Målidentifikation og mekanismeanalyse for makrofagaktivering af lavmolekylære sakkarider fra Cistanche Deserticola baseret på molekylær affinitetskromatografi

[Abstrakt]Denne undersøgelse har til formål at undersøge de mål og mål-involverede mekanismer for makrofagaktivering af lavmolekylære saccharider fra Cistanche deserticola (LMSC). Den fagocytiske aktivitet og NO-frigivelse af RAW264. 7 celler blev påvist, og resultaterne viste, at LMSC udøver immunaktiveringseffekt ved at øge den fagocytiske aktivitet og NO-frigivelse signifikant. LMSC-konjugerede epoxy-aktiverede sepharose-perler blev fremstillet som affinitetsreagens for at fange målproteinerne. Fireogtyve proteiner såsom Eef2 blev identificeret ved LC-MS/MS-analyse. Pathway berigelse analyse viste LMSC aktiveret RAW264. 7 celler ved at regulere Fcgamma-receptorafhængig fagocytose, TNF-alfa NF-KB signalvej, glykolyse/gluconeogenese og citronsyrecyklus og respiratorisk elektrontransportvej.

［Nøgleord］Cistanche deserticola; lavmolekylære saccharider; makrofagaktivering; molekylær affinitetskromatografi; mål identifikation; mekanisme analyse

Ørken ginseng

Cistanches Herba er en berømt traditionel kinesisk medicin til tonificering af nyrer og yang, gavner essens og blod og nærer tarme og afføring. Det er kendt som "ørkenginseng". Moderne analytisk kemiforskning viser, at Cistanche deserticola indeholder en række kulhydratkomponenter, herunder monosaccharidforbindelser, hovedsageligt inklusive fructose, oligosaccharidforbindelser såsom saccharose og polysaccharider såsom ACDP-2, som er effektive stoffer for Cistanche deserticola til at spille roller i immunregulering, afføring osv. [2-5]. Cistanche deserticola polysaccharider er blevet rapporteret bredt som en klasse af aktive ingredienser med immunmodulerende virkninger, mens lavmolekylære sukkerarter (LMSC'er) såsom oligosaccharider og monosaccharider sjældent er blevet undersøgt. En undersøgelse foretaget af vores forskergruppe om makrofagaktivering af de vigtigste aktive komponenter i Cistanche deserticola viste, at lavmolekylært sukker er en type aktiv komponent med makrofagaktivering, men dens immunaktiveringsmål og virkningsmekanisme er stadig uklare.

Virkninger af Cistanche - Forbedre immunitet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Molekylær affinitetskromatografi er en kromatografisk metode, der opnår adskillelse og oprensning af målmolekyler ved specifikt at binde dem til en stationær fase [6]. Denne metode har høj affinitet og specificitet og er særligt velegnet til komplekse organiske systemer med ekstremt lave målproduktkoncentrationer [7]. I de senere år har det gradvist udviklet sig til et stærkt værktøj til at identificere naturlige lægemiddelmål. I denne undersøgelse blev småmolekyle-målproteinindfangningsteknologi baseret på molekylær affinitetskromatografi brugt til at identificere LMSC-målproteiner med makrofagaktivering. Gennem bioinformatikanalyse opnås den signalregulerende vejinformation for målgruppen for at udforske den immunregulerende aktivitet og relaterede mekanismer af LMSC.

1 Materiale

1.1 Celler

Musemakrofaglinje RAW264 7 Købt fra Cell Center of Chinese Academy of Medical Sciences.

1.2 Lægemidler og reagenser

Føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra PAN Biotech i Tyskland; Antibiotika, DMEM højt sukkermedium og 6 × Proteinprøveudtagningsbufferen blev købt fra Zhongke Maichen Technology Co., Ltd. Sukkeret med lav molekylvægt fra Cistanche deserticola blev selvfremstillet af vores forskningsgruppe og bestemt ved HPLC til hovedsageligt at indeholde mannitol ( 16 53 procent ), saccharose (8 34 procent ), Fructose (25 38 procent ), glucose (7 75 procent ) og andre monomere komponenter. Lipopolysaccharid fra Escherichia coli O55: B5, LPS, 3 - (4,5-dimethylthiazol-2) - 2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) og {{ 14}} procent neutral rød opløsning blev købt fra Sigma Aldrich i USA. Nitrogenoxid (NO) reagenssættet blev købt fra Nanjing Jiancheng Biotechnology Research Institute. Epoxy-aktiveret Sepharose gel (6B) blev købt fra GE Healthcare i Sverige. Det hurtige sølvfarvningssæt blev købt fra Biyuntian Biotechnology Research Institute. Både myresyre og acetonitril til massespektrometri blev købt fra Thermo Fisher Scientific i USA. Alle andre reagenser er indenlandske analytiske rene.

Cistanche pulver

1.3 Instrumenter

CO2-celle-inkubator (SANYO, Japan); CIX100 mikroskop (Olympus Corporation, Japan); 5424R centrifuge (Eppendorf, Tyskland); Automatisk vandrenser (Millipore, USA); Sunrise Basic ELISA (TECAN, Schweiz); THZ-C desktop konstant temperatur oscillator (Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd.); EAS Y-nLC - II væskekromatografer (Thermo Fisher Scientific, USA); LTQ-Orbitrap ionfælde tandem massespektrometri (Thermo Fisher Scientific, USA); Kapillær væskekromatografisøjle (Michrom Bioresources, USA).

2 metoder

2.1 Cellekultur og administration

RAW264. 7 celler blev dyrket i DMEM-højglucosemedium indeholdende 10 procent føtalt bovint serum og 1 procent dobbelt antistof og anbragt i en 37 graders mættet fugtighedskonstant temperaturinkubator indeholdende 5 procent CO2. Bestå en gang hver 2-3 dag, og udfør eksperimenter, når cellerne går ind i den logaritmiske vækstfase. Opdel celler i blank gruppe, lipopolysaccharidgruppe eller lavmolekylær sukkergruppe af Cistanche deserticola. LPS-gruppeceller blev behandlet med 1 mg · L-1 LPS-opløsning som en positiv kontrol; LMSC-gruppeceller blev tilsat LMSC-opløsninger med forskellige massekoncentrationer (0 25,0. 5,1,2 g·L - 1; Filtrer med en filtermembran før administration); Tilføj en lige stor mængde serumfrit dyrkningsmedium til de tomme gruppeceller.

2.2 Bestemmelse af makrofag fagocytisk aktivitet ved hjælp af neutral rød metode

RAW264. 7 celler blev podet på en 96-brøndplade og dyrket natten over, før de blev erstattet med serumfrit medium eller serumfrit medium indeholdende LPS eller forskellige koncentrationer af LMSC. Efter 48 timers dyrkning blev cellerne erstattet med 0 075 procent neutral rød opløsning og fortsat inkuberet ved 37 grader i 4 timer. Absorber og kassér supernatanten, vask to gange med PBS, og brug cellelyseopløsning (iseddikesyreethanol 1:1) til at lysere celler ved 4 grader. Efter fuldstændig lysis måles absorbansen af ​​hver brønd (A540 nm).

2.3 Påvisning af NO-frigivelse i cellesupernatant

RAW264. 7 celler blev podet på en 48-brøndplade og dyrket natten over, før de blev erstattet med serumfrit medium eller serumfrit medium indeholdende LPS eller forskellige koncentrationer af LMSC. Efter 24 timers induktionskultur, opsaml supernatanten og mål NO-indholdet i supernatanten af ​​hver god celle i henhold til instruktionerne i reagenssættet.

2.4 MTT-assay for makrofaglevedygtighed

RAW264. 7 celler blev inokuleret på en 96-brøndplade, og efter dyrkning natten over blev de erstattet med serumfrit medium eller serumfrit medium indeholdende LPS eller forskellige koncentrationer af LMSC og fortsatte med at blive dyrket i 24 timer. Udskift hver god celle med 0 Inkuber 5 g · L-1 MTT-opløsning ved 37 grader C i 4 timer, opløs derefter MTT-reaktionsproduktet med dimethylsulfoxid, og mål absorbansen af ​​hver brønd ved en bølgelængde på 570 nm under anvendelse af et enzym-linked immunosorbent assay.

Fremstilling af 2,5 Cistanche deserticola medium med lav molekylær sukkeraffinitet

Referencemetode [8], vej epoxyaktiveret agaroseharpiks 0 5 g, opløs det i deioniseret vand i 40 min, centrifuger og kasser supernatanten, og gentag processen tre gange for at gøre gelen helt hævet (dets volumen er ca. 1 ml), til standby. Tag 0 Bland 5 mL kvældet epoxyaktiveret agarosegel med 1 mL LMSC-opløsning (1 g · mL − 1) eller et tilsvarende volumen opløsningsmiddel, og inkuber i en konstant temperaturryster ved 37 grader natten over. Vask det blanke eller LMSC-koblede agarosemedium flere gange med deioniseret vand, indtil supernatanten er farveløs, tilsæt derefter 1 ml ethanolaminopløsning (1 mol · L-1) og forsegl det på et rystebord med konstant temperatur ved 37 grader i 2 dage. Efter at reaktionen er afsluttet, rengøres 5 gange hver med dobbeltdestilleret vand, NaCl Hac-buffer og NaCl Tris HCl-buffer, og til sidst bruges 0 Vask to gange med 01 procent NP40-eluent som backup.

2.6 Berigelse og identifikation af målgrupper

Til RAW264 Total proteinekstrakt fra 7 celler (0 Tilføj 50 til 5 g · L-1 henholdsvis μL blankt medium eller LMSC affinitetsmedium, som en tom kontrolgruppe og LMSC bindingsgruppe ; Opret en konkurrerende gruppe, der samtidigt tilføjer LMSC-opløsning og LMSC-affinitetsmedium. Efter blanding af hver gruppe inkuberes ved 4 grader natten over for fuldt ud at binde LMSC til målproteinet. Efter reaktionen, brug 0 Vask affinitetsmediet 6 gange med en 01 procent NP40-eluent for at fjerne resterende frie proteiner fra affinitetsmediet. Tilsæt vasket affinitetsmedium til et lige så stort volumen af ​​2 x prøvebelastningsbuffer, denatureret ved 98 grader i 8 minutter for at dissociere bindingsproteinet. Sug supernatanten, udfør SDS-PAGE gel elektroforese, og udfør derefter sølvfarvningsanalyse i henhold til instruktionerne i sættet.

2.7 LC-MS/MS metode til identifikation af målproteingrupper

Referencemetode [8] blev brugt til at identificere specifikke bindingsproteiner ved hjælp af en todimensionel nano HPLC-LTQ-Orbitrap/MS tandem lineær ionfælde massespektrometri (nano HPLC-LTQ-Orbitrap/MS). Den specifikke metode er som følger: For det første bruges trypsin til at hydrolysere de differentielt udtrykte proteinbånd i gelen for at opnå en blanding af målpeptidsegmenter. Peptidblandingen blev udsat for 0 22 μ Efter filtrering med en mikroporøs membran ekstraheres 10 procent μ. Tilsæt L prøveopløsning til kapillærvæskekromatografikolonnen. Kromatografiske forhold: mobil fase 0 1 procent vandig myresyreopløsning (A) - acetonitril (B), gradientelueringsbetingelser er vist i tabel 1. Massespektrumtilstand: elektrisk sprayspænding er 1 8 kV, positiv ion tilstand dataindsamling, fuld scanningsområde indstillet til m/z 350-2 000; Udfør MS/MS-scanning på de 15 stærkeste toppe med en sekundær kollisionsenergi sat til 35 V. Brug endelig SEQUEST-søgesoftwaren til at søge og matche de opnåede peptidsegmentdata.

Tabel 1 Gradientprofil af nano-HPLC-analyse

Bemærk: Strømningshastighederne er alle 300 nL · min-1.

2.8 Handlingsmålgruppeforløb og funktionsanalyse

Importer det identificerede målprotein til Cytoscape 3 I 5.1-softwaren blev ClueGO-pluginet brugt til KEGG-, REACTOME Pathways- og Wiki Pathways-analyse, og arten blev sat som mus med P<0 05 as the significance threshold, and the rest use default parameters.

2.9 Statistisk analyse

Alle eksperimentelle data er udtrykt i x felt ± s. Brug af GraphPad Prism-6 02 Statistisk software blev brugt til envejsanalyse af varians (ANOVA), med P<0 01 having a very significant difference.

3. Resultater og diskussioner

3.1 Lavmolekylært sukker fra Cistanche deserticola påvirker RAW264 Effekten af ​​7-cellefagocytisk aktivitet

I en anden undersøgelse foretaget af vores forskergruppe om de aktive komponenter af makrofagaktivering i Cistanche deserticola kan LMSC være en type komponent med makrofagaktivering.

Eksperimentel undersøgelse af Cistanche deserticola

Dette eksperiment brugte først den neutrale røde metode til at bestemme RAW264. In vitro-kultursystemet af 7 muse peritoneale makrofager blev stimuleret med forskellige koncentrationer af LMSC for at undersøge effekten af ​​LMSC på RAW264 Effekten af ​​7-celle fagocytisk aktivitet. Sammenlignet med den blanke kontrolgruppe, stimulerede det positive kontrollægemiddel LPS celler i 48 timer signifikant cellulær fagocytisk aktivitet (P<0 01); LMSC at 0 Each administration group of 25-2 g · L-1 significantly increased RAW264 The phagocytic activity of 7 cells (P<0 01), and exhibit dose-dependent characteristics. The above results suggest that LMSC may have activated RAW264 The role of 7 cells is shown in Figure 1.

Sammenlignet med den tomme kontrolgruppe, 1) P<0 01 (same as Figure 2).

Fig. 1 Virkninger af lavmolekylære saccharider fra Cistanche deserticola på fagocytisk aktivitet af RAW264. 7 celler

3.2 Lavmolekylært sukker fra Cistanche deserticola påvirker RAW264 Effekten af ​​NO-frigivelse i 7 celler

NO er ​​et vigtigt cytokin med immunregulerende virkninger i kroppen [9], som i vid udstrækning er involveret i regulering af RAW264 7-celleaktiveringsrespons. For yderligere at undersøge virkningen af ​​LMSC på RAW264 blev aktiveringseffekten af ​​7 celler bestemt, og indholdet af NO i cellesupernatanten efter LMSC-stimulering blev målt. NO-frigivelsen i LPS-gruppen med makrofagaktiveringspositivt lægemiddel var signifikant højere end i den tomme kontrolgruppe (P<0. 05) 01), similar to it, 0 RAW264 in the LMSC administration group with 3 doses of 5, 1, 2 g · L-1 The NO release of 7 cells was significantly higher than that of the blank control group (P<0. 05) 01), and it is dose-dependent, as shown in Figure 2. The above results indicate that LMSC can promote RAW264 The effect of 7 cells releasing NO confirms its macrophage activation effect.

Fig. 2 Virkninger af lavmolekylære saccharider fra Cistanche deserticola på NO-frigivelse fra RAW264. 7 celler

3.3 Lavmolekylært sukker fra Cistanche deserticola påvirker RAW264 Virkningen af ​​7-cellelevedygtighed

Cytotoksicitet er en vigtig faktor, der begrænser udviklingen af ​​nye lægemidler og påvirker deres effektivitet. For at undersøge, om doseringen af ​​LMSC anvendt i dette eksperiment har potentiel cytotoksicitet, blev MTT-metoden brugt til at påvise RAW264 efter LMSC-administration 7 Cellelevedygtighed. LMSC ved 0 25-2 g · L-1 intervention RAW264 Efter 24 timer med 7 celler var der ingen signifikant effekt på cellernes levedygtighed, og ovenstående resultater tyder på, at 0 25-2 g · L{{8 }} LMSC vs. RAW264 7 har ingen cytotoksicitet, som vist i figur 3.

Fig. 3 Virkninger af lavmolekylære saccharider fra Cistanche deserticola på RAW264. 7 cellers levedygtighed

3. 4 Berigelse og identifikation af målgrupper for makrofagaktivering af sukker med lav molekylvægt i Cistanche deserticola

Epoxid-aktiveret agarosegel er en fastfase-bærer, der i vid udstrækning anvendes til at koble saccharider, proteiner og andre molekyler, der indeholder hydroxyl- eller aminogrupper. LMSC er hovedsageligt sammensat af hydroxyl-rig fructose, mannitol og andre komponenter. I denne undersøgelse kan den indeholdte hydroxyl reagere med aktive epoxygrupper for at binde det lavmolekylære sukker i Cistanche deserticola til overfladen af ​​epoxyaktiverede agarosegelmikrosfærer for at opbygge LMSC-affinitetsmedium, som vist i figur 4A. Ved hjælp af molekylær affinitetskromatografiteknologi blev LMSC-affinitetsmediet blandet med RAW264 Inkuber det samlede proteinekstrakt af 7 celler for at fange målproteingruppen direkte. Sølvfarvning blev udført på målgruppen, som vist i figur 4B. Proteinbåndene i LMSC-affinitetsmediumbindingsgruppen var signifikant højere end dem i den ukoblede LMSC-blankmediumgruppe, mens den LMSC-konkurrerende gruppe signifikant reducerede antallet af affinitetsmediumfangede mål på grund af overdreven fri LMSC-konkurrerende binding med målproteinet. Efterfølgende blev HPLC MS/MS-metoden brugt til at identificere hvert proteinbånd, og der blev opnået i alt 24 målproteiner såsom Eef2, hvilket indikerer, at lavmolekylært sukker fra Cistanche deserticola kan forårsage makrofagaktivering gennem den kombinerede virkning af disse målproteiner.

3. 5 Analyse af virkningsmekanismen relateret til aktiveringsmålgruppen af ​​lavmolekylære sukkermakrofager i Cistanche deserticola

For at undersøge det lavmolekylære sukker-målprotein fra Cistanche deserticola, der forårsager RAW264. Mekanismen for makrofagaktivering analyseres i denne undersøgelse ved hjælp af KEGG-, REACTOME- og Wiki-signalvejsdatabaser til at undersøge de biologiske veje, der er involveret i LMSC-målproteingruppen. Analyseresultaterne af signalvejberigelse er vist i figur 5 og tabel 2. LMSC makrofagaktiveringsmålproteiner deltager hovedsageligt i 10 makrofagaktiveringsrelaterede signalveje, som kan opsummeres i følgende 4 kategorier: Fc-receptorafhængig fagocytose, TNF-NF - κ B signalvej, glykolyse/gluconeogenese, citronsyre (TCA) cyklus og respiratorisk elektrontransport.

4 Diskussion

Moderne forskning rapporterer, at traditionel kinesisk medicin og naturlægemidler har en bred vifte af biologiske aktiviteter, men på grund af deres komplekse kemiske sammensætning er der stadig udfordringer med at belyse virkningsmekanismen af ​​de komplekse komponentsystemer i traditionel kinesisk medicin og naturlægemidler. Baseret på molekylær affinitetskromatografis småmolekylære målproteinindfangningsteknologi kombinerede denne undersøgelse med den kemiske sammensætning, at hovedkomponenterne i det molekylære sukker i Cistanche deserticola (LMSC) alle har hydroxylgrupper, og konstruerede LMSC-bundne epoxyaktiverede agarosegelmikrokugler som affinitetsmedium for at identificere LMSC-målproteingrupper med makrofagaktivering og analysere signaltransduktionsvejene relateret til målgruppen. Desuden blev mekanismen for LMSC-makrofagaktivering afsløret.

Virkninger af Cistanche - Forbedre immunitet

Makrofager er en type vigtige immunresponsceller i kroppen, der kan fagocytere granulære antigener. Aktiveringen af ​​makrofager forårsaget af eksogene stimuli manifesteres hovedsageligt ved forbedring af fagocytisk funktion og frigivelse af NO og andre faktorer forårsaget af en række signalveje. LMSC dosisafhængig forbedring RAW264 Den fagocytiske aktivitet af 7 celler og en signifikant stigning i NO-frigivelse indikerer, at LMSC har en makrofagaktiveringseffekt. Berigelsesanalyse af signalveje for LMSC makrofagaktiveringsmål fanget ved molekylær affinitetskromatografi ved hjælp af bioinformatiske midler tyder på, at LMSC regulerer Fc ved receptorafhængig fagocytose, TNF-NF- κ B-signalvejen, glykolyse/gluconeogenese, citronsyre, og TCA) respiratorisk elektrontransport spiller makrofagaktiveringsroller.

A. Mikroskopisk karakterisering af affinitetsmedium (bar=25 μm); B. Sølvfarvet gelelektroforese af berigede mål.

Fig. 4 Målidentifikationen for lavmolekylære saccharider fra Cistanche deserticola

Fig. 5 Pathway berigelse analyse for målene for lavmolekylære saccharider fra Cistanche deserticola

Fc-receptorer er celleoverfladereceptorer og en af ​​makrofagmønstergenkendelsesreceptorerne [11]. De er placeret på celleoverfladen og kan specifikt genkende eksogene partikler, hvilket får dem til at binde sig til celleoverfladen. Fc-receptormedieret fagocytosesignaltransduktion kan forårsage nedstrøms actinpolymerisering og fagocytdannelse [11]. LMSC forbedrer signifikant RAW 264 7 celle fagocytisk aktivitet, som kan være relateret til bindingen af ​​forskellige Fc'er, såsom Hsp90 Receptor signaleringsrelaterede proteiner regulerer Fc Receptor afhængig fagocytose. NF- κ B-signalvejen betragtes som en nøglesignalvej for makrofagaktivering [12]. NF- κ B er en vigtig transkriptionsregulerende faktor i kernen, NF- κ Aktivering af B-signalvejen kan forårsage NF i cytoplasmaet - κ B aktiveres og translokeres til kernen og medierer derved genekspression af forskellige cytokiner, og NO mæglere. LMSC-stimulering kan få RAW264 7-celler til at frigive en stor mængde NO, som kan være relateret til TNF ved binding til forskellige faktorer såsom Eef2- NF-κ B-signalvej og andre relaterede proteiner aktiverer NF - κ B-signalvejen og dens tilhørende eukaryote translationsinitierings- og forlængelsesprocesser implementeres. Derudover involverer LMSC-relaterede mål også to kulhydratmetabolismeveje: glykolyse/gluconeogenese, citronsyre (TCA) cyklus og respiratorisk elektrontransport. Det spekuleres i, at LMSC indeholder forskellige lavmolekylære sukkerarter såsom fructose og mannitol, som kan påvirke RAW264 7-celler giver energi og binder til proteiner såsom Aldoa relateret til glukosemetabolisme og regulerer derved veje relateret til glucosemetabolisme.

Sammenfattende identificerede denne undersøgelse 24 forskellige funktionelle målproteiner til LMSC makrofagaktivering ved hjælp af molekylær affinitetskromatografi-relateret målproteingenkendelsesteknologi; Berigelsesanalyse af målprotein-relaterede signalveje tyder på, at LMSC virker på Fc-receptorafhængig fagocytose, TNF-NF- κ B-signalvejen og glucosemetabolismeprocessen udøver i sidste ende RAW264 7. Makrofager aktivering. Denne undersøgelse giver teoretisk støtte til at afsløre de aktive komponenter og relaterede mekanismer for immunregulering i Cistanche deserticola og giver også ideer til målgenkendelse og mekanismeforskning af komplekse aktive komponenter i naturlige lægemidler.

Tabel 2 Pathway berigelse analyse for målene for LMSC

[Reference]

［1］ Kinesisk farmakopé del 1 [S]. 2010:126

［2］ Xu Wenhao, Qiu Shengxiang, Zhao Jihong, et al. En undersøgelse af de kemiske bestanddele af Cistanche deserticola ［ J］. Chinese Herbal Medicine, 1994, 25 (10): 509

［3］ Wu XM, Gao XM, Tsim KW, et al. En arabinogalactan isoleret fra stænglerne af Cistanche deserticola inducerer spredning af dyrkede lymfocytter［J］． Int J Biol Macromol, 2005,37 ( 5): 278．

［4］ Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Runlan, et al Makrofageaktivering af polysaccharider fra Cistanche deserticola ［ J］. Chinese Pharmacological Bulletin, 2009, 25 (6): 787

［5］ Gao Yunjia, Jiang Yong, Dai Fang, et al. En undersøgelse af de farmakodynamiske stoffer i Cistanche deserticola i nærende tarme og lindrende afføring ［ J］. Modern Chinese Medicine, 2015, 17 (4): 307

［6］ Liu Wangcai, Zhu Jiawen Forskningsfremskridt inden for affinitetskromatografiteknologi [J]. Shanghai Chemical Industry, 2007, 32 (4): 27

［7］ Hong Minghan affinitetskromatografi. Chemical World, 1981, 9:281

［8］ Liao LX, Song XM, Wang LC, et al. Meget selektiv hæmning af IMPDH2 udgør grundlaget for antineuroinflammationsterapi［J］． Proc Natl Acad Sci USA, 2017,114 ( 29): E5986．

［9］ Wang Jing, Zhang Cundan, Yang Limin, et al Aktiveringseffekten af ​​ekstracellulære polysaccharider fra Pleurotus ferulae på musemakrofager [J]. Fødevareindustriteknologi, 2016, 37 (10): 356

［10］ Zhang Pengyu, Ruan Yingxin, Wang Yinan, et al. Aktivin A fremmer den fagocytiske aktivitet af muse-peritoneale makrofager ［ J］. Journal of the Academy of Military Medical Sciences, 2009, 33 (4): 330

［11］ Xie Zhijian, Xiong Xiaodong, Zuo Yun Fc Signaltransduktionsmekanisme af R-medieret makrofagfagocytose ［ J］. Foreign Medicine Immunology, 2002, 25 (1): 5

［12］ Yuan Xiaolin, Zhang Chunlei, Li Dianjun Forskningsfremskridt vedrørende aktivering af makrofager og deres signaleringsmekanismer ［ J］. International Journal of Immunology, 2007, 30 (5): 333