle slægter af kyllinger11. For at øge diskussionen om dette emne fremhævede de nuværende resultater den immuncelle, der er infiltreret i forskellige væv fra kyllingelinjer, der er udfordret med både vildtype- og mutantstammer, der bærer deletioner i ttrA- og pduA-gener. I løbet af 2-ugens eksperimentet følger de positivt farvede områder af CD4+ og CD8+ celler og makrofager for det meste et lignende mønster, hvor ved 1 og 14 dpi præsenterer et højere antal immunrespons celler. Dette kan forklares med den primære kontakt af værtsforsvarssystemet, når patogenet invaderer. Den tidligere rapport har vist, at hos inficerede kyllinger, selv når Salmonella ikke udskilles ved 12 dpi, kan infektionen blive positiv ved kloak-podning fra 13 dpi12, hvilket forklarer, hvorfor immunsystemets celleområder ved 3 og 7 dpi var lavere, men tilbage til en stigning . Ved første øjekast ville det forventes, at værtens fremkaldte respons ville blive reduceret, når både pduA og ttrA blev slettet, da disse gener spiller en vigtig rolle i overlevelsen under infektion med Salmonella2,4,13-15. Vores resultater, der sammenlignede en dobbeltmutant, der mangler begge gener, viste imidlertid det modsatte, mutantstammerne af Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium udløste højere immunresponsceller end de vilde typer af stammer.

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

Et kortest farvet område kan føre til et højt antal kolonier i tarmkanalen, hvilket bekræfter en tidligere undersøgelse, hvor Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA og Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA stammer blev genfundet i højere antal fra kloakale svaber end deres vildtype-korrelerede podninger . Salmonella kan opføre sig som en ekstracellulær eller en intracellulær bakterie, afhængigt af det tilgængelige næringsrepertoire, og sker som et skifte mellem tarmkolonisering og internalisering i værtsceller16. Når bakterierne indtages og dræbes af makrofager, overføres nogle peptidfragmenter til overfladen af ​​den antigenpræsenterende celle, som kodes af det store histokompatibilitetskompleks (MHC), klasse II. Denne peptid-MHC II-binding stimulerer T CD4+-lymfocytterne. Men hvis bakterierne beslutter sig for at invadere værtscellen og trænge ind i makrofagens cytoplasma, stimulerer peptidforbindelsen med en anden type MHC, klasse I, T CD8+ lymfocytproduktion17. Interessant nok præsenterer CD4+- og CD8+-celler det samme mønster af makrofagerne gennem hele eksperimentet, endda repræsenterende forskellige immunresponser. Da CD4+- og CD8+-celler hovedsageligt repræsenterer T-lymfocytter, som er en del af det adaptive immunrespons, er makrofagerne en del af det medfødte immunrespons9. Ud over dette observerede vi, at slagtekyllinger præsenterer mere udtryksfulde positive markerede områder end æglæggende høner, bekræftet af en tidligere undersøgelse, hvor slagtekyllinger udfordret med mutantstammer viste for eksempel mere invasiv tarmkolonisering og systemisk infektion11. Vores resultater tyder på, at immunhistokemi-tilgangen giver interessant information om opførsel af immunresponsceller på flere organer af forskellige kommercielle afstamninger under infektion med Salmonella enterica serovars. Desuden beviser den nuværende undersøgelse, at sletning af begge gener, selv i forskellige stammer af Salmonella, resulterede i bakterier, der fremkaldte en højere immunresponscelle i værten, hvilket viser, at patogenet ikke er blevet svækket. Vi kan overveje, at Salmonella måske var i stand til at finde en anden overlevelsesmekanisme, der blev endnu mere patogen. Anvendelsen af ​​ttr- og pdu-operoner i samklang med cob- og PRP-operoner er i den tidligere undersøgelse blevet vist som nødvendig for anaerob respiration16, hvilket får os til at tro, at det ikke kun er nødvendigt for at slette flere gener fra hver operon18, men vi har også at overveje at slette hele dette sæt, for at nå færre patogene stammer af Salmonella enterica.

Materialer og metoder

Eksperimenterne, udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler, blev godkendt af den etiske komité for brug af dyr ved Sao Paulo State University (CEUA/Unesp Process—006621/18; den 10. maj 2018), blev udført i Avian Pathology Laboratorium ved Institut for Patologi, Teriogenologi og One Health fra School of Agricultural and Veterinary Sciences, Sao Paulo State University (FCAV/Unesp), Jaboticabal, Brasilien.

Bakteriestammer og mutantkonstruktion.

De her anvendte bakteriestammer blev opbevaret i et kryobeskyttende medium sammensat af Lysogeny bouillon (LB; BD DifcoTM, USA) suppleret med 30 % glycerol (Merck, BR—H30402394 228) og opbevaring i en ultrafryser (- 80 grader) på Avian Pathology Laboratory fra FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (adgangsnummer: AM933172) og Salmonella Typhimurium str. 9819 blev induceret til nalidixinsyre- og spectinomycin-resistens (Nalr Spcr), og de gav den genetiske baggrund for at konstruere mutantstammer ved Lambda-rød teknik20 med mindre modifikationer, beskrevet i Saraiva et al.11. Mutante bakterier, der er konstrueret her, identificeres på teksten som SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) og STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

In vivo eksperiment.

Eksperiment 1—Salmonella Enteritidis. Seksogtredive 1-dagegamle kyllinger fra hver af tre forskellige slægter (slagtekyllinger, halvtunge æglæggende høner og lette æglæggende høner), i alt et hundrede og otte dyr, blev opnået fra kommercielle rugerier. Ved ankomsten blev bunden af ​​transportkortkasserne undersøgt for at bekræfte fuglenes Salmonella-fri status21, og dyrene blev anbragt i metalliske bure inde i det akklimatiserede rum og modtog antibiotikafrit foder og vand ad libitum. Et 24-h lysprogram blev valgt den første dag for at sikre optimal vand- og madindtagelse, derefter blev et 12-h lysprogram indført i den første uge, faldende til 8 timer på de resterende dage. Podestoffet blev fremstillet ifølge Berchieri Junior et al.22. Til dette blev de frosne kulturer inokuleret i LB og inkuberet natten over ved 37 grader under 15 0 rpm. Den følgende dag blev bakteriekulturerne overført til friske medier og inkuberet i 18 timer under de samme betingelser som tidligere. Derefter blev 0,2 ml fra kulturerne indeholdende 108 kolonidannende enheder pr. ml (CFU/ml) oralt podet med metallisk sonde direkte ind i fuglenes afgrøde. Ni grupper blev dannet (A til I) og tilfældigt opdelt i overensstemmelse med de forskellige afstamninger og stammer (tabel 7). En-, tre-, syv- og 14-dage efter infektion (dpi) blev tre fugle pr. gruppe hver dag, om morgenen, aflivet ved cervikal dislokation for at høste det mediale afsnit af caecal tonsiller, caecum, og ileum og det distale afsnit af venstre leverlap til yderligere immunhistokemi (IHC) analyse. Til dette blev prøver nedsænket i n-Hexane pa (n-Hexano pa, Synth, Brasilien) tidligere nedkølet i flydende nitrogen. Umiddelbart efter vævsfrysningen blev det overført til et 2 ml kryorør (Corning, USA) og konditioneret i flydende nitrogen. Efter prøveudtagning blev vævene opbevaret ved -80 grader indtil processen for IHC.

Eksperiment 2—Salmonella Typhimurium. Dette eksperiment blev udført ved at følge de samme karakteristika som nævnt ovenfor i eksperiment 1. Seksogtredive kyllinger (1 dag gamle) blev tilfældigt opdelt i ni grupper (A til I) baseret på deres afstamninger og stammer (tabel 7).

Tabel 7. Etablerede grupper efter de forskellige slægter og stammer. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis vildtype; wt-STM, Salmonella Typhimurium vildtype; NC, negativ kontrol.

Immunhistokemi.

Vævssektion. De indsamlede prøver blev overført fra -80 grader til kryostat (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Tyskland) ved -22 grader, hvor de blev individuelt blokeret i OCT-forbindelse (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Holland) pr. 30 minutter før til 6 µm snit ved hjælp af lavprofils engangsklinger (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Tyskland). Det er bemærkelsesværdigt, at sektioner blev udført ved -22 grader, undtagen leversektioner, som blev udført ved -15 grader. Objektglas indeholdende tre gentagelser af sektioneringen af ​​hvert organ pr. immuncellerespons markeret blev fremstillet med udtynding mellem hver gentagelse. Ved hjælp af en pensel blev vævssnitsnittene anbragt på histologiske objektglas forbehandlet med poly-l-lysin (Sigma-Aldrich, Storbritannien, Kat. nr. P4832) og silan (Sigma-Aldrich, USA. Kat. nr. 440574). Objektglassene blev opbevaret ved -20 grader derefter indtil IHC-farvning. Farvning af immunceller. For det første blev objektglassene nedsænket i 200 ml nedkølet acetone (Acetone PA-ACS, Synth, Brasilien) og inkuberet ved -20 grader i 10 minutter. Derefter blev objektglassene overført til et fugtighedskammer (EasyPath®, Brasilien) ved stuetemperatur i 5 minutter for at tørre prøverne. Objektglassene blev derefter vasket med PBS, og en pyt blev efterladt i 5 minutter for at undgå vævsdehydrering. Ti blev væv nedsænket i 200 ml 4% H2O2 pr. 10 min på et mørkt sted og vasket igen med PBS. Området omkring vævssektionerne blev tørret med absorberende papir, og prøven blev forbigået af en hydrofob pen (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Danmark). Vasketrinnet, der forlod en vandpyt, blev gentaget som tidligere. Det biotinfrie kit Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection—Micropolymer (Abcam©, USA) blev brugt til at farve immuncellerne ved at vælge Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC) metoden. Til dette blev vandpytten fjernet, og ikke-specifikke baggrundsfarveblokkerreagensdråber blev tilsat til vævene. Objektglassene blev holdt inde i fugtkammeret på et mørkt sted i 30 minutter, vasketrinnet blev gentaget, og 200 µL primært antistof (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Muse Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, USA) fortyndet i en andel på 1:200 (v/v) i antistoffortyndingsreagenset (Antibody diluent, Abcam©, USA) blev derefter tilsat. Objektglassene blev inkuberet ved 4 grader i 18 timer. Den følgende dag blev objektglassene vasket som tidligere. Ti dråber af det sekundære antistof (Reveal Complement, Abcam©, USA) blev tilsat efter fjernelse af overskydende PBS, og fugtighedskammeret blev anbragt i et mørkt miljø i 30 minutter. Efterfølgende blev en dråbe 3,3'-diaminobenzidin (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) fortyndet i 1 mL substrat (DAB Substrate, Abcam©, USA), hvilket volumen er nok til tre objektglas, og tilsat til vævssnittene. Et minut senere blev objektglassene nedsænket i 200 ml dH2O i 5 min. Derefter blev de overført til en plastikterning indeholdende Harris hæmatoxylin (Êxodo Científca, Brasilien) og blev efterladt i 1 min. Bagpå blev objektglassene vasket i 10 minutter under rindende vand ved lavt tryk. Objektglassene blev underkastet alkohol-xylen-serien (70 % alkohol, 90 % alkohol, 100 % alkohol, xylen I og xylen II). Til sidst blev dækglasset placeret på objektglassene efter tilsætning af en dråbe vandfrit monteringsmedium (Entellan®, Merck, Brasilien). Billeder fra vævssektionerne blev taget tilfældigt ved at vælge fem tilfældige synsfelter ved hjælp af et optisk mikroskop (linse 400×) (Coleman®, model N-120) med en digitalkameraadapter til yderligere statistisk analyse (fig. 1) ).

Dataanalyse.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Procentdelen af ​​CD{0}}- og CD8+-celler og makrofager blev beregnet ved hjælp af Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA). De blev kvantificeret som procentværdier af immuncellemarkørens positive areal/totalt areal. Statistisk analyse og grafik blev udført ved hjælp af softwaren GraphPad Prism v.8.0.1 til macOS (GraphPad Sofware, La Jolla California, USA), og data blev indsendt til Variance Analysis (ANOVA) efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligninger, i betragtning af et signifikansniveau lavere end 5 % (P Mindre end eller lig med 0,05).

Figur 1. Udsnit af blindtarmen på slagtekyllinger inficeret med Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA, der viser immunreaktioner i makrofager, 7 dage efter infektion (×400; Avidin-Biotin Streptavidin Peroxidase, modfarvet med hæmatoxylin).

Referencer

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Kilder til human ikke-tyfus salmonellose: En gennemgang. Braz. J. Poult. Sci. 12(1), 1-11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Winter, SE et al. Tarmbetændelse giver en respiratorisk elektronacceptor for Salmonella. Nature 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Specificitet af respiratoriske veje involveret i reduktionen af ​​svovlforbindelser af Salmonella enterica. Microbiology (Reading) 148, 3631-3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. et al. Tarmbetændelse gør det muligt for Salmonella at bruge ethanolamin til at konkurrere med mikrobiotaen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 17480-17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Regulering af fucose og 1,2-propandioludnyttelse af Salmonella enterica serovar Typhimurium. Foran. Microbiol. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Propionatkatabolisme i Salmonella Typhimurium LT2: To divergent transskriberede enheder omfatter prp-locuset ved 8,5 centisomer, prpR koder for et medlem af sigma-54-familien af ​​aktivatorer og prpBCDE-generne udgør en operon. J. Bacteriol. 179, 928-940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.928-940.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR Sammenligning af 3 dyrkningsmetoder og PCR-assays til påvisning af Salmonella Gallinarum og Salmonella Pullorum i fjerkræfoder. Poult. Sci. 92, 1505-1515. https://doi.org/10.3382/ps.2012-02926 (2013).

8. Van Immerseel, F. et al. Dynamik af immuncelleinfiltration i caecal lamina propria hos kyllinger efter neonatal infektion med en Salmonella Enteritidis-stamme. Dev. Comp. Immunol. 26, 355-364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia do sistema immune. I Doenças das Aves (red AndreattiFilho, RL et al.) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR Det alternative elektronacceptor tetrathionat understøtter B12-afhængig anaerob vækst af Salmonella enterica serovar Typhimurium på ethanolamin eller 1,{{4} }propandiol. J. Bacteriol. 183, 2463-2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.2463-2475.2001 (2001).

11. Saraiva, M. et al. Dechifrering af ttrA- og pduA-geners rolle for Salmonella enterica serovars i en kyllingeinfektionsmodel. Avian Pathol. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL Krydsreaktive cellulære og humorale immunresponser på Salmonella enterica serovars Typhimurium og Enteritidis er forbundet med beskyttelse mod heterolog genudfordring. Dyrlæge. Immunol. Immunopathol. 114, 84-93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ En betagende bedrift: For at konkurrere med tarmmikrobiotaen driver Salmonella sin vært til at give en respiratorisk elektronacceptor. Tarmmikrober 2, 58-60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI et al. Salmonella bruger energitaxier til at drage fordel af tarmbetændelse. PLoS Pathog. 9, e1003267. https:// doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Dynamiske interaktioner mellem Salmonella og mikrobiotaen inden for den udfordrende niche i mave-tarmkanalen. Int. Sch. Res. Ikke. 2014, 1-23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Enzym IIANtr regulerer Salmonella-invasion via 1,2-propandiol og propionatkatabolisme. Sci. Rep. 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Værtsforsvar mod bakterielle patogener: Forsvar af væv og blod. I Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (red. Salyers, AA & Whitt, DD) 16-29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. et al. Salmonella Heidelberg side-step gentab af respiratoriske krav i en kyllingeinfektionsmodel. Mikrob patog. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Reduktion i fækal udskillelse af Salmonella Typhimurium-stamme F98 hos kyllinger, der er vaccineret med liv og dræbte S. Typhimurium-organismer. Epidemiol. Inficere. 104, 413-426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Et-trins inaktivering af kromosomale gener i Escherichia coli K-12 ved hjælp af PCR-produkter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. undersøgelse i transportkasse af daggamle fugle. Braz. J. Microbiol. 31, 230-232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Observationer om persistens og vertikal transmission af Salmonella enterica serovars Pullorum og Gallinarum hos kyllinger: Effekt af bakteriel og værtsgenetisk baggrund. Avian Pathol. 30, 221-231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).