Synergistiske antiinflammatoriske virkninger af Laminaria Japonica Fucoidan og Cistanche Tubulosa-ekstrakt

Som et immunrespons mod fremmede antigener frigiver makrofager pro-inflammatoriske cytokiner såsom tumornekrosefaktor- (TNF-), interleukin-1 (IL- 1), IL-6 og andre. Sådanne cytokiner inducerer en kemotaktisk tilstrømning af granulocytter, monocytter, lymfocytter og mastceller til beskadiget væv, hvilket fremmer antigenfjernelse og vævsgenvinding. Men overdreven infiltration og aktivering af cellerne forværrer vævsskader, hvilket fører til ødem (vaskulær ekssudation) og smerte, som er velkendte betændelsesfænomener.

TNF- er en vigtig faktor til at inducere nitrogenoxidsyntase (iNOS) genekspression i flere cellelinjer. iNOS-aktivering fører til produktion af nitrogenoxid (NO), der ikke kun modulerer adskillige fysiologiske funktioner, såsom bakteriedræbende og vasodilatation, men også forårsager inflammation. Efter vævsskade genererer nedbrydning af phospholipaser af cellemembran-phospholipider arachidonsyre. Arachidonsyre nedbrydes yderligere af cyclooxygenase (COX) til prostaglandiner (PG'er). Overdreven mængde PGE2 dannet af COX-II inducerer adskillige cytokiner til inflammation. Da både NO og PGE2 fungerer som hovedfaktorer for inflammation og smerteinduktion, er TNF- –NO og COX-II-PGE2 veje hovedstrømmene i den inflammatoriske proces, som hæmmes af kortikosteroider og ikke-steroideantiinflammatoriske lægemidler(NSAID'er).

Også selvom der er flere steroider og NSAID tilbehandling af inflammatoriske sygdomme, kan disse lægemidler give anledning til negative virkninger på immunsystemet, mave-tarmkanalen, nyrerne, leveren, centralnervesystemet, blodtrykket og det kardiovaskulære system. Derfor er det nødvendigt at minimere de negative virkninger af kemiske lægemidler ved at erstatte dem eller bruge dem i kombination med naturlige produkter.

Fucoidan, et sulfatpolysaccharidkompleks fra tang som Laminaria japonica og Cladosiphon okamuranus, der er vidt udbredt i mange lande, har været brugt som terapeutiske midler i orientalsk medicin i en lang periode. I tidligere undersøgelser er det blevet påvist, at fucoidan har antioxidativ, anti-koagulativ, anti-cancer ogantiinflammatoriske aktiviteter. Følgelig tiltrækker de gavnlige virkninger af fucoidan på inflammatoriske sygdomme, iskæmi, immundysfunktion og tumorer efterforskernes opmærksomhed. På den anden side,Cistanche tubulosa(CT) er også blevet meget brugt som en traditionel medicin i Kina. Det blev rapporteret, at CT-ekstrakter sænker produktionen af ​​TNF-á og IL- 4, som er vigtige faktorer for NO-produktion i inflammatoriske veje [19].

Sådanne tidligere fund fik os til at undersøge den kombinationsmæssige effektivitet af fucoidan og CT-ekstrakt på de 2 hovedveje for inflammation. For at belyse virkningsmekanismen analyserede vi NO og PGE2 i ekssudaterne fra carrageenan-induceret luftposebetændelse.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FOREBYGGELSEINFLAMMATORISKE AKTIVITETERPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materialer og metoder

Materialer

Halvoprenset fucoidan og vandekstrakt af CT blev opnået fra Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Korea). Fucoidan og CT-ekstrakt blev holdt ved 4 grader, blandet (1:3) opløst i renset vand før brug og indgivet oralt i et volumen på 5 ml/kg.

Cellekultur og NO kvantificering

Den murine makrofag RAW 264.7-cellelinje blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, USA) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (Sigma, St. Louis, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum og antibiotika [100 U/mL penicillin (Sigma) og 100 µg/ml streptomycin (Sigma)]. Cellerne blev inkuberet i en befugtet 5% CO2 atmosfære ved 37 grader.

For at vurdere virkningerne af fucoidan og CT-ekstrakt på udskillelsen af ​​NO blev RAW 264.7-celler (1×106 celler/ml) inkuberet med fucoidan eller CT-ekstrakt (1-320 µg/ml) i 5 min. efterfulgt af interferon- (IFN-, 10 U/ml) og lipopolysaccharid (LPS, 10 µg/ml) i 24 timer. I vores foreløbige undersøgelser blev det bekræftet, at behandling med IFN-plus LPS til aktivering af RAW 264.7-celler ikke påvirkede cellernes levedygtighed i op til 24 timer, og at fucoidan og CT-ekstrakt ikke var cytotoksiske op til 1 mg/ml. Koncentrationen af ​​nitrit (NO2 – ), det oxiderede produkt af NO, blev målt som en indikator for NO. Dyrkningsmediet blev blandet med et lige så stort volumen Griess-reagens (1 % sulfanilamid, 0,1 % naphthylethylendiamin i 2,5 % phosphorsyre) [21] og inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter. Nitritkoncentration blev analyseret ved 540 nm, hvor NaNO2 blev brugt til at generere en standardkurve.

Dyr og behandling

ICR-hanmus (7 uger gamle) blev købt fra Daehan Biolink (Eumseong, Korea) og anbragt i et rum med konstante miljøforhold (22±2ºC; 40-70% relativ luftfugtighed; 12-timers lys -mørkecyklus; 150-300 lux lysstyrke). Pelletfoder og renset vand var tilgængeligt ad libitum. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Chungbuk National University (CBNU), Korea, og udført i henhold til Standard Operation Procedures (SOP) fra Laboratory Animal Research Center, CBNU.

Musene (n=8/gruppe) blev oralt behandlet med fucoidan (18 eller 54 mg/kg), CT-ekstrakt (54 eller 162 mg/kg) eller deres blanding (18+54, {{6 }} eller 90+270 mg/kg) én gang dagligt i 7 dage. Lave doser af fucoidan (18 mg/kg) og CT-ekstrakt (54 mg/kg) var fra estimerede humane doser på 100 mg/krop (70 kg) og 300 mg/krop efter overfladeoversættelse af kropsvægt (Km{{14 }} for henholdsvis menneske/Km=3 for mus). Høje doser af fucoidan og CT-ekstrakt blev sat til 3 gange, alene eller i blanding, og den højeste dosis blanding blev fastsat til 5 gange for at vurdere maksimale synergistiske effekter.

På den første dag af fucoidan- og CT-ekstraktbehandling blev mus subkutant injiceret med 10 ml steril luft i bagsiden for at danne en pose [22,23]. Efter 2 og 5 dage blev posen geninjiceret med 5 ml luft. En time efter den sidste behandling blev 1 ml carrageenan (1 % i saltvand; Sigma) eller dets vehikel (saltvand) sprøjtet ind i posen.

Analyser af ekssudaterne

Luftposen blev vasket med 1 ml kold saltvand 6 timer efter carrageenaninjektion, og nettovolumenet af skyllevæske blev registreret. Det samlede antal af inflammatoriske celler, neutrofiler, monocytter og lymfocytter blev bestemt ved anvendelse af en skærtæller. Koncentrationerne af NO og PGE2 blev bestemt ved henholdsvis Griess-reagens (Sigma) og enzymimmunoassay (EIA) ved anvendelse af et Correlate-EIA-kit (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL BLOKERING AF VIRKNING PÅ INFLAMMATORISK CELLEKEMOTAXIS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatologisk undersøgelse

Posebeklædningsvæv blev fjernet og fikseret i en neutral formalinopløsning. Paraffin-indlejrede vævsglas blev farvet med hæmatoxylin-eosin og undersøgt under et lysmikroskop for de inflammatoriske læsioner.

Statistisk analyse

Resultaterne præsenteres som middel ± SE. Eksperimentelle gruppesammenligninger blev foretaget ved envejs-variansanalyse efterfulgt af en Tukey's testkorrektion. AP værdi<0.05 was considered statistically significant.

Resultater

In vitro øgede RAW 264.7-cellekultur, IFN- og LPS-behandling i høj grad NO-produktion (figur 1). Forbehandling med fucoidan (1-320 µg/ml) påvirkede ikke NO-frigivelsen fra makrofagcellelinjen (figur 1A). Til sammenligning undertrykte CT-ekstrakt (32-320 µg/mL) signifikant NO-produktion, hvilket tyder på en anti-inflammatorisk aktivitet (figur 1B).

Injektion af carrageenan i museluftposen øgede markant ekssudatvolumenet i posen (figur 2). En sådan øget ekssudation blev svækket ved behandling med fucoidan (18 mg/kg) og CT-ekstrakt (54 og 162 mg/kg). Det er bemærkelsesværdigt, at kombinationsbehandlingen af ​​fucoidan og CT-ekstrakt reducerede ekssudatvolumenet yderligere sammenlignet med de individuelle virkninger, selvom højere dosiskombinationer (54+162 mg/kg og 90+270 mg/kg) ikke udviste yderligere effektivitet til den laveste dosiskombination (18+54 mg/kg) (figur 2A). N-graders indhold i posen steg også drastisk efter carrageenaninjektion (figur 2B). I sammenligning med den milde virkning af fucoidan sænkede CT-ekstrakt N-gradskoncentrationen markant. Kombinationsbehandling af fucoidan og CT-ekstrakt reducerede NO-niveauet yderligere på en dosisafhængig måde. Tilsvarende blev det øgede PGE2-indhold synergistisk undertrykt af kombinationsterapien af ​​fucoidan og CT-ekstrakt (figur 2C).

Parallelt med de inflammatoriske mediatorer i posen steg antallet af inflammatoriske celler drastisk ved carrageenaninjektion: 37,8, 4,8 og 24,1 gange kontrolniveauer for henholdsvis neutrofiler, monocytter og lymfocytter (tabel 1). Fucoidan og CT-ekstrakt reducerede imidlertid den inflammatoriske celleinfiltration betydeligt, hvor fucoidan var noget bedre end CT-ekstrakt. Uventet blev der ikke opnået nogen synergistisk effekt i den inflammatoriske celleinfiltration ved samtidig administration af fucoidan og CT-ekstrakt.

Som udledt af den inflammatoriske celleinfiltration i ekssudaterne udviste det subkutane væv, der omgav luftposer, alvorlige inflammatoriske læsioner (figur 3). Enormt mange celler i det fortykkede subkutane væv udsat for Carrageenan blev observeret (figur 3B), sammenlignet med de næsten normale træk hos kontroldyr (figur 3A). Sådanne inflammatoriske læsioner blev bemærkelsesværdigt svækket ved behandling med fucoidan (figur 3C og 3D) eller CT-ekstrakt (figur 3E og 3F).

Navnlig blev højere antiinflammatoriske virkninger opnået ved kombinationsterapi med fucoidan og CT-ekstrakt (figur 3G-3I).

Diskussion

Ved at bruge en in viv-grad arrageenan-induceret luftpose-inflammationsmodel inducerer injektion af luft i ryggen på gnavere spredning af celler, der lagdeling på overfladen af ​​hulrummet for at danne en struktur, der ligner synovium. I denne model øgede injektionen af ​​carrageenan-induceret inflammatorisk celleinfiltration ekssudatet, hvilket er tegn på vaskulær lækage. Luftposen fungerer som et reservoir af inflammatoriske celler og mediatorer, der let kan måles i den væske, der ophobes lokalt.

Blandt de forskellige inflammatoriske mediatorer, der kan inducere vaskulær permeabilitet, er det velkendt, at NO og PGE2 er vigtige faktorer involveret i patogenesen af ​​mange inflammatoriske sygdomme. De er også kendt som mediatorer af smerteinduktion og perception. iNOS, som udtrykkes og aktiveres i forskellige celletyper ved stimulering med TNF- og/eller LPS under inflammation, producerer høje, vedvarende koncentrationer af NO. NO er ​​et vigtigt regulatorisk molekyle i forskellige fysiologiske funktioner, såsom vasodilatation, der fører til vaskulær lækage. PGE2, som genereres fra arachidonsyre via COX'er, bidrager til udviklingen af ​​mange inflammatoriske sygdomme, og overproduktion af PGE2 som reaktion på forskellige inflammatoriske stimulationer er forbundet med opregulering af COX-II niveauer og progression af inflammation. Derfor er TNF- - NO- og COX-II-PGE2-veje blevet betragtet som to hovedstrømme af inflammatoriske processer, som blokeres af inhibitorer af henholdsvis iNOS (kortikosteroider) og COX (NSAID'er).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBUD AF INFLAMMATORISKE SYGDOMME PHGS75% ECH 30% ACT 12%

I denne undersøgelse reducerede samtidig administration af fucoidan og CT-ekstrakt ekssudatvolumenet i posen, hvilket tyder på, at de har undertrykkende aktivitet mod vaskulær lækage (figur 2A). Sammenlignet med de individuelle virkninger af hver fucoidan- og CT-ekstrakt steg kombinationsbehandlingen yderligere, hvilket antyder, at to-graden forstærker handlingen synergistisk. Sådanne synergistiske virkninger mellem fucoidan og CT-ekstrakt blev understøttet af deres aktiviteter på NO- og PGE2-niveauerne i ekssudaterne (figur 3B og 2C).

Interessant nok blev det imidlertid bekræftet, at fucoidan ikke direkte hæmmer aktiveringen af ​​makrofager in vitro-assay (figur 1A). Tilsvarende var det hæmmende potentiale af fucoidan på NO- og PGE2-akkumulering in vivo-assayet relativt lavere end for CT-ekstrakt (figur 2B og 2C). En sådan virkningsmekanisme af fucoidan er forskellig fra en direkte inaktivering af cellerne med CT-ekstrakt (figur 1B). Til sammenligning udøvede fucoidan en høj effektivitet på inhiberingen af ​​inflammatorisk celleinfiltration i poserne (tabel 1). Fucoidan var overlegen i forhold til CT-ekstrakt ved at blokere migrationen af ​​neutrofiler, monocytter og lymfocytter til de carrageenan-inducerede vævsskadesteder. Interessant nok var der ingen synergistisk anti-migratorisk effekt, hvilket tyder på forskellige virkningsmekanismer mellem fucoidan og CT-ekstrakt: dvs. fucoidan blokerer infiltration af inflammatoriske celler, mens CT-ekstrakt hæmmer aktivering af cellerne.

Polymorfonukleære celler, især neutrofiler, er de vigtigste cellulære komponenter, der rekrutteres til akutte inflammatoriske steder induceret af carrageenan. Derudover spiller efterfølgende inflammatoriske celler såsom makrofager og lymfocytter også centrale roller i den inflammatoriske proces ved at udskille cytokiner. Ved forbehandlet med fucoidan eller CT-ekstrakt blev antallet af hvide blodlegemer, der vandrede ind i de carrageenan-injicerede luftposer, markant undertrykt. Dette resultat stemte overens med en effekt, der ville opnås af kortikosteroider såsom dexamethason, men ikke af NSAID'er inklusive indomethacin. Derfor antages det, at fucoidan- og CT-ekstraktet til dels har en egenskab af steroider.

Ud over den blokerende virkning på inflammatorisk celle kemotaksi, syntes CT-ekstrakt at undertrykke aktiveringen af ​​makrofager. Dette blev bekræftet af dets hæmmende virkninger på NO in vitro og in vivo, som er den vigtigste inflammatoriske mediator produceret af makrofager. Således kan virkningen af ​​CT-ekstrakt på makrofager skyldes en undertrykkelse af mRNA-ekspression og/eller en direkte hæmning af iNOS-aktivitet i disse celler.

PGE2 er også en af ​​de vigtigste inflammatoriske mediatorer. Det øges parallelt med vævsødem, som undertrykkes af NSAID'er, hæmmere af COX. Carrageenan kan øge PGE2-produktionen ved at inducere COX-II mRNA og COX-II protein i poseekssudatet. I denne model øgede carrageenan signifikant mængden af ​​PGE2, og det blev væsentligt undertrykt af CT-ekstrakt. Det er interessant at bemærke, at dette resultat var i overensstemmelse med en effekt, der ville blive opnået af et NSAID indomethacin. Derfor udledes det fra resultaterne, at CT-ekstrakt har yderligere egenskaber af NSAID'er. Tilsammen antages det, at CT-ekstrakt udøvede både kortikosteroid- og NSAID-lignende virkninger i den carrageenan-inducerede inflammationsmodel, og at fucoidan forbedredeantiinflammatoriske virkninger af CT-ekstraktved at blokere inflammatorisk celleinfiltration.

Selvom definitionen af ​​den nøjagtige virkningsmekanisme kræver yderligere undersøgelse, svækkede en blanding af fucoidan og CT-ekstrakt markant inflammatoriske tegn ved at blokere TNF--NO- og COX-II-PGE2-vejene i carrageenan-induceret luftposebetændelse. Disse resultater viser, at kombinationsbehandling af fucoidan og CT-ekstrakt kan være en lovende kandidat til lindring af forskellige typer betændelse, der reagerer på kortikosteroider eller NSAID'er.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBUD AF INFLAMMATORISKE SYGDOMME PHGS75% ECH 30% ACT 12%