Den centrale rolle for transformerende vækstfaktor- (TGF-) i udvikling af nyrefibrose
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
DEL Ⅰ: Rolle af human primær nyrefibroblast i TGF- 1-medieret fibrose-efterlignende enheder
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.
1. Introduktion
Nyrefibrose, den sidste fælles vej for utallige progressive nyresygdomme, er karakteriseret ved en stigning i ekstracellulær matrix (ECM) proteinproduktion, et fald i matrix nedbrydning, dysfunktion af celle-matrix interaktion, transformation af residente celler og inflammatorisk celleinfiltration.Transformerende vækstfaktor-(TGF-) er et multifunktionelt dimert peptid, der regulerer biologiske processer såsom celleproliferation, differentiering og immunologiske responser [1]. Blandt de mange fibrogene faktorer, TGF-(Transformerende vækstfaktor-) spiller en central rolle og har en anti-inflammatorisk effekt. TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)-mangelfulde mus dør af massiv inflammation. Transgene mus, der overudtrykker TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)er praktisk talt beskyttet mod at udvikle nyrefibrotisk patologi, hovedsageligt gennem dets anti-inflammatoriske aktivitet [2]. De profibrotiske og antiinflammatoriske egenskaber af TGF-(Transformerende vækstfaktor-)er tveæggede sværd vedrørende den terapeutiske anvendelse af TGF-(Transformerende vækstfaktor-)hæmning. Der er gjort en bemærkelsesværdig indsats for at hindre TGF-(Transformerende vækstfaktor-)handling for at hindre udviklingen afnyrefibrose[3]. Selvom mange tilgange er blevet brugt til at bekæmpenyrefibrose, er en eksperimentel model til at evaluere aktuelt tilgængelige lægemidler ikke ideel.
cistanche urt forebyggenyresygdomme
Generelt spiller dyreforsøg en central rolle i prækliniske tests ved forudsigelse af farmakokinetik og lægemiddeleffektivitet. Der findes imidlertid forskellige forskelle mellem dyr og mennesker, hvilket får os til at stille spørgsmålstegn ved nøjagtigheden af dyrebaserede lægemiddeleffektivitets- og sikkerhedstests 4. Tidligere rapporter har været afhængige af prækliniske dyreforsøg under lægemiddeludvikling for at vurdere lægemidlers nefrotoksicitet og sikkerhed. Dyrenes nyrefunktion er mere end dobbelt så stor som de menneskelige nyrer. Derfor metaboliseres lægemidler hurtigere hos dyr end hos mennesker, hvilket gør det vanskeligt at belyse resultaterne af lægemiddeltoksicitetstests ved hjælp af dyreforsøg. Desuden kan resultaterne af dyreforsøg ikke bruges til at forudsige lægemiddelreaktioner hos mennesker, da dyr har forskellige fysiologiske funktioner. Dyrebaseretnyrefibrosemodeller har svært ved at reproducere menneskernyrefibrose; derfor er forskning i gang for at overvinde nuværende forhindringer og optimere platforme til opdagelse af narkotika [5].
Organ-on-a-chip (OoC) teknologi er dukket op som et nyt koncept til at løse disse problemer. Denne platform blev designet under hensyntagen til de nuværende mangler, og den har vist sig meget lovende inden for nefrologi [6]. Derudover rummer OoC-modeller et stort potentiale som erstatning for eksperimentelle dyremodeller, giver en løsning på forskelle mellem arter og kan hjælpe med at afslutte dyremishandling og etiske debatter [7]. Der er få in vitro-modeller, der samtidig bruger primære nyrefibroblaster med endotel- og epitelceller, som er vigtige celler inyrefibrose. Hver celles rolle ifibrosestuderes separat; der er dog begrænset viden om cellernes interaktion.
I nærværende undersøgelse udviklede vifibrose-efterlignende anordninger ved hjælp af humane primære fibroblaster. Vi bekræftede, at TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling har forskellige effekter pånyrefibrosemodel. Især spiller fibroblaster en central rolle som effektorceller, fremmer dannelsen af et pro-fibrotisk mikromiljø og udskiller vækstfaktorer og cytokiner. Derfor, baseret på denne nye metode, kan fibroblaster give et ideelt cellemodelsystem til at studere nyresygdom. Vi evaluerede, om fibrotisk nyresygdom-afledte fibroblaster påvirker integriteten af celler dyrket i tre dimensioner (3D). Til sidst præsenterer vi en proof-of-principle undersøgelse, der demonstrerer menneskets potentialenyrefibrose-efterlignende enheder som en model til at forudsige reaktionen på menneskernyrefibrose.
virkninger af cistanche: behandle nyreinfektion
2. Resultater
2.1. Identifikation af Alpha Glat Muscle Actin(a-SMA) og Keratin-8(KRT-8) af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)i HK-2 celler
I den tidlige fase undersøgte vi kendte markører forfibroseog cytoskelettet i todimensionelle (2D) kulturer. Immunfluorescerende farvningsassays blev udført for at estimere -SMA-ekspressionen af fibrose og tubulær epitel- til mesenkymal overgangsmarkør (EMT) og KRT8-niveauer som en cytoskeletmarkør. Immunfluorescensfarvning viste, at ekspressionen af -SMA oprindeligt var svag, og KRT8-niveauer var høje i monolaget HK-2-epitelceller. Der var ingen signifikant ændring i fluorescensintensitet af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)(5 ng/mL) eller den specifikke inhibitorbehandling af HK-2-epitelceller i 24 timer (figur 1).
Figur 1. Immunfluorescens viser, at ekspressionen af alfa-SMA og keratin-8(KRT8) blev opretholdt ved behandling af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)eller inhibitoren i HK-2-celler.(A) Ekspressionen af alfa-SMA og (B)CCK-8 havde ingen effekt på HK-2celler af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)(5ng/ml) eller inhibitoren. Celler blev oprindeligt udpladet med en tæthed på 1×10 grader pr. brønd (ac)ubehandlet kontrol og （df）stimuleret med 5ng/mL TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-) eller (gi) 10 μM inhibitor (SB431542) i 24 timer og fikseret med 4 procent paraformaldehyd. Cellerne blev derefter farvet med anti- -SMA og anti-cytokeratin-8 i 20 min. Co-farvning med Hoechst farvestof H33342 for at identificere cellekerner blev udført. Skala søjler i mikrofotografier angiver 200 um.
cistanche pulver forbedrer nyrefunktionen
2.2. KRT8-udtryk reduceret med TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)på en chip
Dernæst evaluerede vi ekspressionsniveauerne af -SMA og KRT8 i 3D-dyrket HK-2 og den samlede længde af GFP-humane navlestrengsvene-endotelceller (HUVEC'er) behandlet med TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)og en specifik inhibitor. For at opnå dette etablerede vi først et vævschipmønster, der omfatter to celletyper, HK-2-epitelceller og GFP-HUVEC'er. Efter bekræftelse af konstruktionen eksponerede vi vævschippen med TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)(5 ng/ml) eller en specifik inhibitor (10 um SB431542) i 24 timer.
Som vist i figur 2A-C blev udtrykket af -SMA ikke specifikt ændret af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)eller den specifikke hæmmerbehandling. Ekspressionen af KRT8 blev imidlertid reduceret i den to-celle-type co-dyrkede chip. Desuden øgede tilføjelsen af en TGF-ß1-hæmmer ekspressionen af KRT8.
Vi undersøgte dannelsen af et 3D-rørformet kapillærlignende netværk af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling i HUVEC'er, da endotelceller spontant kan danne et 3D rørformet kapillærlignende netværk. I overensstemmelse med vores kulturelle forhold blev dannelsen af tykke linjer betydeligt reduceret. Kapillærlignende tynde linjer blev imidlertid øget i TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandlede GFP-HUVEC'er. I tilfælde af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)inhibitorbehandling på den 3D-dyrkede chip, den samlede længde af de tykke og tykke linjer viste en omvendt tendens til TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling. En stigning i længden af den tykke linje blev observeret sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe. Et lignende mønster blev observeret i diameteren af den tykke linje i GFP-HUVEC efter TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling og inhibitorbehandling. Diameteren af GFP-HUVEC blev undertrykt af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling, men øget uanset tykkelsen af linjen af inhibitoren sammenlignet med både kontrollerne og TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-). Den samlede længde og diameter af den tykke linje blev dramatisk forøget med TGF- 1-hæmmerbehandling sammenlignet med den ubehandlede kontrol- og TGF- 1-behandling. Navnlig indikerede de opnåede resultater en øget tæthed af små kar i TGF-(Transformerende vækstfaktor-)-behandlet gruppe sammenlignet med deres ubehandlede modparter. I modsætning hertil er tætheden af tykke kar i TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandlingsgruppen var lavere end den i den ubehandlede kontrolgruppe (figur 2D, E).
Figur 2. KRT8-udtryk i HK-2 og total længde og diameter af HUVEC'erne.(A) Immunfluorescens viser, at ekspressionen af -SMA blev opretholdt, og KRT8-ekspression blev dramatisk reduceret ved behandling af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)i HK-2. Celler blev udpladet og stimuleret med 5ng/ml TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)eller 10 μm inhibitor (SB 431542) i 24 timer og fikseret med 4 procent paraformaldehyd. Cellerne blev farvet med anti- -SMA og anti-cytokeratin-8 i 20 min. Co-farvning med Hoechst farvestof H33342 for at identificere cellekerner blev udført. Ekspressionen af -SMA(ac) havde ingen ændring, men KRT8(df) i HK-2-celler og GFP i HUVEC (gi)-ekspression blev signifikant ændret af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)(5 ng/ml) og inhibitoren (B, C). I den samlede længde af HUVEC'erne blev det tynde kar øget, men det tykke kar blev reduceret med TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-). Diameteren blev øget i både de tynde og tykke kar. Disse resultater blev reverseret af inhibitoren SB431542 (D, E). Skala søjler i mikrofotografierne angiver 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
hvad bruges cistanche til: behandling af kroniske nyresygdomme
2.3. TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)Påvirker tre celletyper af chippen med en flerrumsstruktur
At studere TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)svar fra den foreslåede 3D-chip udførte vi immunfarvning på hvert rum separat (figur 3). Primære humane nyrefibroblaster blev anvendt i denne analyse. Prøverne blev analyseret under anvendelse af FACS og bekræftet at være positive for fibroblastmarkørantistoffet. Efter inkubation af de tre celletyper med TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)i 24 timer blev der udført immunfarvning for at vurdere ekspressionen af -SMA og KRT8. Ekspressionen af a-SMA blev opreguleret af TGF-1-behandling, og modsatte resultater blev observeret med TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)inhibitor behandling. Omvendt blev udtrykket af KRT8 nedreguleret af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)og viste en modsat reaktion på TGF-(Transformerende vækstfaktor-)inhibitor (figur 4A-C).
Figur 3. Prøvebillede med enhedens skematisk demonstration af fremstillingen og eksperimentel tidsplan.(A) De to øverste billeder viser layoutet. Det venstre billede viser et samlet top-down-billede af enheden. De nederste billeder viser tværsnittet. Skematisk visning, der viser dimensionerne af væskestyrene. (B) Denne figur beskriver de eksperimentelle tidsplaner forfibrose-efterlignende enheder. Den fire-trins indlæsningsproces for hver brønd. Placering af hvert hydrogel-mønsterområde samt placeringen af mediet i top-down og isometrisk tværsnit. (1) I alt 1,5 uL hydrogel 1 ledes spontant ind i den centrale kanal. (2) Den centrale kanal er fyldt med 5 uL hydrogel. (3)I alt 10uL hydrogel 3 er mønstret på reservoirbunden. （4）I alt 200μL medie dispenseres. Rød skala=9 mm.
Som afbildet i figur 4D-G blev længden af den kapillærlignende tynde linje signifikant forøget med TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling i GFP-HUVEC'erne. Tykkelsen af den tykke linje blev dog reduceret i TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandlede HUVEC'er. Diameteren blev reduceret i gennemsnit for de tynde og tykke kar i HUVEC'erne. I tilfælde af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)inhibitorbehandling på den 3D-dyrkede chip, viste den samlede længde af de tykke og tykke linjer en modsat tendens til TGF- 1-behandlingen. Yderligere var længden af den tykke linje øget sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe.
Figur 4. Ændring af 3D-dyrkede HK-2 og HUVEC'er med primære nyrefibroblaster.Totale celler blev udpladet med en tæthed på 5×10 grader pr. 3D-chip og stimuleret med 5 ng/mL TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)eller 10 μm inhibitor (SB 431542) i 24 timer og fikseret med 4 procent paraformaldehyd. (A) Celler i 3D-chippen blev farvet med anti-o-SMA og anti-cytokeratin-8. Ekspressionen af -SMA (ac) blev øget, og KRT8(df)-ekspression blev reduceret med TGF- 1(5 ng/ml) signifikant. Den samlede længde af HUVEC'erne; tynde kar blev dramatisk forøget, og tykke kar blev reduceret med TGF-ß1(Transformerende vækstfaktor-)(D, E). Diameteren blev reduceret for tynde og tykke kar (F, G). Disse resultater blev reverseret af inhibitoren SB431542. Skala søjler i mikrofotografier angiver 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 modulerer inflammatorisk mediator og vækstfaktorer
Dernæst undersøgte vi de inflammatoriske cytokiner og vækstfaktorer i supernatanten; IL-1, FGF-2, TGF- 2(Transformerende vækstfaktor-)og TGF- 3(Transformerende vækstfaktor-)proteinsekretion var dramatisk højere i 3D-dyrkede chips end 2D-fibroblasten dyrket godt, selvom de havde det samme totale celletal. Men TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-) niveauer var ens, da de 2D- eller 3D-dyrkede modeller blev behandlet med lignende koncentrationer af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)(Figur 5A-E). Især var frigivelsen af FGF-2 fra humane primære nyrefibroblaster 20,9 ± 0,4 pg/dag/5×10 graders celler af 2D mono-lagskulturen og 3094,8± 0,2 pg/dag/5×10 graders celler inklusive HUVEC'erne og HK-2 af den 3D-dyrkede chip i den ubehandlede kontrol. Sekretionen af FGF-2 af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)stimulation var 31.0±0.2pg/dag/5×10 graders celler for 2D-kulturen og 3683.9± 0.8 pg/dag/5×10 graders celler for 3D -dyrket chip. Denne stigning i FGF-2-proteinproduktion i 2D-monolagskulturen blev sideløbende med en stigning i den 3D-dyrkede chipmodel af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling (figur 5B).
Figur 5. Sammenligning af 2D- og 3D-dyrkede modeller som nyrefibrose-efterlignende platforme.Celler blev udpladet med en tæthed på 5×10 grader pr. 2D-brønd eller 3D-chip og stimuleret med 5ng/mL TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)eller 10 um inhibitor (SB 431542) i 24 timer. Primære humane nyrefibroblaster blev anvendt i den 2D-dyrkede og i den 3D-dyrkede model. Fibroblaster blev brugt ved en tæthed på 8×10* dyrket med HUVEC'er og HK-2. Det primære humane renale fibroblast-til-HUVEC-forhold, eller F:H-forhold, var 1:5 til vurderingfibrose.HK-2-celler blev brugt ved en tæthed på 2×104. Påvisning af (A)IL-1,(B)basisk fibroblastvækstfaktor (FGF-2) og (CE)TGF-beta 1, 2 og 3 i supernatanten blev udført ved multipleksanalyse af cytokiner og multiplex perle immunoassay. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Transformerende vækstfaktor-).
cistanche tubolosa fordele: behandling af nyresygdomme
Desuden estimerede vi mRNA-ekspressionen af pro-inflammatoriske cytokiner såsom IL-1, IL-6, IL-8 og TNF-. Resultaterne blev signifikant nedreguleret af rekombinant human TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling i den 3D-dyrkede chip som en antiinflammatorisk egenskab ved TGF-(Transformerende vækstfaktor-). Vi fandt ud af, at mRNA-ekspression blev opreguleret af TGF'en- 1(Transformerende vækstfaktor-)inhibitor (SB431542). Desuden blev inhibitor-medieret ekspression af IL-6, IL-8 og TNF- specifikt nedreguleret sammenlignet med i den ubehandlede kontrol (figur 6A-D). mRNA-niveauet af VEGF, en fibrotisk faktor, blev signifikant forøget af TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)behandling. mRNA-niveauet af VEGF blev reduceret af TGF- 1-hæmmeren (figur 6E), hvorimod mRNA-ekspressionen af IL-10 med anti-fibrotisk effekt blev reduceret under fibrotiske tilstande induceret af TGF- 1 . I modsætning hertil blev I-10mRNA-ekspression øget ved TGF- 1-hæmmerbehandling (figur 6F).
Figur 6. Real-time PCR viser den samlede mRNA-ekspression af 3D-chippen.Celler blev udpladet med en tæthed på 5×10 grader pr. 3D-chip og stimuleret med 5ng/mL TGF- 1(Transformerende vækstfaktor-)eller 10 um inhibitor (SB431542) i 24 timer. Total RNA ekstraheret fra den 3D-dyrkede chip. mRNA-ekspressionen af (A)IL-1,(B)TNF-,(C)IL-6 og (D)IL-8 repræsenterer den antiinflammatoriske virkning af TGF{ {10}}(Transformerende vækstfaktor-)behandling. (E)VEGF-ekspression som en angiogen faktor blev øget. (F)IL-10-ekspression som en anti-fibrotisk faktor blev signifikant reduceret af TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Transformerende vækstfaktor-).