Vedvarende lokal hæmning af trombin bevarer nyrens mikroarkitektur og funktion efter indtræden af akut nyreskade
Mar 14, 2022
Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Ian Vargas et al
Abstrakt
Akut nyreskade(AKI)-behandling forbliver hovedsageligt støttende, da ingen specifikke terapeutiske midler rettet mod enkeltstående signalveje har haft succes i kliniske forsøg. Her rapporterer vi, at inhibering af thrombin-drevet koagulering og inflammatorisk signalering med brug af lokalt virkende thrombin-målrettede perfluorcarbon nanopartikler (PFC NP) beskytter nyrevaskulatur og bredt modulerer forskellige inflammatoriske processer, der forårsager nyreiskæmi-reperfusionsskade. Hver PFC NP blev kompleksbundet med ~13.650 kopier af den direkte thrombininhibitor, PPACK (prolin-phenylalanin-arginin-chlormethyl-keton). Mus behandlet efter starten af AKI med PPACK PFC NP udviste nedregulerede VCAM-1, ICAM-1, PGD2 prostanoid, M-CSF, IL-6 og mastcelleinfiltrater. Mikrovaskulær arkitektur, rørformede basalmembraner og børstekantkomponenter blev bedre bevaret. Ikke-reperfusion blev reduceret som angivet ved reduceret indfangning af røde blodlegemer og ikke-hæmjern.Nyrefunktion og tubulær nekrose forbedret efter 24 timer i forhold til den ubehandlede kontrolgruppe, hvilket tyder på en fordel for dobbelt hæmning af trombose og inflammation af PPACK PFC NP.
Nøgleord: Akut nyreskade; Trombose; Betændelse; Perfluorcarbon nanopartikler; Fartøjsskade
Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at få prøven
Akut nyreskade(AKI) er et hyppigt klinisk problem hos både unge og ældre med en stigende forekomst og en uacceptabel høj dødelighed, som ikke er forbedret væsentligt i årtier.1,2 Syndromet udvikler sig typisk efter et pludseligt forbigående fald i total eller regional blodgennemstrømning til detnyresom en konsekvens af en række fornærmelser, herunder hypotension, sepsis, toksiner, etc.3 AKI fremkalder en kompleks samling af patofysiologiske molekylære spillere og signalerende begivenheder i en sygdomsproces, der udvikler sig over tid i stadier.3-6 Selektiv og specifik molekylært målrettet medicinsk behandlinger for AKI eksisterer endnu ikke, på trods af det presserende medicinske behov.7 Efter mange års prækliniske og kliniske forskningsindsats forbliver de nuværende behandlinger i det væsentlige støttende.
Her postulerer vi, at nanopartikel-baserede terapeutiske interventioner rettet mod thrombin, der kan opretholde mikrovaskulær integritet og barrierefunktion og samtidig reducere inflammatorisk signalering, vil gavne AKI-resultater. Thrombin er et primært atherogent og sårhelende molekyle, der driver mange andre inflammatoriske molekyler, der deltager i endotelaktivering efter en skade, såsom NF-κB,8 NADPH oxidase,9
og andre via protease-aktiverede receptorer (PAR-1) på både endotel og makrofager.10,11 Alle celletyper inyreoplevede ændringer i genekspressionsmønster, som inkluderer øget ekspression af skadesmarkører og udviklingsgener som vist af Rudman-Melnick et alnyreskade.12 Desuden identificerede en gnaverundersøgelse af enkeltkerne-RNA-sekventering i bilateral iskæmi-reperfusionsnyreskade13 en specifik proksimal tubulicellepopulation, der overudtrykker gener af proinflammation og profibrotisk efter varm iskæmi-reperfusionsskade. Disse resultater indikerer, at inflammation bør repræsentere et nyttigt terapeutisk mål. Selvom dannelsen af faste intravaskulære blodpropper forekommer ualmindeligt i AKI, antog vi yderligere, at reduktion af mikrovaskulær prokoagulant aktivitet via lokalt virkende potente anti-thrombin nanopartikel-antagonister14-17 kan forbedre blodgennemstrømningen, reducere "no-reflow" og dæmpe inflammatorisk signalering for at bevare nyrefunktion.
Kritiske spørgsmål, der taler imod at anvende direkte trombinhæmmere for at forhindre nyreiskæmi-reperfusionsskade (IRI), omfatter deres potentielle toksiske bivirkninger og den systemiske blødningsrisiko. Hvad angår trombose, har konventionelle antikoagulerende terapier ikke været særlig vellykkede, selvom opløseligt trombomodulin kan udøve genbeskyttende virkning,18,19, hvilket kan aktivere protein C,20,21 og antithrombin III,22, dog med potentielle komplikationer af overdreven blødning.21 Desuden kan både warfarin og dabigatran er blevet forbundet med nyretoksicitet.23,24Men det faktum, at disse anti-koagulerende tilgange endnu ikke er lykkedes klinisk, formindsker ikke den potentielle værdi af thrombin som mål, på grund af dets dobbelte funktioner i både koagulation og inflammation. Selvom der ikke er nogen klinisk undersøgelse vedrørende VEGF-behandling for AKI, har en præklinisk undersøgelse vist, at VEGF er en vigtig mediator i renobeskyttelse under AKI,25, hvilket yderligere understøtter vores foreslåede hypotetiske terapeutiske mekanisme for nyrekarbevarelse til at beskytte nyrefunktionen under AKI.
Vi har udviklet en stabil, biokompatibel og ikke-nefrotoksisk perfluorcarbon nanopartikel (PFC NP) platform, der hæmmer thrombins proteaseaktivitet uden at forårsage blødende diatese.14,15 Native PFC NP'er er FDA-godkendt som bloderstatninger26 og omfatter en flydende perfluorcarbon kerne og en ydre phospholipid-overfladeaktiv skal og i diameter fra ~160-250 nm. I nyere foreløbige AKI-undersøgelser administrerede vi anti-thrombin PFC NP som en forbehandling for at bekræfte, at thrombin er et værdifuldt mål for at accelerere genopretning af nyrefunktionen til dels ved at bevare mikrovaskulær integritet og reducere ikke-reperfusion i IRI, når det administreres før iskæmi-reperfusionen skade.16 Anti-trombin PFC NPS beskytter også nyre-allotransplantater fra IRI og udviser en markant reduktion i procentdelen af parenkymal tubulær nekrose forbundet med øget nyrelevetid efter transplantation.27 Det er dog ikke klart, om denne anti-trombose-nanopartikel stadig er effektiv efter starten af AKI, som repræsenterer et helt andet sæt patientpopulationer.
Derfor søgte vi i det nuværende arbejde at udvide brugen af denne tilgang til etableret AKI efter IRI for at belyse dets potentiale for klinisk oversættelse. Som bevis på konceptet anvender vi PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-chlormethylketon) som antithrombindelen til konjugering til PFC NP, som vi har vist forhindrer thrombinsignalering og mikrovaskulær trombose i modeller for åreforkalkning og akut nyreskade ( AKI).14–17 PPACK i sig selv er en velkendt direkte og irreversibel trombinhæmmer, som er fri form, fjernes for hurtigt af nyren til at være af værdi som et terapeutisk middel.14,15 Heri belyses de tidlige patofysiologiske reaktioner på PPACK PFC NP-terapi, der begrænser inflammatoriske signalbegivenheder både i nyre og systemisk, bevarer nyrernes mikroarkitektur og dæmper vaskulær skade. Disse data antyder, at denne nanopartikel-baserede terapeutiske tilgang til igangværende AKI kunne sætte scenen for klinisk udvikling af et anti-trombinmiddel, der udøver lokalt begrænsede pleiotropiske virkninger og kan administreres sikkert i de tidlige faser af AKI.
Metoder
Nanopartikelformulering
Perfluorcarbonnanopartikler blev formuleret som tidligere beskrevet.14 Kort fortalt en lipidblanding af 98,5 molprocent æg L- - phosphatidylcholin og 1,5 molprocent af 1,2-distearoyl snglycero- 3-phosphoethanolamin-N-[ carboxy(polyethylenglycol)-2000] (natriumsalt) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) blev fremstillet i chloroform:methanol (3:1), før det blev tørret til dannelse af lipidfilm under vakuum. Lipidfilmen (2 procent (vægt/volumen)) blev derefter kombineret med PFOB (20 procent (vol/vol)) (Exfluor Research Corp.) (glycerin 1,7 procent (vægt/vol)) (Sigma, St. Louis, MO, USA ), og MilliQ-vand, før de emulgeres (Microfluidics Inc) på is i 4 minutter ved 20,000 psi. For at funktionalisere nanopartiklerne med PPACK-konjugation brugte vi Amine-carboxyl-koblingsmetoden. Nanopartiklerne (1 ml) blev først blandet med 2 mg EDCI 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidmethiodid (Sigma, St. Louis, MO) i 1 time før tilsætning af 12,5 mg PPACK (BACHEM, Torrance, CA) på orbital shaker stuetemperatur natten over. Dialyse med molekylvægt cutoff 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA) blev udført for at fjerne overskydende EDCI og PPACK. Detaljeret formuleringsmetode blev inkluderet i Supplerende materialer.
Modellen for akut nyreskade
Voksne C57BL/6 mus (n=22) gennemgik bilateral nyre varm iskæmi-reperfusion for at inducere akut nyreskade. Dyrene blev bedøvet med ketamin (85 mg/kg) og xylazin (13 mg/kg) cocktail før de undergik en laparotomi for at frembringe 17 minutters varm iskæmi. Et abdominalt midtlinjesnit blev indført for at blotlægge både nyrearterie og vene. Renal iskæmi blev induceret af okklusive klemmer på både arterie og vene for at begrænse blodgennemstrømningen til nyren. Vellykket ophør af nyreblodstrømning blev bekræftet visuelt ved en ændring af nyrefarven fra pink til mørk lilla. Musenes kropstemperatur blev holdt på 37 grader ved at bruge et lille dyrevarmesystem. Klemmerne blev frigjort efter 17 minutter for at tillade genoprettelse af nyreblodgennemstrømning, hvilket blev bekræftet af ændringen af nyrefarve til pink. Operationssåret blev derefter lukket i lag, og dyrene blev overvåget og returneret til buret efter fri bevægelighed. Efter reperfusion i 2 timer, en enkelt dosis PPACK
PFC NP ({{0}},5 ml/kg PFC NP; 0,05 mg/kg PPACK) eller almindelig (kontrol) PFC NP blev administreret intravenøst ved haleveneinjektion. Da vores tidligere undersøgelse viste, at en enkelt forebyggende dosis af PPACK PFC NP udviste nyrebeskyttende virkninger,16 anvendte vi her en enkelt dosisbehandling efter starten af AKI for at evaluere dens nyrebeskyttende effekt. Procedurer og protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of South Florida.
Vævsopsamling og konservering 24 timer efter administration af nanopartikler blev mus aflivet, og nyrer ekstraheret til analyse. Forud for nyrefjernelse til histologiske og molekylære evalueringer blev blod opsamlet gennem hjertepunktur til serumanalyse nedstrøms, og derefter blev hver mus perfunderet systemisk med normalt saltvand (Cat#: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) indtil resterende blod blev skyllet ud af nyrerne. For at opsamle serum blev fuldblod koaguleret ved stuetemperatur i 30 minutter, før det blev centrifugeret ved 2000 xg i 10 minutter ved 4 grader. Opsamlet serum blev opbevaret ved -80 grader før blodurinstofnitrogen og cytokinevalueringer. Til histologisk analyse blev udskårne nyrer fikseret i 10 procent formalin før vævsbehandling, indlejring i paraffin og snit. Til eicosanoider-evalueringer blev udskåret nyrer dissekeret yderligere for at adskille cortex og medulla, før de blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 grader til analyse.
Histologi
Detaljerede histologisk farvning og dataanalysemetoder var inkluderet i de supplerende materialer. Objektglassene blev afparaffineret og rehydreret før hæmatoxylin- og eosinfarvning, Periodic Acid Schiff (PAS)-farvning (Cat#: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), Preussian Blue Iron-farvning, Immunhistokemisk farvning for at visualisere CD31, VCAM-1, og ICAM-1-ekspression og mastcelle-eosinofil-farvning (kat. nr.: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Farvningsdata for kanin-IgG-isotypekontrol er vist i de supplerende figurer 2 og 3 for at demonstrere specificiteten af de immunhistokemiske farvningsresultater. Alle mikroskopiske billeder blev erhvervet ved de samme effektindstillinger og digitaliseringsparametre. Mikroskopiske evalueringer blev udført med et Olympus lysfeltsmikroskop udstyret med et DP27 digitalkamera til at optage billeder af patologiske snit ved 20× eller 40× forstørrelse. Dobbeltblind dataanalyse blev udført på alle billeder.
Urinstof nitrogen i blodet (BUN)
BUN-målingerne blev udført med et Urea Nitrogen (BUN) Colorimetrisk Detection Kit (Cat#: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) efter producentens anvisninger.
Eicosanoid forberedelse og analyse
Eicosanoider blev ekstraheret ved hjælp af en modificeret ekstraktionsproces og analyseret ved UPLC ESI-MS/MS som tidligere beskrevet.28 Detaljerede metoder anvendt til denne undersøgelse blev inkluderet i Supplerende materialer.
Serum cytokinevaluering
Et tilpasset cytokinarray blev købt fra R&D Systems (Minneapolis, MN) og evalueret med Luminex 200 (Northbrook, IL) efter instruktioner i brugervejledningen.
Statistikker
Resultater er udtrykt som middelværdi ± standardfejl af middelværdien (SEM). Statistisk analyse for hvert eksperiment er opsummeret i supplerende tabel 1. Tosidet t-test eller envejs ANOVA med Scheffe-test blev anvendt. Korrelationsanalyser for udvalgte par af metrikker blev udført for at beregne en Pearsonsk r-værdi. Statistisk signifikans af forskelle blev tilskrevet P <>
Resultater
PPACK PFC NP behandling forbedrer nyrefunktionen efter debut afakut nyreskade.
Mikroskopisk undersøgelse af det generelle udseende af nyrer 24 timer efter post-reperfusion anti-thrombin (PPACK) PFC NP-behandling indikerede forbedring af skaden i etableret AKI (figur 1, AB). Skaden efter 24 timer var overvejende lokaliseret ved den corticomedullære forbindelse af nyren, og de proksimale tubuli var fortrinsvis beskadiget. Mønstret for skade var det af koagulativ type nekrose. Der var et mindre inflammatorisk infiltrat på tidspunktet for 24-timer. Kvantificering af tubulær beskadigelse i H&E-farvede sektioner (figur 1, C) afslørede, at PPACK PFC NP-behandlede mus viste en samlet reduktion på 33,95 procent i akut tubulær nekrose (ATN) vs. kontrol-NP-behandlede mus (24,44 ± 1,76 procent vs 37).{{ 16}} ± 4,96 procent henholdsvis P=0.035). Figur 1, D viser, at mus, der modtog behandling, viste en 44,03 procent reduktion i BUN med 24 timer (110,96 ± 6,21 mg/dL vs. 62,10 ± 8,71 mg/dL for kontrol NP vs. PPACK PFC NP; P=0.0002 . Disse tidlige gavnlige resultater afspejler den beskyttelse, vi tidligere observerede med anti-trombin-kure før behandling efter 24 timer,16, hvilket tyder på, at thrombin fortsætter med at spille en kritisk rolle i udviklingen af AKI ud over den indledende iskæmiske fornærmelse.
Figur 2 illustrerer de regionale reaktioner af basalmembran- og børstekantstrukturer på anti-trombinbehandling baseret på semikvantificering af PAS-farvning. Figur 2, AC viser, at behandling øgede procentdelen af glomeruli med intakte basalmembraner fra 51,43 procent ± 2,61 procent til 70,00 procent ± 3,09 procent (P=0.00033). Figur 2, DF illustrerer den mere dybtgående skade, som rørformede børstekanter har lidt, hvor kun et mindretal beholdt fuldstændigt intakte børstekanter efter 24 timer. Ikke desto mindre forbedrede behandlingen børstekantens integritet med 50,79 procent (P=0.015). Behandling reducerede det samlede omfang af proteinaggregater med 54,09 procent (P=0.032) (Figur 2, GI), hvilket kan forventes at forhindre tubulær overbelastning for at opretholde nyrefunktionen.
PPACK PFC NP-behandling bevarede vaskulær integritet efter indtræden af IRI
For at kvantificere potentialet for PPACK PFC NP til at beskytte vaskulære elementer, blev nyresektioner farvet for CD31.
Figur 3 illustrerer den større forekomst af CD31-farvning efter 24 timer i cortex og medulla hos mus behandlet med PPACK NP versus kontrol NP (figur 3, A og D versus B og E). I kortikale områder omfattede CD31-farvning 4,28 procent ± 0,62 procent af behandlede versus 1,75 procent ± 0,34 procent for kontroldyr (P=0.0{{ 25}}18), eller en relativ stigning på 144,57 procent (figur 3, C). I marvregioner omfattede CD31-farvning 3,24 procent ± 0,38 procent for PPACK NP-behandlede versus 1,91 procent ± 0,29 procent for kontrol-NP-behandlede dyr (P=0.0073) eller en relativ stigning på 88,81 procent (Figur 3, F) . Mikroskopisk vurdering af vaskulær integritet afslørede ingen nævneværdig arteriolær nekrose på tidspunktet for 24-timer.
Udseendet af røde blodlegemer (RBC) i mikroskopiske billeder var forskellig mellem PPACK NP og kontrol NP-behandlede mus efter 24 timer (figur 4). Fordi musene blev systemisk perfunderet for at udvaske blod i perfuserbare renale territorier, indikerede tilstedeværelsen af RBC'er enten aggregering i dårligt perfunderede mikrovaskulære kanaler eller interstitiel ekstravasation, eller muligvis begge dele. I glomeruli (figur 4, AB) blev røde blodlegemer observeret i vaskulære totter, men sjældent i Bowmans kapsel efter 24 timer. Behandling reducerede den glomerulære RBC-prævalens med 40,78 procent (P=0.007) (Figur 3, C). I medulla (figur 4, DE) var det ikke muligt at tildele en endelig placering for røde blodlegemer baseret på H&E-farvning, men behandling reducerede den samlede prævalens af røde blodlegemer med 34,92 procent (P=0.049) (figur 4, F) .
For yderligere at afgrænse konsekvenserne af RBC-aflejring og -indfangning blev der udført non-hæm jernfarvning med Prussian Blue. Jernpletter var positive i både glomerulære og tubulære cellulære strukturer. Behandling reducerede prævalensen af jern i både cortex (44,23 procent reduktion; P=0.022) (Figur 5, AC) og medulla (50,50 procent reduktion; P=0}.006) (Figur 5, DF ) efter 24 timer, i overensstemmelse med effekten af antitrombinbehandling på RBC-indfangning.
PPACK PFC NP-behandling reducerede lokal og systemisk inflammation efter debut af AKI
For at belyse thrombins rolle i at opretholde endotelaktivering og lokal inflammation i nyren, kvantificerede vi både ICAM-1 og VCAM-1. VCAM-1-ekspression i cortex blev ikke ændret ved PPACK-behandling (figur 6, AC). Imidlertid blev VCAM- 1-ekspression i medulla nedreguleret væsentligt med 65,25 procent (P=0.011) efter behandling (figur 6, DF). Forøget ekspression af endotelial ICAM-1 blev observeret i både cortex og medulla i kontrol-NP-behandlede mus (figur 7, B og E). ICAM-1 blev nedreguleret ved behandling med 36,89 procent (P=0.0083) i cortex (figur 7, AC) og med 31,17 procent (P=0}.030) i medulla (figur 7) , DF).
For at afgrænse thrombins rolle i regulering af inflammatoriske bioaktive lipider i den tidlige udvikling af AKI udførte vi lipidomiske assays på væv ekstraheret separat fra cortex og medulla efter 24 timer. Supplerende tabel 2 og 3 viser de specifikke molekylære assays, nyreregion og emnetyper (behandlet AKI, ubehandlet AKI eller normal uden AKI). Supplerende tabel 4 viser den gennemsnitlige procentvise ændring fra sund normal baseline for hvert lipid i cortex og medulla. Generelt manifesterede både kortikale og medullære regioner afvigende ekspression af næsten alle bioaktive lipider vurderet sammenlignet med normale nyrer (Supplerende tabel 2 og 3), og næsten alle signallipider havde tendens til at skifte mod normale niveauer efter anti-trombinbehandling. Som en forenklet målestok for regional inflammation (supplerende tabel 4) var den gennemsnitlige procentvise ændring for alle lipider 65,13 procent og 38,60 procent for cortex og 136,42 procent og 90,76 procent for medulla i henholdsvis kontrol-NP- og PPACK NP-grupperne, hvilket indikerer, at inflammation medulla oversteg det for cortex ifølge lipidomiske assays.
Selvom løsningstendenser var tydelige efter behandling for næsten alle lipidarter, opfyldte de fleste ikke statistisk signifikans. Bemærkelsesværdig i disse assays var imidlertid den signifikante respons af PDG2, som faldt med 47,62 procent i cortex (Figur 8, A) (P=0.012) og 50,21 procent i medulla (Figur 8, B) ( P=0.0249). Baseret på denne observation kvantificerede vi forekomsten af infiltrerende mastceller, som er en kendt fremtrædende kilde til inflammatorisk PGD2. Figur 8, CE indikerer antitrombinbehandling reduceret mastcelleindhold i hele nyresektionen med 54,27 procent (P=0.002) efter 24 timer. Dette stemmer overens med de observerede reduktioner i VCAM-1 og ICAM-1 (figur 6 og 7) som aktiverede mastceller, der udtrykker LFA-1 (lymfocytfunktionsassocieret antigen 1) og VLA (meget sent antigen) ligerer vævsspecifikke adhæsionsmolekyler til transmigration ind i betændt væv.29,30 Desuden blev mastcelle-associerede kemokiner/cytokiner såsom M-CSF og IL-6 samtidig nedreguleret af anti-thrombin-nanopartikler. Efter PPACK NP-behandling var serum M-CSF og IL-6 reduceret med henholdsvis 36,60 procent (P=0.0448) og 27.44 procent (P=0}.0454), sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe (figur 8, F).
Adskillige interessante sammenhænge fremkom fra datasættet relateret til mastcelleinfiltration, vaskulær skade og nyrefunktion for de samlede kombinerede grupper af behandlede og ubehandlede dyr i både cortex- og medulla-regioner. Der var et indirekte forhold mellem BUN og CD31 (r=0.75, P=0.000009), hvilket indikerer, at forværret nyresvigt var forbundet med større vaskulær kompromittering (Supplerende figur 1, A). Der eksisterede et direkte forhold mellem mastcellenumre og BUN (r=0.71, P=0.004), hvilket indikerer en progressiv formindskelse
af nyrefunktionen i forbindelse med mastcelleinfiltration (Supplerende figur 1, B). En indirekte sammenhæng blev observeret mellem mastcelleantal og CD31 (r=0.59, P=0.002), hvilket indikerer, at vaskulær skade forværredes med øget mastcelleinfiltration (Supplerende figur 1, C). Endelig blev der observeret en direkte sammenhæng mellem mastcelleantal og global ICAM-1-ekspression (r=0.54, P=0.008), i overensstemmelse med en forventning om, at opregulerede vaskulære adhæsionsmolekyler ville fremme mastcellesøgning til skadet væv (Supplerende figur 1, D). En endnu tættere direkte relation vedrørte medullær VCAM-ekspression og mastcelleantal (r=0.69, P=0.009; data ikke vist).
Diskussion
På trods af årtiers bestræbelser på at søge effektiv styring afakut nyreskade, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 anti-thrombin-dele på steder med mikrovaskulær trombose og PAR-1-aktivering (yderligere beskrivelse i Supplerende materialer), en amplifikationsstrategi, der ikke kan opnås ved 1:1-stokiometrien af konventionelle frie midler, der hæmmer thrombin, inklusive PPACK.
Det nuværende datasæt viser, at akut nyreiskæmi-reperfusionsskade ikke er fuldstændig 2 timer efter reperfusion, og thrombin forbliver et højværdimål i beskadiget væv efter reperfusion. Tidligere indsats fra Molitoris' medarbejdere og andre understøtter den fortsatte indsats for at designe sikre metoder til direkte hæmning af thrombin i AKI.18,31–33Fra vores tidligere arbejde med forbehandling af AKI med PPACK PFC NP, ved vi, at anti-trombin-nanopartikler giver vedvarende overvågning mod lokalt aktiveret trombin, der opretholder vaskulær integritet, markant dæmper fænomenet uden genstrømning med ~50 procent og hurtigt vender nyresvigt med 24 timer.16 Sammenholdt med de nuværende data er det klart, at anti-thrombin-nanopartikler fortsætter med at få adgang til beskadiget, men levedygtigt nyrevæv i et godt stykke tid efter reperfusion for at forhindre yderligere vaskulær og tubulær skade. Tidligere rapporter om, at PAR-1 knockout-mus lider af reduceret nyreiskæmi-reperfusionsskade, stemmer også overens med vores strategi med stærk og vedvarende farmakologisk hæmning af PAR-1-aktivering i AKI via thrombinhæmning.34
Beskyttelsen af renale vaskulære strukturer (Figur 3), børstekant og basalmembran (Figur 2) leveret af antithrombin PFC NP, i overensstemmelse med vores tidligere data, der viser, at anti-trombinterapi fremkalder en 2x forbedring af perfusion i corticomedullære regioner i AKI,16 bekræfter en ny fordel ved at forbedre renal mikroangiopati. Selvom den nøjagtige karakter af skaden på peritubulære kapillærer og venuler ikke er blevet fuldt belyst på disse tidlige tidspunkter efter reperfusion, beskrives øget karpermeabilitet og aktivering af endotelial proapoptotisk caspase-3, såvel som formindskelsen af signalet for CD31 (PECAM),35 som regulerer endotelforbindelsens integritet.36 CD31-syntese og ekspression ved celleforbindelser nedreguleres af inflammatoriske cytokiner, der udtrykkes af aktiverede mastceller (TNF- og IFN-), som øger vaskulær permeabilitet.37,38Desuden reguleres vævsfaktorinduktion af thrombin gennem PAR-1-aktivering af CD31, og CD31-knockout-mus udviser øget tubulær epitel- og endotel-apoptose, øget fibrinaflejring og vævsfaktorekspression.39Følgelig kan PPACK PFC NP's evne til at bevare CD31-ekspression være afgørende for at begrænse den igangværende aktivering af koagulationskaskaden og for at opretholde endotelintegritet.
Der eksisterer en lokal sammenhæng mellem inflammation og koagulation i forlængelsesfasen af AKI, der begrænser ydre marv kapillær perfusion, hvilket forårsager forlænget regional iskæmi/hypoxi, som derefter forringer reparation og regenerering af tubulære celler.4 Et vedvarende fald i antallet af mikrokar i den indre stribe af den ydre medulla i AKI indikerer, at karskade fortsætter, og VEGF-signalering undertrykkes.40–42Desuden er der rigelige beviser for, at vaskulær sjældenhed fremkalder kronisk hypoxi, der fører til progressiv tubulointerstitiel fibrose.43I modellen for akut iskæmi/skade hos rotter er de proksimale tubuli særligt følsomme over for hypoksi, der manifesterer sig ved tubuluscelleudslip og endda total opløsning, hvilket giver overdreven dødelighed.44,45 Faktisk har Humphreys gruppe også vist, at renal mikrovaskulær beskæring er en varsel om kronisk nyresygdom.46
Vores data bekræfter også, at vaskulær skade fremmer RBC-indfangning og ikke-hæmaflejring (figur 4 og 5), som kan forværre kronisk nyresygdom,47men som er modtagelig for antitrombinbehandling. Vævsjernkilden i både glomerulære og tubulære celler (figur 5) stammer utvivlsomt fra nedbrydning af røde blodlegemer i disse områder som en konsekvens af blødning og/eller mikrovaskulær trombose, i overensstemmelse med et billede af vaskulært kompromis, der mildnes af anti-trombinterapi. Følgelig kan tilgange, der bevarer vaskulær integritet, repræsentere et kritisk første skridt mod at opretholde forsyningslinjerne for næringssubstrater, der letter hurtigere heling af beskadigede rørstrukturer.
Interessant nok ser PPACK PFC NP ud til at tilbyde tidlig beskyttelse af vaskulære strukturer og dæmpe forskellige markører for inflammation (figur 6 og 7; Supplerende tabeller 2-4) i både cortex og medulla. I traditionelle eksperimentelle undersøgelser af AKI antages cortex at være mere modstandsdygtig over for skader end medulla på grund af lavere metabolisk efterspørgsel, men endotelaktivering og patofysiologisk inflammation forekommer udbredt, som det fremgår af vores lipidomiske og histokemiske assays. Desuden stemmer den brede aflejring af ikke-hæm-jern som et biprodukt af nedbrydningen af fangede røde blodlegemer i både cortex og medulla – og dets afbødning af anti-thrombin-nanopartikler – med et generaliseret mønster af inflammation og skade, selvom cortex kan vise sig at være mere forbigående og let påvirket end medulla i løbet af sygdomsforløbet.
Den overraskende tidlige respons af mastcelleinfiltration inden for 24 timer (figur 8) antyder en vigtig rolle for andre inflammatoriske celler end traditionelle spillere såsom neutrofiler og makrofager. Mastceller betragtes typisk som mediatorer af allergiske reaktioner, men der er en mængde litteratur om deres patofysiologiske implikationer ved akut og kronisk nyreskade.48–52 Selvom neutrofiler er tidlige respondere på vævsskade, kommer makrofager ikke ind i billedet før senere i den inflammatoriske proces, hvilket tyder på, at mastceller spiller en vigtig rolle i den tidlige fase af AKI. Faktisk har Danelli et al vist, at mastcelledegranulering forekommer tidligt i AKI, og at udtømning af mastceller på tidspunktet for AKI-induktion, men ikke 48 timer senere, giver en langsigtet gavnlig effekt på nyrefunktion, atrofi og fibrose.53Lignende konklusioner blev nået af Tong et al i cromolyn-stabiliserede mastcelleprocedurer udført før reperfusion.54 Summers har vist, at mus med mastcelledeficient (KitW-sh/W-sh) lider mindre iskæmisk skade end vilde typer, og at de uddyber reducerede niveauer af leukocyt-kemoattraktanter.55
Mastceller udtrykker proteaseaktiverede receptorer Mastceller udtrykker proteaseaktiverede receptorer (PAR'er), der kan aktiveres af thrombin til at degranulere og udlede en lang række præformede kemokiner, cytokiner og bioaktive lipider.56-58 Thrombin forårsager også mastcelleadhæsion til matrix proteiner (f.eks. fibronectin) og interleukinekspression (f.eks. IL-6) gennem PAR- 1-interaktioner.59Efter thrombinhæmning observerede vi reducerede niveauer af PGD2, som er i overensstemmelse med en relativ udtømning af mastceller, fordi PGD2 er et primært bioaktivt eicosanoid, der udskilles af mastceller i reaktioner af allergisk type.60 Desuden er nedreguleringen af ICAM-1 og VCAM-1 efter anti-thrombin-nanopartikelbehandling er i overensstemmelse med reduceret mastcelleinfiltration, da de udtrykker LFA-1 og VLA og bruger adhæsionsmolekyler til at få vævsindtrængning.29,30
En specifik patogen rolle for PGD2 selv i udviklingen af renal IRI er hidtil ikke blevet beskrevet, så vidt vi ved, men det tjener som en klar biomarkør for mastcelleaktivering.52Ved lungebetændelse har PDG2 vist sig at øge makrofags proinflammatoriske cytokinekspression gennem dets receptorer (DP1 og DP2), som derefter aktiverer neutrofil influx.61 Vores observation af øget M-CSF og IL-6 (figur 8) i AKI som er nedreguleret af PPACK PFC NP via mastcellesuppression ville være i overensstemmelse med en sådan formodet mekanisme. Men da mastceller vides at frigive et væld af faktorer, der potentielt er skadelige for nyrefunktionen, 51,52 kan et hvilket som helst antal ansvarlige determinanter blive genstand for fremtidig undersøgelse med henblik på kontrol med thrombinhæmning eller andre molekylært målrettede midler. Følgelig kunne indgreb, der forsinker tidlig mastcelletiltrækning og degranulering, være yderst beskyttende for vaskulær integritet og nyrefunktion som manifesteret af lokal trombinhæmning i de foreliggende data.
Begrænsninger
Disse undersøgelser var ikke designet til at belyse vedvarende fordele ved trombinhæmning, da AKI-modellen er fokuseret på tidlig beskyttelse mod IRI og relaterede mekanismer. Hvorvidt langsigtede fordele ved en enkelt dosis anti-thrombin-nanopartikler kan begrænse progression til kronisk nyresygdom er uden for rammerne af denne rapport og ville kræve en anden eksperimentel model og hypotese. Desuden er det tidsmæssige vindue af mulighed for at opnå funktionel genopretning ved at hæmme thrombin i forlængelsesfasen af AKI ikke behandlet her, men er et emne af interesse for fremtidige undersøgelser. I hvilket omfang de vigtigste fordelagtige virkninger af lokal thrombinhæmning i AKI skyldes undertrykkelse af mastcelleaktivering forbliver formodet, men vil kunne testes i efterfølgende detaljerede mekanistiske undersøgelser. Men selvom de signifikante lineære korrelationer mellem mastcelleantal, CD31 og BUN ikke nødvendigvis etablerer årsag og virkning, understøtter deres overensstemmelse et stærkt forhold mellem mastceller og vaskulær skade i de tidlige stadier af nyre IRI. Endelig er brugen af PPACK som anti-thrombin-delen kun ét eksempel på en konjugerbar terapeutisk ingrediens, der kan leveres sikkert og lokalt på en nanostruktur for at dæmpe thrombin-signalering.
1. Benoit SW, Devarajan P. Akut nyreskade: nye farmakoterapier i aktuelle kliniske forsøg. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.
2. Chen H, Busse LW. Nye terapier til akut nyreskade. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.
3. Bonventre JV, Yang L. Cellulær patofysiologi af iskæmisk akut nyreskade. J Clin Invest 2011;121:4210-21.
4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Patofysiologi af iskæmisk akut nyreskade. Nat Rev Nephrol 2011;7:189-200.
5. Bonventre JV. Patofysiologi af AKI: skade og normal og unormal reparation. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.
6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB, et al. Overvindelse af translationelle barrierer ved akut nyreskade: en rapport fra en NIDDK-workshop. Clin J Am Soc Nephrol 2018;13:1113-23.
7. Zuk A, Bonventre JV. Nylige fremskridt inden for akut nyreskade og dens konsekvenser og indvirkning på kronisk nyresygdom. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.
8. Rahman A, Fazal F. Blokering af NF-kappaB: et inflammatorisk problem. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.
9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. Nox1-transaktivering af epidermal vækstfaktor-receptor fremmer udskillelse af N-cadherin og migration af glatte muskelceller. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.
10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne PA, Schneider H, et al. Thrombin inducerer selektivt transskription af gener i humane monocytter involveret i inflammation og sårheling. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.
11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, ten Cate H. Er thrombin en nøglespiller i 'koagulations-atherogenese'-labyrinten? Cardiovasc Res 2009;82:392-403.
12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA, et al. Enkeltcelleprofilering af AKI i en murin model afslører nye transkriptionelle signaturer, profibrotisk fænotype og epitel-til-stromal krydstale. Journal of the American Society of Nephrology: JASN 2020;31:2793-814.
13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Celleprofilering af akut nyreskade hos mus afslører bevarede cellulære responser på skade. Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:15874-83.
14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Thrombin-hæmmende perfluorcarbonnanopartikler giver en ny strategi til behandling og magnetisk resonansbilleddannelse af akut trombose. Journal of thrombosis and hæmostase: JTH 2011;9:1292-300.
15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams T, Lanza G, Tollefsen D, et al. Thrombin-hæmmende nanopartikler udgør hurtigt alsidige og påviselige antikoagulationsoverflader. Nanoteknologi 2014;25:395101.
16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette M, Hu L, et al. Antithrombin-nanopartikler forbedrer nyreperfusion og beskytter nyrefunktion efter iskæmi-reperfusionsskade. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73
