Anti-apoptose af podocytter og pro-apoptose af mesangiale celler for telmisartan til at lindre diabetisk nyreskade

ABSTRAKT

Podocytbeskadigelse og mesangial celleudvidelse er to vigtige patologiske manifestationer af glomerulær skade i tidlig diabetes. Telmisartan, som en angiotensin type 1 (AT1) receptorhæmmer, kunne forbedre avancerede glycation end (AGE) produkter eller angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ)-induceret podocytskade inklusive løsrivelse eller apoptose. I dette aktuelle papir bekræftede vi først den beskyttende effekt af telmisartan på tidlig diabetisk nyreskade hos type 1-diabetiske rotter. Telmisartan reducerede tabet af podocin og hæmmede ekspressionen af ​​-SMA, hvilket afspejlede dets beskyttende effekt på henholdsvis podocytskade og mesangial proliferation. Mere interessant observerede vi en modsat effekt af telmisartan på cellelevedygtigheden og apoptose af podocytter og mesangiale celler i et miljø med højt glukose in vitro. Telmisartans anti-apoptotiske virkning på podocytter kan være relateret til dets hæmning af ekspression af swiprosin-1 (et protein, der kan mediere høj glucose-induceret podocytapoptose). Mens telmisartan inducerede en høj ekspression af PPAR i mesangiale celler, og GW9662 (en PPAR-antagonist) delvist hæmmede telmisartan-induceret apoptose og reducerede levedygtigheden af ​​mesangiale celler. Desuden kunne høj glucose-induceret PKC 1/TGF 1-ekspression i mesangiale celler blokeres af telmisartan. Disse data giver en mere præcis cellulær mekanisme til at afsløre telmisartans beskyttende virkning ved diabetisk nyreskade.

SØGEORD

diabetisk nyresygdom, podocytter (MeSH: D050199), mesangiale celler, telmisartan (PubChem CID: 65, apoptose

Klik her for at købe Cistanche-produkter

INTRODUKTION

Diabetisk nyresygdom (DKD), velkendt som en kronisk nyresygdom induceret af diabetes mellitus (DM) type 1 eller 2 (Podgórski et al., 2019), kunne forværre den glomerulære filtrationshastighed (GFR) falder progressivt og udvikler sig til sidst til ende -stadie nyresygdom (Hou et al., 2018; Ruiz-Ortega et al., 2020; Expert Group of Chinese Society of Nephrology, 2021). Der er to mekanismer, som hyperglykæmi medierer via nyrepodocytskaden og glomerulære basalmembran (GBM) ændringer induceret af mesangial celleudvidelse eller proliferation (Anders et al., 2018).

Podocytter er specialiserede viscerale epitelceller, der forer det ydre lag af GBM, hvis fodprocesser interdigitale danner en ultimativ barriere for at forhindre urinproteintab (Podgórski et al., 2019). Antallet og/eller tætheden af ​​hver glomerulus er blevet undersøgt hos patienter med DM (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Beskadigelse af podocytterne bidrager til tabet af deres adhæsive egenskaber og er en væsentlig årsag til DKD-udvikling (Podgórski et al., 2019). Et andet bemærkelsesværdigt kendetegn ved podocytter er, at modne podocytter er begrænsede proliferative celler (Podgórski et al., 2019), (Griffin et al., 2003). Tab af podocytter medfører proliferation af de mesangiale celler, ikke desto mindre fører større tab til glomerulær fibrose og øget proteinuri som efterfølgende denudering af GBM (Fukuda et al., 2012). Dårlig glykæmisk kontrol resulterer i podocytopati (Anders et al., 2018), morfologiske ændringer karakteriseret ved podocythypertrofi, podocytepitelial-mesenkymal transdifferentiering (Chang et al., 2017), podocytløsgørelse (Zhang et al., 2020), podocytter. Wang et al., 2018a) og tab af podocytter, som fører til de progressive podocyt-aberrationer, resulterer i løsrivelse af GBM med deraf følgende glomerulosklerose.

Mesangiale celler har en betydelig indflydelse på ikke kun justeringen af ​​glomerulær og intraglomerulær cirkulation, men også bevarelse af glomeruli, såsom forsvaret af glomerulære endotelceller og udstrømning af stoffer fra serum og væske fra mikrokar (Wakisaka et al., 2021). Fortykket GBM og udvidet mesangial er mærkbare glomerulære svækkelser ved diabetes (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). GBM-fortykkelse er en tidlig histopatologisk i DKD og påvirkes af den afvigende indkomst og variation af ekstracellulær matrix udskilt af endotelceller og podocytter (Anders et al., 2018). Hyperglykæmi exciterer mesangiale celler til at proliferere og fremstille matrix (Kriz et al., 2017) via aktivering af transformerende vækstfaktor- (TGF), som direkte forårsager transkriptionel aktivering af matrixkollagener (Ziyadeh et al., 2000), hvilket fører til den ekspanderende mesangiale matrix.

Tidlig intervention med hypoglykæmisk og antihypertensiv behandling er gavnlig til at forsinke forekomsten og udviklingen af ​​DKD (Martins og Norris, 2001). Specielt anbefalet til voksne med normalt blodtryk med DM og albuminuri er en angiotensin-konverterende enzymhæmmer (ACEI) eller angiotensinreceptorblokker (ARB) (Liew et al., 2020). Blokering af renin-angiotensin-systemet forbedrer ekspressionen af ​​ANGPTL2 og integrin, som opretholder den glomerulære barriere (Tawfik et al., 2021). Grunden til at telmisartan blev valgt er, at det beskrives som mere effektivt end andre ARB-lægemidler til at lindre proteinuri (Naruse et al., 2019; Guo et al., 2020). Desuden kan telmisartan reducere cisplatin-induceret nefrotoksicitet, såsom podocytapoptose og autofagi-associerede proteinekspressionsniveauer (Malik et al., 2015). Fascinerende nok har telmisartan sådanne egenskaber under hensyntagen til dets dobbeltrolle som AT1-receptorblokerende virkning og peroxisomproliferatoraktiveret receptor-gamma (PPAR) partiel agonistisk egenskab (Balakumar et al., 2012). Målet med dette papir var at undersøge telmisartans beskyttende indflydelse på henholdsvis podocytskade og mesangial ekspansion i det tidlige stadie af type 1 DM.

Cistanche pulver

MATERIALER OG METODER

1. Dyr

SD-hanrotter blev købt fra SLRC Laboratory Animal Ltd. (Shanghai, Kina). Rotter blev anbragt ved en kontrolleret temperatur på 22 ± 2 grader C, relativ luftfugtighed på 50-60 procent, 12-h lys og 12-h mørke cyklusser (lys, 08:00-20 :00, mørke, 20: 00–08:00), og tillod fri adgang til almindelig tørkost og postevand. Alle dyr modtog human pleje, og forsøgsprotokoller blev godkendt af Animal Care Committee på Naval Medical University.

2. Diabetisk model og behandling

Weight 180–200 g male rats were treated with STZ (Sigma, Deisenhofen, Germany) to induce type 1 diabetes. STZ was dissolved in sterile citrate buffer (pH 4.5) and injected intraperitoneally (65 mg/kg body weight) within 10 min of preparation. The non-diabetic rats initially injected with STZ vehicles served as controls (group Con, n = 10). Diabetes mellitus was confirmed by measuring glucose levels in tail venous blood using a B-glucose analyzer (HemoCue, Angelholm, Sweden) 7 days later. Rats with random blood glucose levels>16,7 mmol/L blev inkluderet i forsøgene.

De diabetiske rotter modtog derefter telmisartan (Merck, PHR 1855, 10 mg kg−1 ·d−1 po, gruppe DM plus Tel, n=10) eller vehikel (gruppe DM, n=10) ved sondemad i 4 uger. Telmisartan anvendt i dette papir blev opnået fra Sigma-Aldrich Germany, Inc., hvis renhed er 98 procent plus (HPLC). Periodisk blev blodsukker og kropsvægt målt, og urinprøver til kvantitativ måling af albuminuri blev opsamlet i metaboliske bure. Rotter blev aflivet under anæstesi efter 4 uger, nyrerne blev fjernet og vejet til histologisk analyse og proteinekstraktion.

3. Urinalbumin

Urinprøverne blev centrifugeret ved 10,000 rpm i 5 minutter for at fjerne uopløselige materialer. Supernatanten blev delt i alikvoter og opbevaret ved -80 grader C indtil brug. ELISA-kit til rotteurinalbumin fra Chondrex (Redmond, WA) blev anvendt i overensstemmelse med producentens instruktioner.

4. Kreatinin-clearance-hastighed

Kreatininanalysesættet (Nanjing Jiancheng, C011-2-1) blev brugt til bestemmelse af kreatinin i blod og urin. Ccr blev beregnet efter formlen: Ccr=(urinkreatinin*24 timers urinvolumen)/(blodkreatinin*24 timer*60 min/t)/slutvægt (kg).

5. Immunhistokemisk og TUNEL-farvning

Nyrerne blev skåret i en udskæringsmikrotom ved 7-8 μm og fikseret med 4 procent paraformaldehyd i PBS i 1 0 min. Blokering er blevet udført med buffer (PBS, 2 procent BSA, 10 procent FBS) i 1 time efterfulgt af 10 minutters inkubation med en anden buffer (PBS, 0,4 procent Triton). Primært antistof mod -SMA (Servicebio, GB13044) eller NPHS2 (Abcam, ab229037) er blevet inkuberet i 3 timer ved stuetemperatur i et befugtet kammer. Efter vask blev sektionerne inkuberet med Cy3 gede anti-mus IgG (H plus L) (Servicebio, GB21301), HRP konjugeret gede anti-kanin IgG (H plus L) (Servicebio, GB23303) eller immunfluorescerende TUNEL (Servicebio, G1501 ) reaktion i et fugtigt kammer (mørkt, 37 grader, 1 time). Sektionerne blev derefter modfarvet med DAPI (Servicebio, G1012) til påvisning af kerner. Til sidst blev de farvede sektioner indlejret i modstanden mod fluorescensdæmpende forseglingsvæske og afbildet ved hjælp af et fluorescensmikroskop (NIKON ECLIPSE C1, Japan).

Cistanche ekstrakt

6. Cellekultur

Humane renale mesangiale celler (HRMC'er) blev opnået fra ScienCell Research Laboratories, Santiago, CA, og dyrket i Mesangial Cell Medium (MsCM, ScienCell Research Laboratories). HRMC'er blev udpladet på en poly-L-lysinbelagt kolbe (2 ug/cm2) og dyrket ved 37 grader i en fugtig atmosfære indeholdende 5 procent CO2. Cellerne i dette eksperiment blev brugt inden for 3-4 passager og blev undersøgt for at sikre, at de demonstrerede de specifikke egenskaber for mesangiale celler. Muse-podocytcellelinje MPC-5 blev opnået fra ATCC, Maryland, USA. Cellerne blev dyrket på type I kollagen i RPMI 1640 (10 procent FBS) med 50 U/ml IFN- ved 33 grader til 85 procent konfluens og derefter overført til 37 grader uden IFN- i 10-14 dage til differentiering.

7. Cellelevedygtighed og spredningsassay

Celletællingskit-8 (CCK-8) blev brugt til at måle celleproliferation og cellelevedygtighed. Celler blev podet i hver brønd af 96-brønds kulturplader (5 x 103/brønd). Efter behandlingen blev 10 ul CCK-8 (Beyotime, Shanghai, Kina) tilsat og inkuberet i 1 time ved 37 grader C. Absorbansen blev målt ved hjælp af en mikropladelæser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ved en bølgelængde på 450 nm.

8. Annexin V og propidiumiodidfarvning

Celler blev udpladet og dyrket, indtil de nåede 60 procent konfluens, og derefter behandlet med høj glucose (50 mmol/L) eller telmisartan. Efter 96 timer blev de opsamlede celler vasket med kold PBS og resuspenderet i en bindingsbuffer. Annexin V-FITC og PI (eBioscience, Santiago, CA, USA) blev tilsat til den cellulære suspension i henhold til producentens instruktioner, og en prøvefluorescens på 10,000 celler blev analyseret ved flowcytometri udført med FACScan ( Becton, Dickinson og Company, Franklin, NJ, USA).

9. Western Blotting

Den renale cortex, HRMC'er og MPC-5 blev homogeniseret i vævs- eller celleproteinekstraktionsreagens (Beyotime) suppleret med protease- og phosphatasehæmmere (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA). Prøver blev separeret på en 10% SDS PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Pall Corporation, NY, USA). Membranen blev blokeret med 5 procent bovint serumalbumin og blottet med antistoffer. Anti-PKC 1 (Cell Signaling Technology, 46.809), anti-swiprosin-1 (Abcam, ab24368), TGF- 1 (Abcam, ab215715), Tubulin (Beyotime, AT819) og GAPDH (Beyotime, AF5009 ) blev brugt i en koncentration på 1:1,000. Proteiner blev visualiseret ved hjælp af IRDye-konjugerede anti-muse- eller anti-kanin-sekundære antistoffer (Rockland, Limerick, PA, USA) ved 1:5,000. Brug af ODYSSEY INFRARØD IMAGING SYSTEM (LI-COR) til at analysere resultaterne.

10. Statistiske analyser

Databehandling blev analyseret ved Origin 6.1 (OriginLab, Northampton, MA) og udtrykt som middel ± SD af mindst tre uafhængige eksperimenter. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af ANOVA. En værdi på p < 0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Cistanche tubulosa

DISKUSSION

Telmisartan er en selektiv AT1-receptorblokker, der er blevet brugt klinisk til at reducere forhøjet blodtryk og urinproteinudskillelse hos hypertensive patienter (Baden et al., 2008; Mann et al., 2009). Adskillige kliniske forsøg har antydet, at telmisartan er effektivt til at reducere proteinuri hos patienter med makroalbuminuri og forsinke indtræden og progression af diabetisk nefropati (Makino et al., 2005; Nakamura et al., 2010; Fujita et al., 2011; Schmieder et al. ., 2011). I denne undersøgelse forhindrede oral behandling med telmisartan hos STZ-inducerede diabetesrotter begyndelsen af ​​tidlige abnormiteter i nyrerne og generelt, herunder faldet i kropsvægt, blodsukker og urinprotein. Disse resultater bekræftede, at telmisartan har genbeskyttelse hos mus med diabetisk nefropati i tidlige stadier. Endnu vigtigere fandt denne undersøgelse, at telmisartans beskyttende virkning på diabetiske glomeruli blev afspejlet i de anti-apoptotiske og pro-apoptotiske virkninger på henholdsvis podocytter og mesangiale celler.

Avancerede glykeringsslutprodukter (AGE) kan forårsage podocyt-DNA-skade og løsrivelse delvist gennem stimulering af Ang II-AT1R-aksen, hvilket giver en innovativ fordelagtig egenskab ved telmisartan i DKD (Fukami et al., 2013). Ved normotensive, lavgradige proteinuriske glomerulære sygdomme dæmper behandling med telmisartan i det tidlige sygdomsstadium glomerulære og tubulointerstitielle skader (Villa et al., 2011). Og flere veje er sandsynligvis forbundet med de pleiotrope konsekvenser, herunder vækstfaktorsignalering, pattedyrmål for rapamycinsignalering, proteinubiquitinering, Wnt-beta catenin-vejen og hypoxisignalering (Villa et al., 2011).

For nylig rapporterede vi, at swiprosin-1 (Wang et al., 2018b), et andet navn for EF-hånddomæne indeholdende 2 (EFhd2), spillede en kritisk rolle i udviklingen af ​​DKD, der blev initieret efter induktionen, mens det lokaliserede i podocytter af mus glomerulus. Swiprosin-1 fravær forbedret mitokondrierafhængig podocytapoptose stimuleret af hyperglykæmi eller høj glukose gennem p38 MAPK-signalvejen. Her fandt vi også, at telmisartan hæmmede hyperglykæmi eller høj-glukose-induceret ekspression af swiprosin-1 både in vivo og in vitro, hvilket indikerede, at telmisartans anti-apoptose-effekt på podocytter kan være relateret til reguleringen af ​​swiprosin{10} {12}} udtryk.

Mesangial celleproliferation og overdreven aflejring af ekstracellulære matrixproteiner er blevet konstateret at bidrage til udviklingen af ​​DKD (Lee et al., 2004). Tidligere undersøgelser viste, at høj glucose kunne inducere ekspressionen af ​​mesangiale ekstracellulære matrixproteiner under hyperglykæmi (Taniguchi et al., 2013). -SMA bruges generelt til at differentiere mesangiale celler fra andre glomerulære celler i STZ-inducerede diabetesmus, og øget -SMA-ekspression kan være markøren for mesangiale cellers fænotypiske skift fra den ikke-aktiverede fase til den proliferative, sekretorisk aktiverede fase (Niu) et al., 2014). Her fandt vi, at telmisartan nedsatte -SMA-ekspression i den diabetiske glomerulus. Derudover er det blevet rapporteret, at mesangial celleproliferation har en betydelig indvirkning på patogenesen af ​​DKD (Zeng et al., 2013). Vores resultater i denne undersøgelse afspejlede den tids- og dosisafhængige undertrykte effekt af telmisartan på mesangial celleproliferation relateret til proapoptotiske egenskaber.

Klinisk evidens anbefaler, at telmisartan er mere effektivt end losartan til at lindre proteinuri hos hypertensive personer med DKD, hvilket kan være relateret til dets evne til delvist at agonisere PPAR (Bichu et al., 2009). Ydermere var disse gavnlige ændringer såsom forebyggelse af nyreatrofi og fibrose af telmisartan forbundet med et fald i ekspressionen af ​​TGF 1 og andre proinflammatoriske og profibrotiske cytokingener via PPAR/HGF-aktiveringen (Kusunoki et al., 2012), uafhængig af Ang II type 1-receptorblokade. Her fandt vi også telmisartan specifikt aktiveret PPAR-genekspression i mesangiale celler, og den pro-apoptotiske effekt forårsaget af telmisartan til mesangiale celler kunne lindres af PPAR-hæmmere.

PKC 1 er en af ​​de ekstensivt udtrykte familier af serin-threoninkinaser, der transducerer en bred vifte af cellulære progressioner ved substratspecifik phosphorylering (Newton, 1995). Det er blevet rapporteret, at ikke kun øget PKC-aktivitet, men også dets mRNA-niveauer observeres i humane diabetiske nefropatibiopsier (Langham et al., 2008). Hyperglykæmi-induceret PKC-ekspression og aktivering har pleiotropiske virkninger i mesangiale celler, herunder fremme af overdreven akkumulering af ECM-proteiner (Brownlee, 2001). Undersøgelser har vist, at inhibering af PKC dæmper glomerulær hypercellularitet og ekstracellulær matrixudvidelse i db/db mus og glomerulær dysfunktion hos STZ-rotter (Ishii et al., 1996; Koya et al., 2000). Ligeledes svækkede PKC-hæmmer blodplade-afledt vækstfaktor (PDGF)-drevet mesangial celleproliferation og kollagenproduktion (Tokuyama et al., 2011). I vores undersøgelse reducerede telmisartan opreguleringen af ​​PKC 1 mRNA og proteinekspression i hyperglykæmi-stimulerede mesangiale celler. Derudover kunne TGF 1-ekspression i mesangiale celler induceret af høj glucose også hæmmes af telmisartan.

Både AT1- og AT2-receptorer, velkendt som syv transmembranspændende G-proteinkoblede receptorer, er blevet klonet og farmakologisk illustreret (Touyz og Berry, 2002). AT1-receptorerne kan antagoniseres selektivt af telmisartan, mens AT1-receptorblokkerne kan inducere ekspressionen af ​​AT2-receptorer (Touyz og Berry, 2002). Undersøgelser har vist, at AT1-receptorer udøver deres indflydelse ved at begrænse cellevækst og ved at fremkalde apoptose (Horiuchi et al., 1997; Touyz et al., 1999). Desuden inducerer AT2-receptorer celleapoptose i en specifik konformation gennem p38 MAPK-medieret apoptotisk signalering (Miura og Karnik, 2000). I vores nuværende papir var ekspression af AT1 og AT2 mRNA uændret i dyrkede mesangiale celler stimuleret med telmisartan eller hyperglykæmi. Derfor kan telmisartan-induceret mesangial celleapoptose og nedsat ekspression af PKC 1 muligvis ikke medieres af AT1- og AT2-receptorer.

Cistanche kapsler

Som konklusion svækkede telmisartan tidlig glomerulær skade hos type 1-diabetiske rotter ved at hæmme podocytapoptose og fremme mesangial apoptose. Telmisartans antiapoptotiske virkning i podocytter kan være relateret til dets hæmning af swiprosin-1-ekspression, i mellemtiden var den proapoptotiske effekt på mesangiale celler delvist forbundet med dets agonistiske effekt på PPAR. Derudover blokerede telmisartan selektivt ekspressionen af ​​PKC 1/TGF 1 i mesangiale celler, men ikke i podocytter. Avancerede undersøgelser er nødvendige for at belyse de modsatte, men gavnlige virkninger af telmisartan på podocytter og mesangiale celler og de underliggende molekylære mekanismer.

Xin Wei 1, Yabin Ma2, Ya Li 3, Wenzhao Zhang4, Yuting Zhong5, Yue Yu6, Li-Chao Zhang5, Zhibin Wang4 og Ye Tu2

1 Afdeling for klinisk farmaci, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai, Kina,

2 Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University, Shanghai, Kina,

3 Department of Clinical Pharmacy, Clinical Trial Center, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University og Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, Jinan, Kina,

4 Institut for Critical Care Medicine, School of Aesthesiology, Naval Medical University, Shanghai, Kina,

5 Department of Pharmacy, Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, Kina,

6 Institute of Vascular Disease, Shanghai TCM-Integrated Hospital, Shanghai, Kina