Circadian Clock regulerer rytmisk erythropoietin-ekspression i den murine nyre

For flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk et al

Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at fåprodukter og cistancher

Generering af døgnrytmer er celleautonom og er afhængig af en transkriptions-/translationsfeedbacksløjfe styret af en familie af døgnrytme-ur-transskriptionsfaktoraktivatorer, herunder CLOCK, BMAL1 og repressorer såsom CRY1 og CRY2. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge både den molekylære mekanisme og den hæmopoietiske implikation af circadian erythropoietin-ekspression. Mutante mus med homozygot deletion af de centrale cirkadiske clock-gener kryptokrome 1 og 2 (Cry-null) blev brugt til at belyse cirkadisk erythropoietinregulering. Vildtype kontrolmus udviste en signifikant forskel inyreerythropoietin-mRNA-ekspression mellem døgntiden 06 og 18. Parallelt hermed er et signifikant højere antal af erythropoietin-producerende celler inyre(byRNAscope ) og signifikant højere niveauer af cirkulerende erythropoietin-protein (ved ELISA) blev detekteret cirkadisk tid 18. Sådanne ændringer blev ophævet i Cry-null-mus og var uafhængige af iltspænding, iltmætning eller ekspression af hypoxi-inducerbar faktor 2alpha, hvilket indikerer at cirkadisk erythropoietin-ekspression er transkriptionelt reguleret af CRY1 og CRY2. Reportergen-assays viste, at CLOCK/BMAL1-heterodimeren aktiverer et E-box-element i 5'-erythropoietin-promotoren. RNAscope in situ hybridisering bekræftede tilstedeværelsen af ​​Bmal1 i erythropoietin-producerende celler inyre. I Cry-null-mus blev der fundet et signifikant reduceret antal retikulocytter, mens erytrocyttal og hæmatokrit var uændret. Således døgnrytmeregulering af erythropoietin i den normoksiske voksne murinenyreer transkriptionelt styret af master circadian aktivatorer CLOCK/BMAL1 og repressorer CRY1/CRY2. Dette fund kan have betydning fornyrefysiologiog sygdom, laboratoriediagnostik og anæmiterapi.

SØGEORD:kronobiologi; døgnrytme; ur; kryptokrom; erythropoietin; hæmatopoiesis; hypoxi-inducerbar faktor

Translationel erklæring Molekylære ure i næsten alle celletyper driver gentranskription i samarbejde med vævsspecifikke faktorer. Hidtil har døgnrytmeoscillatoriske mekanismer inyreer ikke blevet forbundet med biologien af ​​erythropoietin (Epo). Heri er det blevet belyst, at circadian Epo-ekspression reguleres af master clock-proteiner (kryptokrom 1 og 2, Clock og Bmal1). Da EPO virker karakteristisk inden for det komplekse regulatoriske netværk af erythropoiesis, optimal brug af rekombinant humant Epo hos patienter mednyreinsufficiens kan omfatte dets anvendelse lige før dets fysiologiske cirkadiske maksimum omkring midnat.

Døgnrytmer i nefrologi er stort set uudforskede, men yderst relevante, fordi deres forstyrrelse af skifteholdsarbejde, livsstilsvalg og alderdom er forbundet med en øget risiko for forskellige sygdomme, herunder hjerte-kar-lidelser.^1–4Dyremodeller af forstyrrede circadian ure giver det første bevis på den negative indvirkning af circadian dysregulering på det hæmatopoietiske system (f.eks. ved øget antal ældre erytrocytter).^5,6

Med hensyn til erythropoiesis er ikke kun cellulære virkninger, men også rytmiciteten af ​​dets primære regulator, erythropoietin (Epo), af særlig interesse, fordi atleter gentagne gange er blevet beskyldt for bloddoping med rekombinant human Epo (who) på grund af tidsafhængige forskelle i cirkulerende Epo-koncentrationer og hæmatologiske parametre.7,8 Daglige variationer i humant serum Epo (S-Epo)-niveauer blev første gang beskrevet i 1981 hos patienter med kronisk lunge- og kularbejders luftvejssygdom,⁹og efterfølgende hos raske forsøgspersoner.^10,11Til dato har flere rapporter angivet høje S-Epo-niveauer om natten (kl. 20.00 til 04.00) og lave S-Epo-niveauer tidligt om morgenen (kl. 04.00 til 8.00). Fasen og amplituden af ​​S-Epo-oscillationer, hvis de overhovedet er til stede, er variable mellem menneskelige individer.^9,10,12,13I gennemsnit ændrede S-Epo-niveauer sig ca. 1.5-fold i forhold til deres minimum.^14–22Denne døgnrytme viste sig at være upåvirket af aldring,20 træning,16 eller højdeeksponering.17 I modsætning hertil er den daglige oscillation af S-Epo afskaffet hos patienter med kronisk obstruktiv lungesygdom kompliceret af dagtimerne hypoxæmi, i myelom med nyresvigt og i myelodysplasi.^15,21,23

I 2009 beskrev vi cirkadisk Epo-mRNA-ekspression i den murine nyre i en storstilet analyse af promotorerne af ur-kontrollerede gener, men var ude af stand til at identificere hverken et særskilt genetisk element i EPO-genet eller en transaktiverende faktor, der er ansvarlig for døgnsvingninger. 24 For nylig foreslog en rottemodel for hæmoragisk shock ifølge parallelle ekspressionsmønstre, at clock-generne (Bmal1 og Per2) var involveret i reguleringen af ​​EPO-sekretion under hypoxi/iskæmi.²⁵

Generering af døgnrytmer er celleautonome og er afhængige af en transkriptions-translationsfeedback-sløjfe styret af en familie af døgnrytme-transskriptionsfaktorer, herunder CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 og CRY2.26 CLOCK/BMAL1-heterodimeren aktiverer transkriptionen af cirkadiske clock-gener PER1/2 og CRY1/2 via binding til E-bokselementer i deres promotorer. PER- og CRY-proteiner giver dog negativ feedback ved at hæmme CLOCK/BMAL1-aktivitet og derved reducere deres eget udtryk. Nettoresultaterne fører til oscillationsmønstrene for døgngenekspression og rytmiske ændringer i cellulær og organfysiologi.²⁷

For at forstå implikationerne af det biologiske ur er forskellige typer mutante mus med forstyrrede eller ablerede single-core clock transkriptionsfaktorer blevet undersøgt hidtil.28,29 Heri udnyttede vi Cry1–/–/Cry2–/– dobbelt mutant mus (Cry-null), som mangler evnen til at udtrykke endogene døgnrytmer.^26,30Kombinerede in vivo- og in vitro-data viser, at Cry1/2 regulerer døgnrytmen Epo-ekspression via CLOCK/BMAL1-induceret transkription i den normoxiske nyre.

METODER

Dyreforsøg

Homozygote Cry1–/– /Cry2–/– dyr (Cry-null; han og hun; C57BL/6J-baserede)31 og vildtype (WT) kontroller blev opdrættet (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) og opdrættet i 5 til 7 måneder. WT-musene kom fra opdrættet af Cry-null-kolonien.

Cry-null genotypen blev bekræftet ved polymerasekædereaktion (Supplerende tabel S1). Til inddrivelse blev mus holdt i gruppe og fik mad og vand ad libitum i en 12-time:12-time lys/mørke cyklus i 14 dage. På dag 2 efter frigivelse i konstant mørke, blev dyrene aflivet ved cirkadisk tid (CT) 06 eller 18 (n ¼ 13-15 for hver gruppe og tidspunkt). Væv (lever og nyre) blev hurtigt opnået og lynfrosset i flydende nitrogen. En undergruppe af han- og hundyr WT- og Cry-null-dyr blev analyseret i detaljer for kropsvægt og differentielt hæmogram.

Til blodgasanalyse blev dyr bedøvet (fentanyl, {{0}},075 mg/kg, midazolam, 1,5 mg/kg og medetomidin, 0,75 mg/kg), trakeotomiseret, intuberet og ventileret (tidal). volumen, 9 ml/kg, respirationshastighed, 160 min- 1, positivt endeekspiratorisk tryk, 2 cm H2O), som beskrevet.32 Et polyethylenkateter blev kirurgisk indført i venstre halspulsåre. Efter 5 minutters stabilisering blev eksperimentet afsluttet ved hurtig afblødning via carotiskateteret, blodgasser blev analyseret (ABL-800; Radiometer; temperaturkontrolleret), og nyrerne blev skåret ud til post hoc analyser.

Alle procedurer blev godkendt af den lokale dyreplejekomité (T0307/08; G0100/17 med et tillæg fra januar 2021) og udført i overensstemmelse med retningslinjerne og reglerne i den tyske dyrebeskyttelseslov.

Udarbejdelse af RNA og kvantitativ polymerasekædereaktionsanalyse

Total RNA blev ekstraheret som beskrevet.33 I alt 1000 ng total RNA blev revers transskriberet med SuperScript III revers transkriptase (Thermo Fisher; nr. 18080085) og tilfældige hexamerer (Thermo Fisher; nr. SO142) i henhold til producentens instruktioner. Kvantitative polymerasekædereaktioner blev kørt på en StepOnePlus cycler (Life Technologies) med intronspændende primere eller TaqMan-assays (Supplerende tabel S2). Absolut mRNA-kvantificering blev opnået ved sammenligning med en standardkurve fra serielle fortyndinger af polymerasekædereaktionsskabelon.

Påvisning af Epo-mRNA-ekspression i nyre-byRNAscope-teknik

RNAscope-assay blev udført i henhold til producentens protokoller (ACD; teknisk note 320536). De 10- mm midterste nyre-tværgående kryosektioner blev farvet med en C1-probe mod DapB (negativ kontrol; ACD; nr. 310043) eller Epo (ACD; nr. 315501). Hybridiseringstrin ved hjælp af Amp 4-6 og detektion af de røde signaler blev udeladt. To uafhængige, blindede forskere talte Epo-positive celler ved 200 original forstørrelse på 3 til 8 kryosnit pr. dyr ved et Axioplan 2 billeddannelsessystem (Zeiss).

Repræsentative Epo-kvantificeringsbilleder og dobbelt fluorescerende farvning blev udført ved hjælp af RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 Kit (ACD; nr. 323110) i henhold til producentens protokoller. De 1,5- mm midterste nyre-tværgående parasektioner blev farvet med en C1-probe mod Bmal1 (ACD; nr. 438741) og en C2-probe mod Epo (ACD; nr. 315501-C2). Opaleye 520 (Akoya BioSciences; nr. FP1487001KT) blev brugt med theC1-sonden, og opalfarvestof 650 (Akoya BioSciences; nr. FP1496001KT) blev brugt med C2-sonden. Ved - 400 oprindelig forstørrelse blev Epo-positive celler afbildet til Bmal1-kolokalisering ved et Eclipse Ti2-billeddannelsessystem (Nikon). 40,6-diamidino-2-phenylindolen blev brugt som modfarvning.

EPO serumkoncentrationer

Blodprøver fik lov til at størkne i 1 time ved stuetemperatur før centrifugering i 20 minutter ved 2000 - g. Serum blev fjernet og øjeblikkeligt frosset ved -80 C indtil udførelse af den enzymbundne immunosorbentanalyse for Epo (Quantikine; R&D Systems; nr. MEP006) med ufortyndede prøver. Absorbans blev aflæst med en iMARK Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad) ved 450 nm, med bølgelængdekorrektion ved 570 nm og en 4-parametertilpasningsstandardkurve, som beskrevet tidligere.³³

Blodcelletal

samlede og differentierede celletal fra EDTA-antikoaguleret blod blev målt af Synlab. dyrlæge Berlin med en ADVIA2120i(Siemens) automatiseret celletæller til murint blod.

Reporter-gen-assays

Humane embryonale nyre 293-celler (DSMZ; nr. ACC305; passagenummer 3-10; mycoplasma negativ) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's medium/Ham F12 (Biochrom; nr. FG4815) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (Mer. F7524). Celletransfektion blev udført i 12-brøndsplader indeholdende 1.67 - 105 celler/brønd. Hver brønd blev transficeret med 333 ng plasmid-DNA (hvoraf 1 af 10 var vaniljekonstruktion) og 1 ml Fugene 6-transfektionsreagens (Promega; nr. E2691) som beskrevet.34 Alle anvendte konstruktioner er anført i supplerende tabel S3. Celler blev lyseret 48 timer efter transfektion med passiv lysis-buffer (Promega; nr. E1941). Luciferaseaktivitet blev bestemt med Beetle-Juice- og Renilla-Juice-sættene (begge pjk GmbH; henholdsvis nr. 102511/102531) ved et Lumat LB9501-luminometer. Hvert forsøg blev udført i tekniske dubletter, og middelværdier blev brugt til beregninger.

Statistisk analyse

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-fold det interkvartile område) i 4 af 6 døgnudtrykte gener. Data blev analyseret ved hjælp af IBM SPSS Statistics 27 og præsenteres som individuelle prikker med medianen eller som søjler med middelværdi og SD. Mann-Whitney U-test eller Kruskal-Wallis med Bonferroni som post hoc-test blev udført.

RESULTATER

Ablation af cirkadisk Epo-ekspression i Cry-null-mus

For at belyse den molekylære mekanisme for døgnrytme Epo-regulering analyserede vi Epo mRNA og proteinekspression i WT og Cry-null mutant mus. I WT-nyre viste kanoniske urgener et tidsafhængigt udtryk, hvorimod dette blev afskaffet i Cry-null-mus som forventet (Supplerende figur S1). Vi har tidligere rapporteret circadian oscillation af Epo mRNA-ekspression over 24 timer for voksne WT murine nyrer.24 Med fokus nu på de minimale og maksimale værdier observerede vi en signifikant, w9-fold forskel mellem CT06 (musesøvnperiode; forventet minimum ) og CT18 (aktivitetsfase; forventet maksimum; figur 1a). I nyrerne af Cry-null-mus blev der imidlertid ikke påvist nogen signifikant forskel i nyre-Epo-mRNA-ekspression. Navnlig i Cry-null-mus var de absolutte mængder af nyre-Epo-transkriptniveauer på begge tidspunkter mellem de gennemsnitlige WT Epo-mRNA-niveauer ved CT06 og CT18 (figur 1a). EPO mRNA i tilsvarende lever var under detektionsgrænsen (data ikke vist).

Daglige ændringer i Epo-serumkoncentrationer

For at estimere oversættelsen af ​​circadian Epo-mRNA-ekspression til cirkulerende Epo-protein analyserede vi serumprøver ved hjælp af enzym-linked immunosorbent assay. Blodprøver blev taget før organprøver. Serum Epo øgede w2.3- gange mellem CT06 og CT18 i WT-mus, men denne forskel blev ophævet i Cry-null-mus (figur 1b). Navnlig var de gennemsnitlige S-Epo-koncentrationer over tid (CT06 og CT18) ens i WT- og Cry-null-mus (22 mU/ml [interval, 3-59 mU/ml] vs. 21 mU/ml [interval, 7 –50 mU/ml]).

Circadian Epo-ekspression i forhold til arterielle blodgasparametre og pulsoximetri

For at undersøge, om potentielle daglige ændringer i blod- og vævsiltniveauer kunne forårsage circadian oscillation af Epo-ekspression, blev arterielle blodprøver taget, og blodgasanalyser blev udført i bedøvede, trakeotomiserede og mekanisk ventilerede Cry-null- og WT-mus ved CT06 eller CT18, som svarer til henholdsvis de laveste og højeste cirkadiske Epo-mRNA-niveauer (figur 1a). Vi opdagede hverken signifikante forskelle i arteriel pH, partialtryk af CO2 eller partialtryk af O2 eller i standardbaseoverskud eller laktatkoncentrationer (figur 2a-e) mellem CT06 og CT18 eller WT og Cry-null mus. Oxygenmætningsniveauer, målt ved pulsoximetri, viste heller ingen forskelle (figur 2f). Genekspression af EPO master regulator hypoxi-inducerbar faktor (HIF) 2a var ikke forskellig mellem CT06 og CT18, hverken i WT eller Cry-null mus (figur 3). Under normoksiske forhold er den døgnrytme Epo-regulering således ikke forårsaget af ændringer i iltspændingen.

Circadian on-off switch af Epo-ekspression i renale Epo-producerende celler

For at studere, om circadian Epo-mRNA-ekspression medieres ved at tænde for yderligere nyre-Epo-producerende celler (REPC'er) eller udelukkende ved at øge Epo-ekspression pr. celle, blev RNAscope in situ hybridisering brugt på midterste nyre-tværsnit (eksempel i Supplerende Figur S2). I WT-mus steg antallet af REPC signifikant mellem CT06 (median, 5; interval, 0–25) og CT18 (median, 22; interval, 5–82; 4.{{ 11}}fold; P ¼ 0,010). I modsætning hertil viste Cry-null nyrer lignende antal REPC'er ved CT06 (median, 18; interval, 2-33) og CT18 (median, 15; interval, 4-87; ikke signifikant; figur 1c). Vi vurderede, at Cry-null-mus udviser vækstbegrænsning på grund af svækket signalering af insulinlignende vækstfaktor 1 (IGF1), hvilket resulterer i en kontinuerligt stigende forskel i kropsvægt og organstørrelse mellem Cry-null- og WT-mus.30 Som vi brugte relativt unge dyr, den absolutte nyrevægt af Cry-null-mus var kun lidt lavere end i WT-mus (-12 procent i Cry-null-mus), men det relative nyre-til-kropsvægtforhold afveg ikke (Supplerende figur S3) . Den cirkadiske stigning i Epo-mRNA-ekspression ser således ud til at være reguleret af en omskiftning af yderligere REPC'er.

Aktivering af den minimale EPO-promoter ved CLOCK/BMAL1

For at identificere de regulatoriske sekvenser, der er ansvarlige for circadian Epo-ekspression (figur 4a), blev luciferase-reportergen-assays udført i humane embryonale nyre-293-celler. Den humane embryonale nyre 293-cellelinje blev valgt ikke på grund af dens nyreoprindelse, men på grund af dens mangel på et endogent cirkadisk ur. Den stimulerende virkning af CLOCK/BMAL1 kunne således testes i en lav, ikke-oscillerende CLOCK/BMAL1-baggrund. Overekspression af CLOCK/BMAL1 stimulerede signifikant aktiviteten af ​​den minimale humane EPO-promotor (figur 4b, I vs. II). Hvis E-boks-motivet (–36 til –31 bp i forhold til det transkriptionelle startsted) er muteret,35 afstumpes denne effekt (figur 4b, III).

For at undersøge, om den observerede døgnregulering var celletypeafhængig, screenede vi adskillige EPO-udtrykkende cellelinjer for endogen uraktivitet ved at overvåge Bmal1-promotormedierede oscillationer af en luciferase-reporter. Dem med en endogen rytme inkluderede humane hepatom-afledte HEP3B-celler, humane neuroblastom-afledte KELLY-celler og PDGFRbþ musenyreceller (tidligere EPO-udtrykkende musecellelinje FAIK1-10).36,37 Blandt de 3 cellelinjer var kun KELLY-celler udviste EPO-promotor-drevne luciferase-oscillationer (Supplerende figur S4A). Selvom PDGFRbþ-celler udviste en stærk døgnrytme af Bmal1-promotoraktivitet, detekterede vi ikke EPO-promotormedierede oscillationer, hvilket tyder på en lavere amplitude af den EPO-promotordrevne reporterkonstruktion (Supplerende figur S4B).

Kolokalisering af Bmal1 og Epo i nyrerne af Cry-null versus WT mus

For yderligere at belyse (i) den cirkadiske regulering af nyre-Epo-produktion ved at rekruttere renale Epo-producerende celler og (ii) colokaliseringen af ​​Bmal1- og Epo-ekspression, udførte vi RNAscope in situ-hybridisering. Epo og Bmal1 kolokaliseret, og mikroskopi ved lav forstørrelse repræsenterer forskelle i rekrutteringen af ​​REPC'er (figur 5), som kvantificeret i figur 1c.

Hæmatologiske fund i Cry1/Cry2-mangel For at vurdere (i) de hæmatopoietiske virkninger af manglen på cirkadisk Epo-ekspression og (ii) mulige andre hæmatologiske abnormiteter hos mus uden et funktionelt ur, blev blodcelletal analyseret. Tidsforskellene i Epo mRNA-ekspression og S-Epo-koncentration blev ikke afspejlet af signifikante forskelle i perifere retikulocyttal ved CT06 versus CT18 i WT-mus. Retikulocyttal var imidlertid signifikant lavere ved både CT06 og CT18 i Cry-null-dyr sammenlignet med WT-mus (figur 6a). Der var ingen signifikant forskel i erytrocyttal eller hæmatokritværdier i WT versus Cry-null mus. Begge parametre varierede imidlertid ikke mellem CT06 og CT18 i begge stammer (figur 6b og c) og svarede ikke til det lavere perifere retikulocyttal i Cry-null-mus (figur 6a). For at teste, om ernæringsmangler (f.eks. jern og folat) på grund af nedsat IGF1-signalering er involveret i uoverensstemmelsen mellem reduceret retikulocyt, men normale erytrocyttal i Cry-null mus, blev røde blodlegemers størrelse og form analyseret, men viste ingen signifikante forskelle mellem Cry-null og WT mus (Supplerende figur S5).

Det er bemærkelsesværdigt, at det gennemsnitlige blodpladetal i Cry-null-mus havde en tendens til at være højere end i WT-mus, men antallet af blodplader var ikke signifikant forskellige mellem CT06 og CT18 i begge stammer (figur 6d). I modsætning hertil afveg antallet af hvide blodlegemer (WBC) signifikant mellem CT06 og CT18 i WT, men ikke i Cry-null mus. Det gennemsnitlige antal WBC i Cry-null-mus var tilsvarende højt som i WT-mus ved CT06 (figur 6e).

DISKUSSION

Heri demonstrerer vi, at cirkadisk Epo-ekspression reguleres på transkriptionsniveau. Analysen af ​​Epo-mRNA- og S-Epo-koncentrationer i arytmiske Cry1- og Cry2-deficiente mus omdirigerede vores søgning efter "Epos ur" til deres downstream-måltransskriptionsfaktorer CLOCK og BMAL1, som undertrykkes af CRY1- og CRY2.26-ablation af Cry1/Cry2-ledninger til tabet af rytmisk undertrykkelse af CLOCK/BMAL1, hvilket resulterer i konstante Epo-transkriptniveauer, der var mellem medianniveauerne ved CT06 og CT18 i WT-mus (figur 1a). In situ hybridisering med RNAscope indikerer, at den cirkadiske oscillation opnås ved at tænde for Epo mRNA-ekspression i interstitielle celler (figur 1c), og in situ hybridisering med RNAscope afslørede også ekspressionen af ​​Bmal1 i REPC'er (figur 5).

Endnu vigtigere er det, at de signifikant højere S-Epo-niveauer ved CT18 bekræfter, at den cirkadiske, transkriptionelle Epo-regulering oversættes til cirkadiske svingninger af cirkulerende Epo-protein under normoksiske forhold (Figur 1b). Det reelle maksimum af S-Epo-niveauer forventes lidt senere end CT18, fordi de novo-syntese af EPO-protein kræver w80 til 120 minutter38, og døgntiden blev valgt på basis af maksimale Epo-mRNA-niveauer. 24 Vi fandt, at cirkadisk Epo-regulering sandsynligvis medieres af transkriptionel aktivering af et E-boks-motiv i 5' EPO-promotoren af ​​CLOCK/BMAL1 (figur 4 og supplerende figur S4), hvilket er i overensstemmelse med den beskrevne positive korrelation mellem BMAL1-protein og S-Epo-niveauer i en rottemodel for akut blødning.²⁵

Der er bevis for en tovejsregulering mellem CLOCK/BMAL1 og HIF-vejene gennem direkte protein-protein-interaktion.^39,40Opregulering af HIF2a, den vigtigste aktivator af EPO-promotoren, 41,42 resulterede i ændrede ekspressionsniveauer af clock-gener i humane hepatomceller.43 Ydermere dimeriserer BMAL1 med HIF1a- og HIF2a-proteiner,^44,45,og døgntidsstyringen af ​​HIF-aktivitet reguleres på en vævsspecifik måde.39 Hos mus, udsat for akut hypoxi (4 timer ved 6 procent vs. 21 procent O2), var EPO mRNA overdrevent øget, men viste ikke længere døgntidsforskelle .46 Således er normoksiske forhold sandsynligvis mest hensigtsmæssige til at dissekere den molekylære mekanisme af døgnrytme Epo-regulering. Hos gnavere er der dog rapporteret daglige ændringer i blod- og vævsiltniveauer.39,47 Hos rotter er der et lavt interval af rytmiske daglige ændringer i nyrernes oxygenering på zD3 procent, med en top i mørke (¼ gnaveraktivitet) .47 Sådanne forskelle kunne ikke påvises i vores eksperimenter, hvor kun bedøvede, trakeotomiserede og mekanisk ventilerede mus kunne studeres af dyreregulerende årsager. Imidlertid indikerede analyse af arteriel pH, partialtryk af CO2 og partialtryk af O2, standardbaseoverskud eller lactat samt oxygenmætning ikke større forskelle mellem WT og Cry-null mus ved begge CT'er (figur 2). Ydermere var Hif2a-transkriptniveauer i nyren også ens under alle tilstande (figur 3). Under normoksiske forhold ser den døgnrytme Epo-regulering således ud til at være uafhængig af daglige ændringer i iltspændingen. Spørgsmålet om, i hvilket omfang høj højde eller hypoxi (lav pO2) påvirker den cirkadiske oscillation af Epo-produktion, fortjener dog yderligere opmærksomhed. Humane S-Epo-niveauer er generelt højere i stor højde, hvorimod fase og amplitude er uændrede,17,22 og hos raske frivillige udsat for normobarisk hypoxi viser S-Epo-koncentrationer en udtalt svingning.⁴⁸

Circadian Epo-regulering er nok mest relevant for klinisk nefrologi og hæmatologi, men også for laboratoriediagnostik, såsom blodprøvetagning for doping med erytropoiese-stimulerende midler. Til evaluering af cirkulerende Epo-koncentrationer i dopinganalyser skal tidspunktet på dagen (ekstern tid) ved blodopsamlingen og personens kronotype (intern tid) tages i betragtning.49,50

I erythropoiesis er burst-dannende enheder - erythroid de første afstamningsspecifikke celler, efterfulgt af kolonidannende enheder - erythroid, som viser rigelig ekspression af Epo-receptor. Efter 2 dage i kultur med Epo producerer murine kolonidannende enheder - erythroider erythroblastkolonier. Når først stadiet af ortokromatiske erythroblaster er nået efter 7 dage, ekstruderer cellerne deres kerner for at blive retikulocytter, der mangler Epo-receptorekspression.51 I betragtning af den tid, det tager for de kolonidannende enheder – erythroid at modnes til retikulocytter eller endda fuldt modne erytrocytter, er sandsynligvis ikke overraskende, at der ikke blev observeret forskelle mellem CT06 og CT18 i WT-mus (figur 6a-c). Navnlig var det samlede retikulocyttal signifikant højere i WT end i Cry-null-mus (figur 6a), hvilket tyder på, at differentiering til retikulocytter er svækket i Cry-null-mus. Tidligere data indikerer, at tidlige erythroide progenitorceller også udviser et døgnrytmemønster for DNA-syntese. In vivo-administration af rhEpo øger døgnrytmen af ​​erythroide koloniantal.52 Lavere retikulocyttal, på trods af relativt høje overordnede S-Epo-koncentrationer i Cry-null-musene, kunne skyldes afskaffelse af døgn-DNA-syntese på niveauet af erythroide progenitorer. En sådan konstellation af høj S-Epo og reduceret erytropoiese er blevet observeret hos mus med genetisk ablation af pineal melatoninproduktion (C3H/HeN-mus, der mangler en hastighedsbegrænsende N-acetyltransferase),53, hvilket argumenterer for iboende døgnaktivitet på den erythroide stamceller niveau.

Navnlig viser Cry-null mus en cirka 80 procent reduktion i IGF1-niveauer, hvilket fører til reduceret IGF1-signalering og en 30 procent reduktion af kropsvægt og organstørrelse sammenlignet med WT, en effekt, der forværres i løbet af et helt liv.30 Selvom dyr brugt i vores eksperimenter var relativt unge (middelalder,^21–29 uger), viste de en moderat effekt på total kropsvægt og absolutte nyrevægte hos Cry-null mus, men nyre-til-kropsvægtforholdet var normalt (Supplerende figur S3). Sidstnævnte kan være relevant for kapaciteten af ​​Epo-proteinsyntese (figur 1b).

Analyse af røde blodlegemers størrelse eller form (MCV, MCH og MCHC; Supplerende figur S5) antydede imidlertid ikke ernæringsmæssige mangler (f.eks. jern og folat) som en forklaring på uoverensstemmelsen mellem reducerede retikulocyttal og normale erytrocyttal i Cry- null-mus (figur 6a og b). Især Epo- og IGF1-signalering synkroniserer celleproliferation og -differentiering under erytropoiese via interaktion med GATA-1/vennen af ​​GATA-1-transkriptionskomplekset.54 I denne proces aktiverer Epo den cellulære AKT-vej og øger derved affiniteten af ​​GATA-1, den vigtigste transkriptionelle regulator af erythropoiesis, til dens cofaktorven af ​​GATA-1. Denne mekanisme hæmmes dog, hvis IGF1-signalering afskaffes.54 Således kan en positiv effekt af relativt højere Epo i Cry-null-mus på røde celledifferentiering opveje den reducerede IGF1-aktivitet i de relativt unge Cry-null-mus, der er undersøgt heri.

Den generelle implikation af fuldstændig døgnrytmearytmicitet på hæmatopoiesis belyses yderligere af vores analyse af blodplade- og WBC-tal. Tidligere resultater fra mus, der udtrykte en dominant-negativ form af Clock (ClockD19/D19) indikerede, at afbrydelsen af ​​ekspressionen af ​​thrombopoietin (den primære regulator af megakaryopoiesis) og dets receptor Mpl resulterer i øget antal modne marv-megakaryocytter og cirkulerende blodpladeantal. 55 Den beskrevne signifikante døgnsvingning af trombocyttal med ved toppunkt ved zeitgeber-tid (ZT) 20 i WT-mus samt højere blodpladetal ved ZT08 i ClockD19/D19-mus55, hvilket resulterede i en mangel på døgnrytmeoscillation af trombocyttal, kunne ikke bekræftes i vores musemodel (figur 6d). Et andet vigtigt fund er tabet af tidsforskelle mellem cirkulerende WBC'er i Cry-null-mus i modsætning til WT-mus (figur 6e), hvilket er i overensstemmelse med den rapporterede aktivitet af CLOCK/BMAL1 på moden WBC-produktion.^56,57

For fortolkningen af ​​vores data skal forskelle i dag-nataktiviteter hos mus og mennesker tages i betragtning: Tidspunktet CT06 hos mennesker svarer nogenlunde til midnat (sovefase), hvorimod CT18 nogenlunde svarer til middag (aktivitetsfase). Det modsatte er tilfældet for nataktive mus, men begge organismer viser det samme døgnrytme Epo-ekspressionsmønster (lavt ved CT/ZT06, højt ved CT/ZT18). Dette indikerer, at yderligere mekanismer (f.eks. metaboliske faktorer) kunne ændre rytmerne af Epo-ekspression i begge organismer. Synkroniseringen mellem Epo-topniveauer og Epo-receptorekspression i tidlige erythroide progenitorer (burstdannende enheder - erythroide og endda kolonidannende enheder - erythroide celler)⁵² tyder på, at patienter, der modtager rhEpo-behandling (f.eks. i slutstadiet af nyreanæmi eller hæmatologiske lidelser) vil have gavn af at efterligne den normale døgnfysiologi ved at anvende hypo om natten. Hæmatopoietiske lidelser er endnu ikke blevet rapporteret hos mennesker med CRY1 (Online Mendelian Inheritance in Man *601933) eller CRY2 (Online Mendelian Inheritance in Man *603732) mutationer med tab af funktioner. Kliniske rapporter forbinder CRY1-varianter primært med opmærksomhedsunderskud/hyperaktivitetsforstyrrelser, ofte ledsaget af søvnløshed, angst, depression eller forsinket søvnfaseforstyrrelse.^58,59Dette fortjener yderligere undersøgelse, fordi sådanne sygdomme kan forværres af anæmi eller hæmatopoietiske lidelser.

Som konklusion giver denne undersøgelse det første bevis på, at døgnrytmen Epo-ekspression i den normoksiske voksne murine nyre reguleres på transkriptionsniveau af CLOCK/BMAL1-medieret aktivering af et E-boks-element i 5'EPO-promotoren. Da EPO virker særpræget inden for det komplekse regulatoriske netværk af erytropoiesis, kan optimal brug af repo hos patienter med nyreinsufficiens omfatte dets anvendelse lige før dets fysiologiske cirkadiske maksimum om natten.