Undertrykkelse af betændelses-associeret nyreskade efter transplantation ved hjælp af den nye PrC-210 frie radikaler i rotter

Torsten R. Goesch ¹, Nancy A. Wilson², Weifeng Zeng², Bret M. Verhoven², Weixiong Zhong²,Maya M. Coumbe Gitter³og William E. Fahl^1,3,*

Abstrakt:

Allograftnyretransplantation, som udløser værtscellulær- og antistofmedieret afstødning afnyre, er en væsentlig bidragyder til nyreskade under transplantation. Her spurgte vi, om PRC-210 ville undertrykke skader set i allotransplanterede nyretransplantationer. Brown Norway (BN) rottenyrer blev perfunderet in situ (UW Solution) med eller uden tilsat 30 mM PrC-210 og derefter straks transplanteret til Lewis (LEW) rotter. 20 timer senere blev de transplanterede BN-nyrer og LEWrat-plasma analyseret.Nyrehistologi og nyre-/serumniveauer af flere inflammationsassocierede cytokiner blev målt for at vurdere mismatch-relateret nyrepatologi og PrC-210beskyttende effektivitet. Tyve timer efter allotransplantationerne: (i) signifikant histologisk nyretubulibeskadigelse og mononukleær inflammatorisk celleinfiltration blev set i allotransplantatets nyrer; (ii)nyrefunktionsmålinger (kreatinin og BUN) var signifikant forhøjede; (iii) signifikante ændringer i nøglecytokiner, dvs. TIMP-1, TNF-alfa og MIP-3A/CCL20, og nyreaktiverede caspaseniveauer blev set. I PRC-210-behandlede nyrer og modtagerrotter blev (i) nyrehistologisk skade (Banff Scores) og mononukleær infiltration reduceret til ubehandlede baggrundsniveauer; (ii) kreatinin og BUN blev signifikant reduceret; og (iii) aktiverede caspase- og cytokinændringer blev signifikant reduceret, nogle til baggrunden. Som konklusion tyder resultaterne på, at PrC-210 kunne give bredt anvendelig organbeskyttelse til mange allotransplantationstilstande; det kunne beskytte transplanterede nyrer under og efter alle stadier af transplantationsprocessen – fra organdonation, gennem transport, re-implantation og postoperativ inflammation – for at minimere akut og kronisk afstødning.

Keywords: nyreallotransplantat; nyreafstødning; iskæmi

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

maca ginseng cistanche

1. Introduktion

Nyresvigt i slutstadiet forårsager mere end 1,2 millioner dødsfald årligt på verdensplan [1].Nyretransplantation er den foretrukne behandling for patienter med nyresygdom i slutstadiet. Over 90,000 nyretransplantationer udføres hvert år på verdensplan.

Selve transplantationsprocessen inducerer betydelig cellulær og organskade pånyre, hvilket reducerer organets langsigtede overlevelse. De tre primære fornærmelser mod en nyre under en allotransplantattransplantation er (i) reaktive oxygen- og nitrogenarter (ROS og RNS)-induceret skade under kold iskæmi ('kold-opbevaring) [2], (ii) ROS-induceret skade ved implantation ('re-perfusionsskade') [3], og (iii) post-allotransplantat-transplantationsinflammation, som udløser den medfødte immunrespons og antistof-medieret afstødning (ABMR) [4].

Neutrofiler og makrofager migrerer ind i det beskadigede transplantat inden for 6 timer efter reperfusion og stimulerer kemokinsyntese i residente dendritiske celler, som derefter aktiverer T-lymfocytter og rekrutterer adaptive immunceller. Når først disse immunceller infiltrerer de proksimale tubuli-epitelceller, producerer de myeloperoxidase i neutrofiler og nikotinamid-adenindinukleotidphosphat (NADPH)-oxidase i makrofager, som begge bidrager til lokal produktion af frie radikaler. Disse inflammatoriske processer fører til en aktivering af komplementvejen og yderligere celleomdannelse og lysis inyreallograft [5].ABMR kan forekomme som et resultat af enten eller begge, prædannet alloantistof mod transplantatet eller gennem de novo udvikling af donorspecifikt antistof (dnDSA) [5-7]. Den akutte (min/dage), overgang til kronisk (dage/uger), inflammatorisk respons i allotransplantat-nyren, med kontinuerlig produktion af ROS og inflammatoriske cytokiner, kan etablere en alvorlig, selvvedvarende respons, der forårsagernyreorgansvigt.

For bedre at forstå de cellulære og molekylære veje involveret i patogenesen afnyreallograft inflammation og afstødning udviklede og karakteriserede vi en rottemodel, der replikerer de fleste af de kliniske kriterier for det medfødte immunrespons, ABMR og nyreorgantab [8]. Denne model er blevet brugt til at evaluere en række nye post-allograft-transplantationsstrategier.

De to i øjeblikket anerkendte tilgange til at reducere den akutte og langsigtede immunrespons modnyreallotransplantat er: (i) for at øge chancen for at finde en krydsmatchet donor, og (ii) at fjerne allerede eksisterende antistoffer modnyreallograft ved hjælp af desensibiliseringsprotokoller [9,10].

I arbejdet beskrevet i dette manuskript spurgte vi, om en tredje tilgang til at undertrykke akut og længerevarende inflammationsalvor ville være gavnlig. Vi administrerede den øjeblikkeligt virkende frie radikaler, PRC-210, begge til det implanterede allotransplantatnyreog til modtagerrotten for at bestemme, om inflammations-associeret ROS-skade kunne undertrykkes. Selvom konceptet med at undertrykke inflammationsassocieret ROSinnyretransplantation er ikke nyt, det er brugen her af den nye, umiddelbart virkende PRC-210 ROSscavenger. Både øjeblikkelig og kronisk fjernelse og inaktivering af inflammationsgenererende og genererede frie radikaler i det nyligt transplanterede allotransplantatnyrewould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95 procent DNA-skade i ubeskyttede kontroller [16]. I to tidligere gnavernyretransplantationsundersøgelser [16,17] blev PRC-210 vist at undertrykke ROS-induceret nyreskade induceret under (i) 30 timers køleopbevaring [17] og (ii) reperfusionsskade efter implantation [16 ] til baggrundsniveauer, hvorved to væsentlige kilder til skade på de transplanterede nyrer fjernes. PRC-210-molekylet har også vist sig at undertrykke fri radikal-induceret skade i flere andre organindstillinger [15,18]. Derfor antog vi, at PrC-210 også skulle være i stand til at beskytte et allotransplantat mod oxidativt stress, der genereres af BÅDE (i) cellulære- og (ii) antistof-medierede afstødningsprocesser, der producerer frie radikaler som et biprodukt.

For at udforske denne hypotese udviklede vi en ny rottemodel, som undgik induktion af større iskæmiske og reperfusionsbegivenheder og administrerede PrC-210 både før og efter implantation. Brune rottenyrer blev skyllet med UW-opløsning indeholdende PrC-210 og straks transplanteret til syngene Lewis-rotte-recipienter. Kold iskæmisk tid blev praktisk talt elimineret. Umiddelbart efter implantatet og i 8 timer efternyreimplantat, modtog modtagerrotter systemiske PrC-210-injektioner i doser, der ville muliggøre kontinuerlig fjernelse af frie radikaler i de transplanteredenyre. Transplanterede nyrer og blodplasma blev derefter høstet 20 timer efter transplantation for at muliggøre måling af både PrC-210-tildelt (i) undertrykkelse af inflammatoriske biprodukter og (ii)nyrebeskyttelse.

maca ginseng cistanche

2. Materialer og metoder

2.1. Dyr

Voksne (200-250 g) Lewis- og BN-hanrotter blev købt fra Envigo (Indian-napolis, IN, USA) og anbragt i dyreplejefaciliteten ved University of Wisconsin i Madison, WI, USA. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med dyrepleje- og brugspolitikkerne ved University of Wisconsin. Dyresundhedsvedligeholdelse, herunder dyredødsfald, stuetemperatur, 12 timers lys/mørke cyklusser og burrengøring, blandt andre sanitære opgaver, blev udført dagligt af dyreplejepersonale. Mad og vand var tilgængeligt ad libitum. Denne forskning blev prospektivt godkendt af School of Medicine and Public Health Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Wisconsin (Animal Protocol #M005204). Alle grupper indeholdt 4-6 dyr.

2.2. Materialer

Syntese af PrC-210 HCl-aminothiol, et præklinisk molekyle, blev beskrevet separat [19,20]. PrC-210 HCl-krystaller (3-(methylamino)-2-(methylmonomethyl)propan-1- thiol) opbevares under en nitrogenatmosfære ved -20 ◦C, og endda med rutine optøning, brug og genlagring, krystallinsk PrC-210 er fuldstændig stabil i mere end 4 år ved massespektrometrianalyse. Andre kemiske reagenser blev opnået fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). UW Organ Preservation Solution blev købt fra Bridge to Life, Columbia, SC, USA.

2.3. Kirurgisk og eksperimentel procedure

Transplantationsproceduren anvendt i disse eksperimenter er vist i figur 1. I BN-donorrotten, efter dobbelt ligering af aorta, ligering af højre nyrearterie og vene og kirurgisk snit af venstre nyrevene, venstre rottenyreblev perfunderet in situ under anvendelse af 5 ml stuetemperatur UW-opløsning (over en 15 s periode). Perfusatet var enten UW-opløsning alene (for grupperne "0 h" og "20 t ingen behandling") eller UW-opløsning, hvortil krystallinsk PrC-210 opnåede 30 mM [17], var blevet tilsat, opløst med det samme og derefter pH justeret til start-UW Solution pH på 7,4 ved at tilsætte 0,0619 µL 5N NaOH pr. µmol PrC-210 HCL-salt (FW: 220). Halveringstiden for PrC-210 thiol (aktiv form) er ca. 3,5 timer i fysiologiske pH-opløsninger såsom UW-opløsning og humant blod [14]. Efter in situ perfusion, venstre BNnyreblev kirurgisk fjernet og derefter sutureret ved stump anastomose af kar og urinleder ind i det forladte venstre nyrested hos LEW-recipientrotten. Den rigtige LEWnyreblev ligeret og fjernet umiddelbart før. Fem minutter efter kirurgisk lukning af LEW-rotten modtog rotten en systemisk PrC{{0}}-dosis (121 ug PrC-210 HCl pr. g legemsvægt, hvilket svarer til 0.24 X maksimal tolereret dosis) ved intraperitoneal injektion. Som vist i figur 1-skemaet modtog rotten også intraperitoneale injektionsdoser af PrC-210 (0,24 MTD) ved plus 4 timer og plus 8 timer efter transplantationen. Rotter blev aflivet i plus 20 timer efter transplantation, ognyrerog plasmaprøver blev indsamlet til analyse. Der var mindst fem rotter i hver behandlingsgruppe.

2.4. Serum BUN og kreatinin målinger

BUN og kreatinin blev målt i serumprøver under anvendelse af Catalyst One AnalyzerTechnology (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA).

2.5. Enzym-linked immunosorbent assays

Assays blev udført som beskrevet i ELISA kit-protokollerne (rotte TIMP-1, kat# RTM- 100; rotte MIP3-A, kat# DY540; rotte TNF-alfa, kat# RTA{ {5}}; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Kort fortalt blev fortyndinger af rotteplasma tilsat til præ-coatede plader, inkuberet i 2 timer ved 37 °C. biotin-konjugeret antistof specifikt for det analyserede protein blev derefter tilsat og inkuberet i 1 time ved 37 °C, vasket, avidin-konjugeret peberrodsperoxidase blev tilsat, efterfulgt af vask og TMB-substrattilsætning. Reaktionen blev inkuberet i 10-30 minutter, stoppet med svovlsyre og aflæst ved 450 nm.

2.6. Proteome Profiler Rotte Cytokine Array

Assays blev udført i det væsentlige som beskrevet i produktprotokollen. Kort fortalt blev plasma inkuberet med nitrocellulosemembraner plettet med indfangnings- og kontrolantistoffer. Efter inkubation blev membranerne vasket og inkuberet med streptavidin HRP. I en afvigelse fra protokol brugte vi SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, USA; Kat # 34094) til kemiluminescensdetektion, da det gav et stærkere signal. Blots blev visualiseret på et FotoDyne gel doc-system.

2.7. Histologi

Formalin-fikseret (10 procent formalin), paraffin-indlejret,nyrerblev skåret i 5 um sektioner. Objektglassene blev deparafiniseret, rehydreret fra xylen gennem en gradueret ethanolserie til vand og efterfølgende behandlet som beskrevet nedenfor. Slides blev scannet ved hjælp af et 20- objektiv i en Aperio Digital Pathology Slide Scanner. Alle H&E-objektglas blev gennemgået af Dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, transplantationspatolog og scoret for PTC, glomerulitis (g), vaskulitis (v)/intimal arteritis, interstitiel inflammation (I) og C4d-farvning ifølge Banff 2009 [21].

Separat blev objektglas tildelt et blindt nummer, og ikke-overlappende digitale billeder af nyretubuli blev taget ved grænsefladen mellem medulla og cortex fra hvert H/E-glas. Der blev sørget for ikke at inkludere store karlumener og glomeruli. Automatisk kvantificering af røde og blå pixels i hver 10-nyrebillede blev udført ved hjælp af en brugerdefineret makro skrevet i ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/index.html

tilgået den 13. april 2021). Røde pixels reflekterede proksimal rørformet tykkelse inklusive børstekant. Kerner blev kvantificeret i den blå kanal. Forholdet mellem blå nukleare pixels og røde tubuli gav en inflammatorisk infiltrationsscore for hvide blodlegemer i post-transplantationennyrer. Score blev beregnet som gennemsnit og plottet under anvendelse af Graphpad Prism.

2.8. Aktiveret Caspase-enzymaktivitet

Aktiveret caspase 3 og 7 aktivitet inyrehomogenat supernatanter blev bestemt ved anvendelse af Apo-ONE fluorescerende substrat (Promega, Madison, WI, USA) [16]. Kort optøetnyrerblev blandet med 8- gange overskydende lyseringsbuffer indeholdende 50 mM Na HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 procent glycerol og homogeniseret ved 4 º C i 30 s med en Omni-vævshomogenisator . Nyrehomogenatet blev centrifugeret ved 4°C (16,000- g) i en Eppendorf-mikrofuge i 20 min. Supernatterne blev straks analyseret for caspaseaktivitet og proteinindhold ved Bradford-metoden under anvendelse af bovint serumalbumin som standard. Det aktiverede caspase-assay blev udført som følger: 5 uL supernatant (~40 ug supernatant protein) blev fortyndet til et samlet volumen på 50 uL med ovenstående lysisbuffer, blev blandet med 50 uL af det ufortyndede Apo-ONE-substrat i brønden af en sort, uigennemsigtig plade med 96 brønde for at initiere 60 minutters reaktion. Pladerne blev rystet ved 200 RPM ved 37 °C i 60 min. DEVD caspase substrat peptid spaltningen blev målt ved hjælp af en BMG Clariostar fluorescerende pladelæser ved en excitationsbølgelængde på 499 nm og en emissionsbølgelængde på 521 nm. En caspase-standard blev inkluderet i hvert forsøg.

2.9. Rottenyre mitokondrier

Den oprensede mitokondrielle fraktion blev fremstillet fra homogeniseret rottenyrerved en standard centrifugeringsteknik [22]. De oprensede mitokondrier blev suspenderet i 0,15 M Tris HCl-buffer, pH 7,4.

For at bestemme, om tilsætning af eksogent PrC {{0}} undertrykker ROS-induceret fragmentering af mitokondrielt DNA [22], i et 25 uL reaktionsvolumen (i et PCR-rør), tilføjede vi: 1{{29} } uL oprensede mitokondrier, 5 uL PrC-210-fortynding eller vand (PrC-210 blev tilsat 10 minutter før Fe plus plus plus ADP plus H2O2 ●OH-generatoren), og 10 uL indeholdende FeCl2 (2,5 mM; FW:127), adenosin 5'-diphosphatnatriumsalt (10 mM; FW: 427) og H2O2 (0,003 procent slutkoncentration). Efter 20 minutter ved 37 °C blev 10 µl af reaktionen blandet med 5 µl 6- gel-ladningsfarve indeholdende 0,3 procent SDS; rør sat i 60 °C vand i 1 min., 10 ul blev derefter fyldt i en brønd af en 1 procent agarose TAE gel, og efter 60 minutter ved 60 volt blev geler farvet og fotograferet. Der blev udført mindst tre replikater for hvert assaypunkt for at muliggøre statistisk sammenligning.

2.10. Statistisk analyse

Data er udtrykt som gennemsnittet plus /一 STD'er. Elevens t-test blev brugt til at bestemme statistisk forskel og p-værdier ved hjælp af GraphPad Prism 7.03 software. p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

3. Resultater

3.1. PrC-210 undertrykkelse af nyreallograftpatologi

20 timer efter transplantationen var histologien af ​​det transplanterede BNnyrer(Figur 2A-D) behandlet med UW-opløsning alene viste tydeligt øgede Banff-score for tubulitis og peritubulær kapillaritis (røde og gule pile); de summerede patologiscore er vist i panel E. BNnyrerperfunderet med PrC{{0}}indeholdende UW-opløsning og modtagelse af post-implantation intraperitoneale systemiske doser af PrC-210 (figur 2D) viste tydeligt undertrykt inflammatorisk patologi til nyrerne og undertrykte Banff-score for tubulitis og peritubulær kapillaritis lig med Banff-scorer for "0 h" kontrol BN-gruppen (figur 2E). Administration af PrC-210 gav signifikante reduktioner i både kreatin (p=0.032) og BUN (p=0.046) nyreskademarkører.

3.2. Aktiverede Caspase-niveauer i post-transplanterede nyrer

Niveauer af aktiveret caspase i BNnyrehomogenater blev signifikant reduceret i BN allograftnyrersom ikke blev udsat for PrC{{0}}-behandling i løbet af 20 timer efter transplantation (figur 5). Perfusion af BN-nyrer med PrC-210-indeholdende UW-opløsning og transplantation i Lewis-rotter, der modtog systemiske PrC-210-doser, resulterede i den samme aktiverede caspaseaktivitet som den, der ses i kontrolnyrerne "0 timer".

3.3. Inflammatoriske cytokinniveauer efter BN nyreallograft

I screeningseksperimenter,nyrehomogeniserede supernatanter fra 0 timers kontroller og 20 timers ingen behandlingnyrerblev screenet med Proteome Profiler 29 cytokin-array for at detektere ændrede, betændelsesassocierede, cytokin- og kemokin-ekspressionsniveauer 20 timer efter transplantation. Som vist i de to figur 6 mikroarray-indsættelser blev der set ændringer i TIMP-1, TNF-alpha og MIP-3a/CCL20. Individuelle ELISA-plader blev derefter brugt til at kvantificere disse ændringer i nyrehomogenater og sera, nu inklusive rotter behandlet med PrC-210 også. Både TIMP-1- og TNF-alfa-niveauer blev øget 20 timer efter transplantation, og i begge tilfælde blev deres niveauer faldet i nærvær af PrC-210 (figur 6A-C). MIP-3a/CCL20-niveauer blev øget efter 20 timer, men de steg signifikant højere i PrC-210-behandlede rotter (figur 6D).

3.4. PrC-210 Beskyttelse af rottenyre mitokondrier

Vedvarende mitokondriefunktion under og efternyretransplantation er nødvendig for overlevelsen af ​​det transplanterede organ. ROS genereret under transplantationsassocieret iskæmi, iskæmi-reperfusion og post-implantat inflammation kan alle påvirke nyre mitokondrie ydeevne og overlevelse. På grund af den vigtige mitokondrielle rolle isolerede vi mitokondrier fra rottenyrer og bestemte, om PrC-210 ved opnåelige farmakologiske koncentrationer kunne beskytte disse organeller mod en ROS-fornærmelse.

I figur 7, renset rottenyremitokondrier blev inkuberet med en ●OH-generator [23]. Efter den korte reaktion så vi signifikant ROS-fragmentering af rottenyre-mitokondrie-DNA. Efter ROS-fornærmelsen blev en alikvot af mitokondrierne solubiliseret i SDS-holdig gel-loading buffer, og mitokondrielt DNA blev separeret og "størrelsesbestemt" ved anvendelse af agarosegelkromatografi (figur 7). ROS-fornærmelsen reducerede klart middelstørrelsen af ​​mitokondrie-DNA fra rottenyre (bane b), og tilføjelsen af ​​PrC-210 til mitokondrierne forhindrede DNA-brud (baner c–g) i en PrC-210 koncentrationsafhængig måde.

maca ginseng cistanche

4. Diskussion

Allograftnyretransplantation, som udløser medfødt værtscellulær- og antistofmedieret afstødning af nyren, er en væsentlig bidragyder til kort- og langsigtetnyreskade under transplantation, og den tilhørende Delayed Graft Function ses i op til 50 procent af de transplanterede nyrer. Vi foretog denne undersøgelse for at bestemme, om PrC-210 ville være effektiv til at undertrykke sværhedsgraden af ​​skaden induceret efter en allograft nyretransplantation i en rottemodel, der stort set eliminerer transplantatiskæmisk tid og dets associerede oxidative stress. Vores antagelse var, at denne tilgang skulle give os mulighed for at se virkningen af ​​PrC-210 på inflammationsfornærmelsen efter transplantation med minimal iskæmiinterferens.

Stigningen i TNF-alfa og betydelig mononukleær infiltration viser, at allograft nyretransplantation inducerer udtalt akut inflammation i de 20 timer efter transplantationen, og dette var korreleret med skaden af ​​de tubulære nyreceller set inyrehistologi (Banff Scores). TNF-alfa produceres hovedsageligt af aktiverede makrofager og er et cellesignalerende protein involveret i akut inflammation. Det er tæt forbundet med patogenesen af ​​akut og kronisk allotransplantatafstødning [24].

I modsætning til ovenstående fund i ubehandlet BNnyrer, PrC-210 givet som en del af UW-opløsningen og administreret systemisk i post-transplantationsrotterne reducerede både TNF-alfa-niveauet og nyreinfiltration af mononukleære celler, som begge er tegn på reduceret akut inflamation. PrC-210 reducerede nyreskaden som set i de histologiske nyreskadescores (Banff Scores) til ubehandlede baggrundsniveauer og sænkede niveauerne af både nyrepatologisk funktionsscore, kreatinin og BUN.

Inflammation i ubehandlede BN-nyrer var forbundet med en stigning i både TIMP-1 og MIP-3A/CCL20. Til sammenligning så vi, at PrC-210-behandling signifikant reducerede TIMP-1-niveauet og øgede MIP-3A/CCL20-niveauet signifikant.

Vævsinhibitor af metalloproteinase-1 (TIMP-1) er en vigtig regulator af ekstracellulær matrix (ECM) syntese og nedbrydning. Overskydende ECM-akkumulering er den vigtigste patologiske mekanisme for udvikling af fibrose under og efter akut nyreskade. Der er stort set intet udtryk for TIMP-1 i normalnyrevæv [25], en observation, som er bekræftet i vores figur 6A, B, men TIMP-1 er kendt for at blive udtrykt i beskadigede nyrer, hovedsageligt i renale tubulære epitelceller, renal tubulær basalmembran og cytoplasma af interstitiel celler. Øget TIMP-1-ekspression var positivt korreleret med den samtidige forringelse af nyrefunktionen [26]. Rotter behandlet med PrC-210 viste en markant reduktion i TIMP-1-niveauer (p=0.001), både i nyrehomogenat og plasma; dette indebærer, at PrC-210 udøver en stærk beskyttende effekt mod transplantationsinduceret reorganisering af den ekstracellulære nyrematrix.

Kemokinet MIP-3a/CCL20 aktiverer CCR6-receptoren, som især udtrykkes på regulatoriske T-celler (Tregs). CCL20 udtrykkes af tubulære endotelceller og interstitielle celler og er også opreguleret i nyrer med akut nyreskade. CCL20-CCR6-vejen spiller en vital rolle i Treg-medieret T-celle-rekruttering til nyren, og Tregs er blevet beskrevet at have en positiv rolle inyrereparation, transplantationstolerance og nyreoverlevelse. Både antistofblokering af CCL20-CCR6-vejen, såvel som brugen af ​​CCR-6-deficiente mus i akuttenyreskadesforsøg, viste sig at øge sværhedsgraden af ​​nyresvigt og dødelighed [27]. Dette tyder på, at klinisk CCL20-CCR6 pathway enhancement og Treg-aktivering kan være en mulig terapeutisk vej til at begrænse akutte og kroniskenyreskade [28]. I vores undersøgelse (figur 6D) var MIP-3a/CCL20-niveauet signifikant højere hos PrC-210-behandlede rotter end hos ubehandlede rotter. Vi spekulerer i, at dette er en af ​​årsagerne til både (i) den signifikant lavere rekruttering af mononukleære celler til nyrerne (Figur 3C) og (ii) den signifikant reducerede nyreskade (Figur 2) hos de PrC-210-behandlede rotter .

Normal nyre-mitokondriel funktion, og vigtigst af alt, fornærmelser mod den under nyreopbevaring, implantation og post-implantationsbetændelsestrin er væsentlige determinanter for ROS-skade og nyresvigt under transplantation. Det var således signifikant, at PrC-210 viste sig at give fuldstændig undertrykkelse af mitokondriel DNA-fragmentering (figur 7) ved koncentrationer (2-4 mM), der er blevet opnået i plasma fra både mus og rotter, der fik enten intraperitoneal eller orale systemiske 0.5 MTD-doser af PrC-210, der blev tolereret uden påviselig toksicitet [29].

I vores tidligere nyretransplantationsrelaterede undersøgelser [16,17] så vi betydelige stigninger i aktiveret caspase i nyrer udsat for "kold iskæmi" og "iskæmi-reperfusion" skade. Disse iskæmi-inducerede skader på nyrerne blev reduceret til baggrunden ved behandling med PrC-210 (figur 8). I undersøgelserne af dette manuskript (figur 5), hvor kold iskæmi og iskæmi-reperfusion i det væsentlige blev elimineret ved øjeblikkelig transplantation, var der ingen stigning i aktiveret caspase i transplanterede nyrer. Tværtimod blev aktiveret caspase reduceret signifikant efter plus 20 timer i "No Drug Treatment" kontroller, og PrC{10}}-behandling eliminerede fuldstændigt denne caspasereduktion i plus 20 timers rotter og holdt caspaseniveauet stabilt. Vores fortolkning af disse interessante resultater er, at der mangler nogen signifikant iskæmi-induceret fri radikal fornærmelse gennem ROS og RNS til post-transplantationennyrer, er der ingen associeret celledød og apoptose markører som aktiverede caspaser. I disse allotransplanterede nyretransplantationer regulerer inflammatoriske signaler fra nyligt udtrykte cyto- og kemokiner nu cellemetabolisme, hvilket inkluderer påvirkning af apoptosevejen. Litteraturen beskriver, at overekspression af TIMP-1 fører til undertrykkelse af apoptose [26]. Vores caspase-resultater (figur 5) understøtter denne beskrevne TIMP-1-effekt, og de antyder, at TIMP-1 er vigtig til at regulere patofysiologien af ​​celleskade efter nyre-allotransplantation. Som bekræftelse af den tidligere PrC-210-undertrykkelse af TIMP-1-udtryk (Figur 6A, B), fjernede PrC-210-behandlingen caspaseændringen fuldstændigt og holdt caspaseniveauerne på det samme niveau som i kontrol "0 h" nyrerne. Fordi de reducerede PrC-210 serum TIMP-1-niveauer ved plus 20 timer (figur 6B) nøjagtigt afspejler den signifikante undertrykkelse af allograft: (i) apoptose (figur 5), (ii) histologisk patologi (figur 2 og 3) og (iii) inflammatorisk celleinfiltration (Figur 3), forventer vi, at overvågning af serum TIMP-1-niveauer i humane nyre-allograft-recipienter vil være en logisk måde at overvåge PrC-210 klinisk effekt i fremtidige kliniske forsøg .

I vores hidtidige arbejde [16,17] har vi vist, at PrC-210 er i stand til at beskytte transplanterede nyrer mod både forkølelses-iskæmi og iskæmi-reperfusionsfornærmelser. I denne undersøgelse ser vi nu, at PrC-210 også beskytter allotransplanterede nyrer mod de ikke-iskæmiske inflammatoriske fornærmelser, der opstår efter nyreimplantation. PrC-210 reducerer signifikant niveauer af akutte inflammatoriske cytokiner, såsom TNF-alfa, og undertrykker ekspressionen af ​​TIMP-1-kemokinet. Begge disse hændelser, og potentielt yderligere understøttet af yderligere CCL20-ekspression, forventes at: (i) reducere allotransplantat-nyreskade, (ii) undertrykke T-celle-rekruttering til nyren og (iii) undertrykke aktivering af den medfødte og adaptivt immunsystem. I figur 8 opsummerer vi disse resultater for at understøtte den rolle, som vi føler, at PrC- 210 kan spille i human nyretransplantation; det undertrykker: (i) kold iskæmi reaktive oxygenarter (ROS) og reaktive nitrogenarter (RNS) skader på baggrund [17],

(ii) iskæmi-reperfusion ROS-beskadigelse af baggrunden [16] og (iii) allograft-inflammationsskader væsentligt, i nogle tilfælde, til baggrunden. Da den primære PrC-210 virkningsmekanisme for PrC-210 er at opfange frie ilt- og nitrogenradikaler, indebærer dette, at disse frie radikaler er en vigtig bidragyder til nyreskaden, der ses ved ikke-iskæmiske tilstande, dvs. den allograft-associerede betændelse studeret i dette manuskript.

Sammenfattende tyder dette på, at PrC-210 kunne give bredt anvendelig organbeskyttelse til mange allotransplantationstilstande; det kunne beskytte transplanterede nyrer under og efter alle stadier af transplantationsprocessen – fra organdonation, gennem transport, re-implantation og postoperativ inflammation – for at minimere akut og kronisk afstødning.

Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at få prøven

Forfatterbidrag:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV og MMCG deltog i udførelsen af ​​forskningen og dataanalysen; TRG og NAW deltog i forskningsdesign og dataanalyse; WEF og TRG deltog i forskningsdesign, udførelsen af ​​forskningen, dataanalyse og skrivning af papiret. Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering:Denne forskning blev finansieret af UW Institute for Clinical and Translational Research og giver UL1TR002373 til UW ICTR fra NIH/NCATS, American Society of Transplant Surgeons (133 AAA1552), American College of Surgeons (133 AAB2176) og giver støtte til WEF (# R03CA176799).

Udtalelse fra institutionelle revisionsråd: Denne forskning blev prospektivt godkendt af School of Medicine and Public Health Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Wisconsin (Animal Protocol #M005204).

Erklæring om datatilgængelighed:Studiedataene er fuldt tilgængelige i dette manuskript. Interessekonflikter: Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Referencer

1. Wang, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Barber, RM; Bhutta, ZA; Casey, DC; Charlson, FJ; Chen, AZ; Coates, MM; Coggeshall, M.; et al. Global, regional og national forventet levealder, dødelighed af alle årsager og årsagsspecifik dødelighed for 249 dødsårsager, 1980-2015: En systematisk analyse for Global Burden of Disease Study 2015. Lancet 2016, 388, 1459-1544. [CrossRef]

2. Treat, E.; Chow, E.; Peipert, JD; Waterman, A.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Bowring, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et al. Forsendelse af levende donor nyrer og transplantationsmodtagere. arabisk. Archaeol. Epigr. 2017, 18, 632-641. [CrossRef] [PubMed]

3. Vægt, SC; Bell, PR; Nicholson, ML Renal iskæmi-reperfusionsskade. Br. J. Surg. 1996, 83, 162-170. [PubMed]

4. Sellarés, J.; De Freitas, DG; Mengel, M.; Reeve, J.; Reinecke, G.; Sis, B.; Hidalgo, LG; Famulski, K.; Matas, A.; Halloran, PF Forstå årsagerne til nyretransplantationsfejl: Den dominerende rolle af antistofmedieret afvisning og manglende overholdelse. Er. J. Transplantation. 2012, 12, 388-399. [CrossRef]

5. Siedlecki, A.; Irish, W.; Brennan, DC Forsinket graftfunktion i nyretransplantationen. arabisk. Archaeol. Epigr. 2011, 11, 2279-2296. [CrossRef]

6. Hidalgo, LG; Campbell, PM; Sis, B.; Meinecke, G.; Mengel, M.; Chang, J.; Sellars, J.; Reeve, J.; Halloran, PF; Hidalgo, LG; et al. De NovoDonor-specifikke antistof på tidspunktet for nyretransplantation Biopsi associerer med mikrovaskulær patologi og sen graftsvigt. arabisk. Archaeol. Epigr. 2009, 9, 2532-2541. [CrossRef]

7. Loupy, A.; Hill, GS; Jordan, SC Indvirkningen af ​​donor-specifikke anti-HLA-antistoffer på sen nyre-allograftsvigt. Nat. Rev. Nephrol. 2012, 8, 348-357. [CrossRef]

8. Huang, G.; Wilson, NA; Reese, SR; Jacobson, LM; Zhong, W.; Djamali, A. Karakterisering af transfusionsfremkaldt akut antistofmedieret afstødning i en rottemodel for nyretransplantation. arabisk. Archaeol. Epigr. 2014, 14, 1061-1072. [CrossRef] [PubMed]

9. Jordan, SC; Pescovitz, MD Præsensibilisering: Problemet og dets styring. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 1, 421-432. [CrossRef] [PubMed]

10. Stegall, M.; Gloor, J.; Winters, J.; Moore, S.; DeGoey, S. En sammenligning af plasmaferese versus højdosis IVIG-desensibilisering hos nyreallograft-recipienter med høje niveauer af donorspecifikt alloantistof. arabisk. Archaeol. Epigr. 2006, 6, 346-351. [CrossRef] [PubMed]

11. Peebles, DD; Soref, CM; Fahl, WE ROS-fjerner og radiobeskyttende virkning af den nye PrC-210-aminothiol. Radiat. Res. 2012, 178, 57-68. [CrossRef]

12. Soref, CM; Hacker, TA; Fahl, WE En ny oralt aktiv, aminothiol-strålebeskytter-fri for kvalme og hypotension-bivirkninger ved dens højeste strålebeskyttende doser. Int. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701-e707. [CrossRef]

13. Techapiesancharoenkij, N.; Fiala, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforaphane, et kemoforebyggende middel mod cancer, inducerer veje forbundet med membranbiosyntese som reaktion på vævsskade af aflatoksin B1. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015, 282, 52-60. [CrossRef] [PubMed]

14. Jermusek, F.; Benedikt, C.; Dreischmeier, E.; Brand, M.; Under, M.; Jeffery, JJ; Ranallo, FN; Fahl, WE Signifikant undertrykkelse af CT-strålingsinduceret DNA-skade i normale humane celler af PrC-210-strålebeskytteren. Radiat. Res. 2018, 190, 133-141. [CrossRef] [PubMed]

15. Hacker, TA; Diarra, G.; Fahl, BL; Tilbage, S.; Kaufmann, E.; Fahl, WE Signifikant reduktion af iskæmi-reperfusionscelledød i musemyokardieinfarkter ved hjælp af den øjeblikkeligt virkende PrC-210 ROS-renser. Pharmacol. Res. Perspektiv. 2019, 7, e00500. [CrossRef]

16. Bath, NM; Fahl, WE; Redfield, RR Signifikant reduktion af murin nyre-iskæmi-reperfusionscelledød ved hjælp af den øjeblikkeligt virkende PrC-210-reaktive oxygenarter-fjerner. Transplantation. Direkte. 2019, 5, e549–e555. [CrossRef] [PubMed]

17. Verhoven, BM; Karim, AS; Bath, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Redfield, RR; Fahl, WE Signifikant forbedring i rottenyre-kølingsopbevaring ved hjælp af UW-organkonserveringsopløsning suppleret med den øjeblikkeligt virkende PrC-210 frie radikal-fjerner. Transplantation. Direkte 2020, 6, e578. [CrossRef]

18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Ward, JA; Choo, DI; Riazuddin, S.; Ahmed, ZM Radioprotective Effect of Aminothiol PrC-210 på bestrålet indre øre hos marsvin. PLoS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]

19. Copp, RR; Peebles, DD; Fahl, WE Syntese og vækstregulerende aktivitet af et prototypemedlem af en ny familie af aminothiol-strålebeskyttere. Bioorganisk Med. Chem. Lett. 2011, 21, 7426-7430. [CrossRef]

20. Fahl, WE; Peebles, D.; Copp, RR Amino Thiol-forbindelser og sammensætninger til brug i forbindelse med kræftterapi. US patent 7.314.959, 12. april 2004.