Tetrahymena Thermophila blev brugt som det eksperimentelle materiale

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

I dette eksperiment blev Tetrahymena thermophila brugt som forsøgsmateriale. T. thermophila er et fritlevende ciliat, der findes bredt i globale akvatiske økosystemer og ligner metazo-celler i struktur og funktionel kompleksitetl5. Opdagelsen af ​​ribozynnel6 og telomerasel7 i Tetrahymena gav et stort løft i forskningen i anti-aldringsmekanismer, som blev belønnet med to Nobelpriser18. På grund af sin korte vækstcyklus, lette kultur og klare genetiske baggrund, T. termofil kunne give dobbelt forskning in vivo og in vitro i et eksperimentelt design. T. thermophila er med succes blevet brugt til lægemiddelscreening og farmakologiske mekanismer20. Endnu vigtigere er information om den molekylære udvikling af T. thermophila glutathionperoxidasefamilien blevet afsløret9-2. Informationsprofilen for T.cistanche genghis khanthermophila GPX-gener kan fås fra Tetrahymena Functional Genomics Database(TetraFGD)(http://tfgd.ihb.ac.cn/) og TGD(http://ww. ciliate.org)22.Ti af de tolv formodede GPX er blevet identificeret som fosfolipidhydroperoxidglutathionperoxidase (PHGPx) i Tetrahymena-genomets komparative database. PHP, en selenafhængig GPX, kan specifikt reducere phospholipidhydroperoxid for at beskytte lecithinliposomer og biofilm mod oxidativ skade23.PHGPxin T. thermophila har en gennemsnitlig molekylmasse på ca. 21,7 kDa22, hvilket svarer til molekylmassen (20-22 kDa) af PHGPx-monomerproteinet beskrevet i pattedyr24. Desuden viste et stort antal rapporter, at GPX-ekspressionen af ​​Tthermophila var kvantitativt forskellig og afhængig af stresskilden (oxidant, apoptoseinducer eller metal)2122 og eksponeringstid20-24

Klik venligst her for at vide mere

Ved at sammenligne virkningerne af det vandige ekstrakt og hovedmonomerer af G. lucidum på vækstkurven og den maksimale tæthed af T. thermophila, opnåede denne undersøgelse den bedste anti-aging G. lucidum-ekstrakt. Anti-aldringsmekanismen for G. lucidum, især bestemmelsen af ​​virkningstypen af ​​GPX-familien, blev undersøgt på molekylært, cellulært og individuelt niveau. Resultaterne af denne undersøgelse forventes at bidrage til klinisk anvendelse af G. lucidum-produkter.

Materialer og metoder

Ganoderma lucidum vandigt ekstrakt og monomerer. Med henvisning til rapporten om Cuong blev 25,20 g tørret G. lucidum (Changbai Mountain Senbao Specialty Store, Jilin) ​​formalet og ekstraheret i 1000 ml ddHO. Den vandige ekstrakt blev opsamlet ved centrifugering, koncentreret til 100 ml ved vakuumtørring og opbevaret ved -20 grad indtil brug.

G. lucidum polysaccharid, Ganoderic Acid A, Ganoderal A og G. lucidum ergosterol blev købt fra Chengdu Must Biotechnology Co.,Ltd. Disse tre standarder blev opløst i methanol i overensstemmelse med det ensartede design og tilsat til SPP-medium. Cellekultur og lægemiddelbehandling. Tetrahymenathermophila (SB210) blev leveret af Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, IPR Kina. T. thermophila blev dyrket i en 28 graders inkubator. SPP-mediet indeholdt 2 procent (vægt/volumen) proteosepepton, 0,1 procent gærekstrakt (Oxoid),0,2 procent glucose og 0,003 procent sekvestren. Ifølge det ensartede design (Supplerende tabeller S1 og S2), G. lucidum vandig ekstrakt,G. lucidum polysaccharid, ganodersyre A, ganoderal A og G. lucidum ergosterol blev tilsat til dyrkningsmediet. Kontrolgruppen blev erstattet af den samme mængde dobbeltdestilleret vand med 3 parallelle prøver i hver gruppe. Efter at have gået ind i den logaritmiske fase, blev prøver taget hver 2. time indtil faldfasen. Tætheden af ​​T. thermophila blev talt ved hjælp af blodcelletællingstavlen, og forholdet mellem tætheden af ​​T. thermophila og tiden blev tegnet.

Transskriptionel analyse. Eksperimentet blev udført med en 24-brøndplade, og hver brønd bestod af 900 μL SPP. I forsøgsgruppen blev 100 μL 200 mg/ml G. lucidum vandigt ekstrakt tilsat. Kontrolgruppen blev behandlet med 100 μL ddH O i stedet. Tre parallelle prøver blev sat i hver gruppe.cistanche levetid forlængelseKontrolgruppen og den eksperimentelle gruppe var begge i logaritmisk fase (20 timer), og faldfasen (27 timer) blev indsamlet til den transkriptomiske analyse. Hver gruppe blev biologisk duplikeret, og alle prøver blev udsat for et hel-transkript mikroarray-assay (Biomarker Technologies, Beijing, Kina). Genekspressionsprofilen blev detekteret af en Affymetrix 3'IVT Expression Array For at reducere virkningen af ​​ekspressionen af ​​værdigener blev RPKM større end eller lig med 5 og FC(Fold Change) større end eller lig med 2 brugt som kriterier for screening differentielt udtrykte gener (DEGs)KOBAS blev brugt til at realisere stianalysen af ​​GeneOntology (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Berigelsesvejen blev bestemt af den korrigerede P-adj-værdi mindre end eller lig med 0,05. Transkriptomresultaterne blev verificeret ved hjælp af kvantitativ revers transkriptions-PCR(RT-qPCR)(metode se supplerende fil). Derefter blev protein-protein interaktion (PPI) netværket etableret baseret på STRING databasen, og det centrale gen blev screenet ved at bruge CytoHubla til at identificere den centrale knude i Cytoscape software.

Sølvfarvning og transmissionselektronmikroskopi (TEM) observation. Fremgangsmåden med sølvfarvning var ifølge Foissners metode26. thermophila blev observeret under et oliemikroskop. Ultrastrukturen af ​​T. thermophila blev observeret ved TEM. Cellerne behandlet med G. lucidum vandigt ekstrakt og kontrolgruppen blev opsamlet ved centrifugering ved 600 xg i 2 min. Celler blev præfikseret i 2,5 procent glutaraldehyd og holdt ved 4 grader i 8 timer. Prøverne blev vasket med PBS (pH 7,5) tre gange, centrifugeret ved 3000 xg i 5 minutter og derefter fikseret med 1 procent osmiumtetraoxid (4 timer). Derefter blev dehydrering udført under anvendelse af gradient acetone på 15 procent til 100 procent. Derefter blev cellerne indlejret i Embed 812(TAAB) lavviskositetsharpiks. Efter hærdning blev ultratynde sektioner (60-80 nm) skåret af en ultratynd skæremaskine. Ultrastrukturen blev observeret med transmissionselektronmikroskop (JEOL JEM-1010, Japan).

Bestemmelse af celleskade. Intracellulær lROS blev detekteret af den følsomme fluorescerende probe 2',7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat(DCFH-DA)27. Aktiviteten af ​​malondialdehyd (MDA) blev bestemt af kommercielle kits leveret af Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Jiangsu, Kina). Metoden til at bestemme evnen til at eliminere hydroxylradikaler (·OH) var som beskrevet af Takemura28. Evnen af ​​det vandige G. lucidum-ekstrakt til at eliminere OH-frit radikal blev udtrykt som den optiske densitet af den eksperimentelle gruppe minus den optiske densitet af kontrolgruppen.

Cistanche kan anti-aging

PHGPx aktivitet. Nikotinamid-adenindinukleotidphosphat (NADPH)/NADP*-forhold og glutathion/glutathion-disulfid (GSH/GSSG)-forhold blev bestemt ved hjælp af NADP*/NADPH-kvantificeringskit (S0179, Beyotime),GSH/GSSG-assaykit (S0053, Beyotime). analyser blev udført i overensstemmelse med producentens protokol.

Resultater

Virkningerne af G. lucidum vandig ekstrakt og G. lucidum monomerer på væksten af ​​T. ther-mochila. Som tidligere undersøgelser7, G. lucidum polysaccharid var hovedbestanddelen af ​​G. lucidum vandig ekstrakt i dette eksperiment ifølge spektrofotometer identifikation (Supplerende Fig. S1). De aktive stoffer i G. lucidum vandig ekstrakt blev også analyseret ved GC-MS. Det samlede iondiagram af den vandige G. lucidum-ekstrakt viste, at ll komponenter eksisterede i den vandige ekstrakt (Supplerende Fig. S2). Blandt forbindelserne af det vandige G.lucidum-ekstrakt (Supplerende tabeller S3 og S4), G. lucidum acid A, Ganoderal A og G. lucidum ergosterol blev udvalgt i henhold til deres retentionstid og matchningsgrad.

For at sammenligne virkningerne af G. lucidum vandig ekstrakt og disse hovedmonomerer på væksten af ​​T. thermophila, blev den vandige G. lucidum ekstrakt og G. lucidum monomeropløsning tilsat til dyrkningsmediet af T. thermophila. Resultaterne blev vist i fig. 1. Den maksimale tæthed af kontrolgruppen var 6 x 104 celler/ml efter 24 timer. Celletætheden af ​​G. lucidum vandige ekstraktgruppen fra 12 til 20 timer var næsten den samme som for kontrolgruppen, men fra 20 til 25 timer var den signifikant højere end celletætheden i kontrolgruppen.cistanche nzSamtidig blev den logaritmiske fase forlænget med 1 time, den maksimale tæthed var 1,15 × 105 celler/ml. Selvom den maksimale densitet af G. lucidum polysaccharidgruppen var højere end den for kontrolgruppen med 9,7 x 104 celler/ml, var den lavere end G. lucidum vandige ekstraktgruppen. Den maksimale densitet af G. lucidum acid A, Ganoderal A og G. lucidum ergosterol oversteg ikke kontrolgruppens, hvilket viste, at alkoholopløste stoffer i disse monomerer ikke var befordrende for væksten af ​​T. thermophila. Det kunne konkluderes, at det vandige G.lucidum-ekstrakt indeholdende en række aktive stoffer kan fremme væksten af ​​T. thermophila mere end dets monomerer.

Anti-aging effekt af G. lucidum vandige ekstrakt. Med stigende dyrkningstid var lysintensiteten af ​​ROS i faldfasen (fig. 2b) højere end den i den logaritmiske fase (fig. 2a). Efter tilsætning af det vandige G. lucidum-ekstrakt, selvom fluorescensintensiteten af ​​faldfasen (fig. 2d) stadig var forbedret sammenlignet med den for den logaritmiske fase (fig. 2c), var den signifikant lavere end kontrolgruppens. MDA-indholdet i kontrolgruppen var også højere i faldfasen end i den logaritmiske fase (Fig.2e). I mellemtiden var opfangningsevnen for OH i faldfasen lavere end i den logaritmiske fase (fig. 2e). Balancen mellem oxidation og reduktion gik tabt, og kroppen ældes. Efter tilsætning af det vandige G. lucidum-ekstrakt var MDA-indholdet lavere end i kontrolgruppen (venstre søjle i fig. 2e), og mængden af ​​OH, som blev fjernet af celler i den logaritmiske fase og faldfasen, var højere end i kontrolgruppe (højre kolonne i fig. 2e). Væksten af ​​T[ thermophila kan sammenlignes med ældningsprocessen for flercellede organismer gennem dens cellulære skade. Efterhånden som ROS og MDA akkumulerede, blev væksten hæmmet, og tætheden af ​​T. thermophila blev reduceret. Tilsætning af G. lucidum vandig ekstrakt kunne opretholde redoxbalancen i T. thermophila og opnå anti-aldringseffekter.

Analyse af differentielt udtrykte gener og verifikation ved RT-qPCR. Sammenlignet med kontrolgruppen ændrede ekspressionen af ​​11.519 gener i den logaritmiske fase af T. thermophila sig signifikant efter tilsætning af G. lucidum vandig ekstrakt til SPP. Blandt dem blev 6201 gener opreguleret og 5318 gener blev nedreguleret.cistanche penis størrelseEkspressionen af ​​8772 gener ændrede sig betydeligt under nedgangsfasen, blandt hvilke 4721 gener blev opreguleret og 4051 gener blev nedreguleret. I tidligere undersøgelser i vores laboratorium har

anti-aldringseffekt af G.lucidum på Stylonychia blev afspejlet i antioxidantindekset, så 10 gener (Supplerende Tabel S5) relateret til antioxidanter blev tilfældigt udvalgt blandt DEG'erne, og nøjagtigheden af ​​RNA-seq-dataene blev verificeret af RT- qPCR. Ekspressionsmønstrene for disse 10 gener i den logaritmiske fase og faldfasen var i overensstemmelse med tendensen for RNA-seq-dataene (Supplerende Fig. S3). Resultatet indikerede, at RNA-seq-dataene var pålidelige og kunne bruges til efterfølgende analyse.

GO berigelse og KEGG pathway analyser. DEG'erne i den logaritmiske fase var involveret i 14 biologiske processer (BP) med 6 typer molekylære funktioner (MF), og de eksisterede i alle cellekomponenter (CC) (fig. 3a). DEG'erne i nedgangsfasen var involveret i 12 BP med 4 slags MF, og de eksisterede i 12 CC. Det mest involverede BP i de to faser var den metaboliske proces, MF var bindende, og CC var membran. Blandt den metaboliske proces, binding og membran, udgjorde de opregulerede gener 70 procent i den logaritmiske fase (fig. 3b) og 75 procent i nedgangsfasen (fig. 3c). Disse resultater viser, at det vandige G. lucidum-ekstrakt kunne fremme opretholdelsen af ​​cellemembranintegritet i begge faser.

KEGG pathway berigelsesanalyse blev udført for yderligere at analysere DEG'erne mellem de to faser. I den logaritmiske fase var 94 veje koncentreret, blandt hvilke 68 procent af de samlede gener var involveret i stofskiftet. I nedgangsfasen blev 91 veje beriget, blandt hvilke stofskiftet stadig var den største vej, der tegnede sig for 68 procent. De øverste 20 veje i den logaritmiske fase (fig. 3d) og faldfasen (fig. 3e) blev brugt til at tegne et boblediagram og viste, at uanset betydningen eller antallet af involverede gener, var effekten af ​​G.cistanche pulverlucidum vandigt ekstrakt primært fokuseret på glutathionmetabolismevejen. I den logaritmiske fase blev 38 differentielt udtrykte gener beriget i denne vej, hvilket tegner sig for 45 procent. I nedgangsfasen blev 43 differentielt udtrykte gener beriget i denne vej, hvilket tegner sig for 50 procent.

Protein-protein interaktion (PPI) netværk af DEG'er. Belysningen af ​​DEG'er i glutathionmetabolismevejen og indsigt i deres interaktioner med andre proteiner vil hjælpe med at udforske den potentielle reguleringsmekanisme af G. lucidum vandigt ekstrakt yderligere. Både den logaritmiske fase (fig. 4a) og faldfasen (fig. 4b) havde de vigtigste effekter på GPX1, GPX2, GPX7 og GPX11. Gennem forespørgslen fra TetraFGD-databasen tilhørte disse GPX-enzymer PHGPx (Supplerende tabel S6). Derfor spiller antioxidantenzymer, især PHGPx, en vigtig rolle i at fremme væksten af ​​T. thermophila via inducering af G. lucidum vandigt ekstrakt.

GPS aktivitet og funktion verifikation. Aktiviteten af ​​PHGPx refererer til hastigheden af ​​NADPH-absorptionsfald2". NADPH/NADP*-værdien i kontrolgruppens faldfase var lavere end i den logaritmiske fase (fig. 5a). Resultatet antydede, at aktiviteten af ​​PHGPx faldt med stigningen i dyrkningstiden. Efter tilsætning af G. lucidum vandigt ekstrakt var NADPH/NADP plus-værdien i faldfasen stadig lavere end i den logaritmiske fase, men højere end begge faser i kontrolgruppen. Dette resultat indikerede, at det vandige G.lucidum-ekstrakt kunne fremme aktiviteten af ​​PHGPx.

PHP kan specifikt katalysere reduktionen af ​​phospholipidhydroperoxid ved reduceret glutathion (GSH), for effektivt at omdanne toksisk lipidperoxid (PL-PUFA-OOH) til ikke-toksiske flerumættede fedtsyrer (PL-PUFA-OH)30. Ændringen af ​​GSH/GSSH-forholdet kan afspejle ændringen af ​​PL-PUFA-OOH og PL-PUFA-OH På grund af faldet i PHGPx-aktivitet (fig. 5a), faldt forholdet mellem GSH/GSSH i kontrolgruppen også med stigningen af ​​dyrkningstid (fig. 5b). Efter tilsætning af G. lucidum vandig ekstrakt blev forholdet mellem GSH/GSSH imidlertid forøget i den logaritmiske fase og nedgangsfasen. Den intracellulære toksiske PL-PUFA-OOH i forsøgsgruppen blev transformeret til ikke-toksisk PL-PUFA-OH, hvilket var mere end kontrolgruppens. Observation af mikroskopisk morfologi og ultrastruktur. Den beskyttende virkning af G. Luci-dum vandig ekstrakt på membranen blev visualiseret ved ammoniaksølvfarvning og TEM. Ved at sammenligne den logaritmiske fase af kontrolgruppen (fig. 6a) og tilbagegangsfasen for kontrolgruppen (fig. 6c), blev det fundet, at cellemorfologien af ​​T. thermophila blev alvorligt deformeret med forlængelse af dyrkningstiden, og kernen var sløret, hvilket indikerer, at cellerne så ud til at være i en aldrende tilstand. I G. lucidum-vandekstraktgruppen var cellernes morfologi og integritet imidlertid godt beskyttet i den logaritmiske fase (fig. 6e) og faldfasen (fig. 6g). Ultrastrukturelle ændringer i cellerne blev observeret ved TEM. Ryggen og konturen af ​​mitokondrie var sløret i faldfasen (fig. 6d) sammenlignet med den logaritmiske fase (fig. 6b) i kontrolgruppen. Mitokondriernes henfald steg med forlængelsen af ​​kulturtiden. Tilsætningen af ​​G. lucidum vandig ekstrakt forbedrede morfologien af ​​mitokondrierne i den logaritmiske fase (fig. 6f) og faldfasen (fig. 6h). G. lucidum vandigt ekstrakt garanterede mitokondriers funktion, som er tæt forbundet med membranens integritet. Det skal bemærkes, at mitokondrierne i forsøgsgruppen i den logaritmiske fase viste morfologiske ændringer (fig. 6f, h), men membranens integritet blev ikke påvirket.

Diskussion

Anvendelsen af ​​G.lucidum-ekstrakter har en lang historie både i traditionel kinesisk medicin og Østasien. Et stort antal undersøgelser har vist deres effektivitet. Tidligere rapporter viste, at G. lucidum vandigt ekstrakt indeholdt ikke kun G. lucidum polysaccharider, men også Glucidum triterpenoider. Ifølge tidligere rapporter er Ganoderma-syre, Ganoderma-aldehyd og Ganoderma ergosterol hovedingredienserne i G. lucidum triterpene 3. De virker med forskellige reparationsfunktioner for celler (tabel 1). Ganoderma lucidum vandig ekstrakt indeholder en række aktive stoffer, der integrerer funktionerne af de andre fire aktive stoffer, som ikke kun kan modstå oxidation, men også bevarer membranintegriteten. I dette studie,

vækstfremmende af det vandige G. lucidum-ekstrakt på T. thermophila bekræftede dette inklusionsforhold. Gennem analysen af ​​G. lucidum vandigt ekstrakt ved total-ion flow kromatografi (Supplerende Fig. S2) kunne det konstateres, at opløsningstiden for forskellige aktive stoffer var forskellig. Så det vandige G. lucidum-ekstrakt bliver et komplekst organisk opløsningsmiddel med forlængelse af kogetiden. Vi tror, ​​at de aktive stoffer i det vandige G.lucidum-ekstrakt kan virke på forskellige tidspunkter, hvilket resulterer i en synergi. Dette bør være en yderligere undersøgelse i fremtiden.

Analysen af ​​T. thermophila-transkriptom undersøgte virkningen af ​​G. lucidum-vandekstrakt på genekspression under vækst. Efter behandling med G. lucidum vandigt ekstrakt, viste PHGPx sig at være en vigtig indflydelse på celletæthed og generationstid. Dette resultat bekræftede, at det vandige G.lucidum-ekstrakt virkede på den selenafhængige type GPX-familie. PHP er et multifunktionelt seleno-protein, som er vidt udbredt i kroppen, og som ikke kun kan deltage i antioxidantreaktioner, men også direkte reducerer lipiderne i membranen for at beskytte membransystemets integritet40. Sammenlignet med andre GPX'er har PHGPx et mindre volumen og større hydrofobicitet. Mange rapporter har vist, at PHGPx-overekspression i celler kan modstå cellerespons på endogen (f.eks. aldring) fl og eksogene (f.eks. miljømæssige) peroxidationsskader 2-45.PHP er det eneste enzym, der direkte kan reducere PL-PUFA- OOH af membranen ind i de tilsvarende hydroxylforbindelser, hvilket muliggør terminering af peroxidation og beskytter den biologiske membran mod peroxidationsskader4647. Stigningen i indholdet af PL-PUFA-OOH var årsagen til beskadigelsen af ​​cellemembranen i kontrolgruppen under nedgangsfasen, som blev en ond cirkel og accelererede celleældning. I denne undersøgelse er indholdet af ROS og MDA (Fig. 2) af T.thermophila i kontrolgruppen steg med stigningen i dyrkningstiden. Membranen viste sig at være alvorlig deformation i faldfasen gennem den morfologiske observation. Når G. lucidun vandigt ekstrakt blev tilsat, blev ekspressionen af ​​PHGPx imidlertid opreguleret. Således blev PL-PUFA-OOH på membranen transformeret til ikke-toksisk PL-PUFA-OH, og stabiliteten af ​​membranstrukturen forbedres både i den logaritmiske fase og i faldfasen. Ifølge observationen af ​​membranen ved ammoniaksølvfarvning og TEM kunne det konkluderes, at det vandige G.lucidum-ekstrakt trængte ind i cellemembranen under vækstprocessen. Denne reparationseffekt på cellemembranen kunne få de aktive stoffer i det vandige G. lucidum-ekstrakt til at trænge ind i cytoplasmaet og beskytte membranstrukturen af ​​kernen og mitokondrierne for at fremme metabolismen af ​​T. thermophila og opnå anti-aldringseffekter. Som resultaterne af lKEGG-berigelsen viser, er et stort antal differentielle gener koncentreret i de metaboliske veje. Disse resultater indikerede, at det vandige G. lucidum-ekstrakt var gavnligt for metabolismen af ​​glutathion og elimineringen af ​​toksiske peroxider produceret ved celleældning.

Generelt fremmede det vandige G. lucidum-ekstrakt ekspressionen af ​​det selenafhængige enzym PHGPx i GPX-familien. Forøgelsen af ​​PHGPx-aktivitet kunne ikke kun reducere det oxidative stressrespons in vivo, men også specifikt og effektivt reducere lipidaflejringen af ​​den biologiske membran og opretholde membranens integritet (fig. 7). Følgelig trænger de aktive stoffer i det vandige G. lucidum-ekstrakt ind i cellerne gennem den intakte membran og fremmer deres stofskifte. Dette skabte en god cyklus for at opnå effekten af ​​anti-aging.

Denne artikel er uddraget fra Scientifc Reports|(2022) 12:3139|https://doi.org/10.1038/s41598-022-06985-z