Strukturelt design, syntese og antioxidant, antileishmania, antiinflammatoriske og anticancer-aktiviteter af et nyt quercetin-acetyleret derivat

For mere info. kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Quercetin(Q) er et bioflavonoid med biologisk potentiale; dårlig opløselighed i vand, omfattende enzymatisk metabolisme og nedsat biotilgængelighed begrænser imidlertid dets biofarmakologiske anvendelse. Formålet med denne undersøgelse var at udføre strukturel modifikation i Qved acetylering, således at opnå quercetinpentaacetat(Q5)-analogen for at undersøge de biologiske potentialer (antioxidant, antileishmania, anti-inflammatoriske og cytotoksiske aktiviteter) i cellekulturer. Q5 blev karakteriseret ved FTIR-, 'H- og 13C NMR-spektre. Detantioxidantpotentialet blev vurderet mod det radikale ABTS· plus . Det antiinflammatoriske potentiale blev evalueret ved at måle den pro-inflammatoriske cytokintumornekrosefaktor (TNF) og produktionen af ​​nitrogenoxid (NO) i peritoneale makrofager fra BALB/c-mus. Cytotoksicitetstests blev udført ved hjælp af AlamarBlue-metoden i cancerceller HepG2 (humant hepatokarcinom), HL-60 (promyelocytisk leukæmi) og MCR-5 (sunde humane lungefibroblaster) samt MTT-metoden for C6-celler kulturer (rottegliom). Q og Q5 viste antioxidantaktivitet på henholdsvis 29 procent og 18 procent, hvilket er berettiget af udskiftning af hydroxyler med acetylgrupper. Q og Q5 viste koncentrationsafhængige reduktioner i NO- og TNF-produktion (s<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μM). Endelig blev den cytotoksiske overlegenhed af Q5 verificeret (IC50=11 μM), som ved 50 μM i 24 timer inducerede ændringer i morfologien af ​​C6 gliomceller karakteriseret ved en rund kropsform (endnu ikke rapporteret i litteraturen) ). Analogen Q5 havde potentielle biologiske virkninger og kan være lovende for yderligere undersøgelser mod andre cellekulturer, især neurale.

Nøgleord: quercetin;syntese; quercetinpentaacetat; antioxidant; antileishmania; antiinflammatorisk;cytotoksicitetsaktivitet

Klik for at lære mere om produkterne

1. Introduktion

Quercetiner et bioflavonoid med en dokumenteret indvirkning på sundheden og veldokumenterede biokemiske aktiviteter. Denne forbindelse betragtes som en af ​​de mest potente antioxidanter blandt polyfenoler [1-3]. På grund af dets egenskaber er quercetin blevet testet til forskellige terapeutiske anvendelser, som f.eksantioxidant, antiparasitisk,anti-inflammatoriskog anti-cancer aktiviteter [4,5]. I parasitære sygdomme er flavonoider en højinteressegruppe. Dette skyldes deres lave toksicitet i værter og adskillige mekanismer, hvorved de kan modulere patologisk ændrede processer under infektioner [6].Flavonoiderhar flere mål til behandling af leishmaniasis og inkluderer mål, såsom arginase, ribonukleotidreduktase og topoisomerase II [7,8].

Quercetinhar flere anticancer-aktiviteter i flere typer solide tumorer. Desuden har det vist sig at have aktivitet i HL-60-celler (der stammer fra akut myeloid leukæmi (AML)) for signifikant at reducere tumorvækst ved at reducere intratumoralt oxidativt stress, aktivering af det ekstracellulære regulerede kinase-signal (ERK) og efterfølgende apoptose [9]. Quercetin forbedrede det pro-inflammatoriske respons ved at reducere IL-6- og TNF-ekspression med positiv anti-inflammatorisk aktivitet i humane THP1-makrofagerpopulationer [10].

Blandt de forskellige kræfttyper er gliom en af ​​de mest aggressive og med dårlig prognose. Desværre er de vigtigste behandlingsformer (kirurgisk fjernelse, strålebehandling og kemoterapi) ikke effektive. Den gennemsnitlige samlede overlevelse for patienter forbliver på cirka 14 måneder [11]. Ikke desto mindre har nye forbindelser, såsom temozolomid [12], retinoider [13] og flavonoider [14] vist anti-gliom aktivitet. De antitumorale virkninger af quercetin er blevet beskrevet mod celler fra glioblastom, som er den mest aggressive af gliomerne [15].

Unormale immunresponser er involveret i initieringen og udviklingen af ​​en lang række sygdomme, herunder autoimmune sygdomme, allergier, cancer og neurodegenerative sygdomme.Flavonoiderhar potentiel immunmodulerende aktivitet og er undersøgt som alternativer til klinisk brug. Quercetin kan udøve betydelige immunmodulerende virkninger på den cellulære produktion af cytokiner afledt af Th-1- og Th-2-profilen og lymfocytisk proliferation, der regulerer cellulær immunitet[16]. Ydermere kan quercetin differentielt modulere ekspressionen af ​​interleukingener i perifere blodmononukleære celler (PBMC), hvilket favoriserer Th-1-profilen, som fremmer cellulær immunitet ved interferon-gamma (IFN-y), reduktionen af ​​Th{ {6}} profil involveret i humoral immunitet og makrofagaktivering af IL-4 [17].

Den lave vandopløselighed, omfattende metabolisme og enzymatisk nedbrydning begrænser biotilgængeligheden og reducerer den biofarmakologiske brug af quercetin som et terapeutisk middel[13]. En interessant tilgang til at overvinde den lave biotilgængelighed af polyphenoler, for at teste og udforske deres in vivo-aktivitet, er den kemiske modifikation af den naturlige forbindelse, hvilket øger opløseligheden og sænker metabolismen. Mange synteseveje bliver således undersøgt, såsom acetylering, tilsætning af aminer og bromering, modifikation til oximer og kompleksdannelse med hydraziner [18-20].

I denne undersøgelse udfører vi en strukturel modifikation i quercetin med det formål at opnå analogen quercetin pentaacetat (Q5) til evaluering af antioxidantpotentialet, antiinflammatorisk aktivitet og hæmning af væksten af ​​kræftceller, hepatokarcinom (HepG2), promyelocytisk leukæmi (HL-60) og rottegliomceller (C6).

2. Resultater og diskussion

2.1.Syntese og karakterisering

Til syntesen af ​​det analoge quercetin (3,3', A',5,7-pentaacetat) blev den totale acetyleringsmetode anvendt, som var tilpasset de eksperimentelle forhold fundet i litteraturen [21]. På denne måde bevares eddikesyreanhydrid som acyleringsmiddel og pyridin som katalysator.

Det opnåede produkt (Q5), et gult fast stof, var karakteriseret ved at have smeltepunkter i intervallet 178-186 grader, kompatibelt med litteraturdataene[18]. Derudover viste den sammenlignende analyse af FTIR mellem quercetin og produktet fraværet af absorptionsbånd i 3400 cm-1 karakteristisk for quercetinhydroxyler og ved forekomsten af ​​bånd omkring 1600-1650 cm-'indikation af carbonylester , der viser erstatningen af ​​hydroxylgrupper med acetylgrupper: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,8009,1376 og (Figur 1). Spektrene blev sammenlignet med dem, der er beskrevet i litteraturen [21].

Kernemagnetisk resonans (NMR)-analyser af quercetinet (Q) og det opnåede produkt (Q5) viste total acetylering med forsvinden af ​​singletter, der er karakteristiske for hydroxyler over 9 ppm i H NMR-spektret (Supplerende figurer S1, S2 og S{ {4}}S6) og fremkomsten af ​​store og karakteristiske signaler af methyl i de alifatiske områder af spektret, mellem 2 og 3 ppm. For 13C NMR-spektret (Supplerende figurer S3 og S7-S9) viste det opnåede produkt en stigning i de repræsentative signaler for estercarbonylerne tæt på 170 ppm og fremkomsten af ​​signaler mellem 20 og 21 ppm svarende til kemikaliet skift af de fem alifatiske carbonatomer af methyler, verificeret gennem integrationen af ​​signalerne. Spektrene blev sammenlignet med dem, der er beskrevet i litteraturen [22].

Biasutto et al. [23] var pionerer i undersøgelsen af ​​prækursorer baseret på estere for at øge biotilgængeligheden af ​​quercetin. Baseret på deres undersøgelser har Mattarei et al. [21] fremmede den totale acetylering af quercetin og opnåede Q5-derivatet i et højt udbytte (79-97 procent). For nylig har Mohajeri et al. [24] opnåede et udbytte på 85 procent ved at opnå analog Q5, under opvarmning (180 grader i 6 timer). I den foreliggende undersøgelse var syntesen af ​​Q5 effektiv, og vi opnåede en forbindelse behørigt karakteriseret i henhold til dataene beskrevet i litteraturen.

2.2. Antioxidant ABTS· plus radikal aktivitet

Den sammenlignende analyse af antioxidantaktiviteten af ​​Q og Q5 viste, at quercetin (Q) var mere aktiv til at rense ABTS* plus radikaler end O5 (henholdsvis 29 procent og 18 procent), med IC50-værdier (i μM) på 188,850±0,003 og 379,560± 0,004 for henholdsvis Q og Q5.

Flavonoidernes antioxidantaktivitet er direkte relateret til deres molekylære struktur. Der er to mekanismer, hvorigennem phenoliske forbindelser kan udøve deres antioxidantfunktioner: hydrogenatomoverførsel og elektrondonation [25]. Quercetins overlegne antioxidantaktivitet kan tilskrives det betydelige bidrag fra hydroxyler og deres hydrogener, som er erstattet af acetyler i Q5-analogen, hvilket reducerer kapaciteten til hydrogendonation eller frie radikalers opfangning af syntetiske molekyler.

Der blev ikke fundet data i den videnskabelige litteratur, der rapporterer Q5-forbindelsens antioxidantaktivitet. Åh, et al. [26] evaluerede quercetinesterpræparater og deres antioxidantaktiviteter, hvilket viste, at quercetin havde den højeste radikalopfangende aktivitet blandt de testede prøver. Derfor er det høje bidrag fra hydroxylgrupperne til antioxidantaktiviteten af ​​quercetin essentielt [27].

2.3.Antileishmania-aktivitet

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>100 μM sammenlignet med amphotericin B （IC501.1 μM±0.1）. Derudover blev virkningerne af Q5 på promastigote-formerne af L.amazonenses evalueret, og denne forbindelse udviste en lavere IC50-værdi （75,1 ± 4,7 μM）for denne art sammenlignet med L. braziliensis.

Tasdemir et al. [8] sammenlignede de antitrypanosomale og antileishmaniale aktiviteter af flavonoider og deres analoger (afledt af quercetin) og fandt, at de var potente og effektive antiprotozoale midler mod amastigote former af L donovani (IC50=1.0ug mL -l). For promastigote former af L.amazonensis, Fonseca og Silva et al.[27] fundet IC50=31.4 uM i kulturer behandlet med quercetin inden for 48 timer. Desuden rapporterede de fuldstændig cellevækststandsning med 96 μM quercetin i 96 timer, hvilket viste tilfredsstillende antileishmanial-dal aktivitet. Cataneo et al. [28]evaluerede anti-promastigote-virkningen af ​​quercetin (op til 192 μM) mod L.brasiliensis, i peritoneale celler fra makrofager. I promastigote-kulturer af L. major udviste quercetin og dets analoge quercetin-pentaacetat en koncentrationsafhængig effekt （IC 50 =2.5±0.92 og 2.85±0,99 μM, henholdsvis 【24】.

Nogle forfattere har vist, at quercetin inducerer død i L amazonensis promastigotes gennem mitokondriel membrandysfunktion som følge af produktionen af ​​reaktive oxygenarter [27,28] og andre mål, såsom arginase [7], ribonukleotidreduktase [8,29] og topoisomerase II[30]. Resultaterne opnået i denne undersøgelse indikerer, at andre test bør betragtes i perspektiv for de testede forbindelser (Q og Q5), idet man overvejer i silico-tests til undersøgelse af mål, der kan være involveret i de observerede dødsmekanismer.

2.4. Anti-inflammatoriske og cytotoksiske aktiviteter

Derefter fokuserede vi på at evaluere den biologiske aktivitet af det nye derivat. Først blev ikke-toksiske koncentrationer af Q og Q5 bestemt i peritoneale makrofager opnået fra BALB/c-mus. CCs0-værdierne viste ikke cytotoksicitet ved koncentrationer lig med eller mindre end 80 μM (Figur 2A, D). Dexamethason var ikke cytotoksisk ved den testede koncentration （20 μM）. Baseret på dette blev efterfølgende test udført i koncentrationer, der ikke oversteg 80 μM.

Den immunmodulerende aktivitet af Q og Q5 blev undersøgt for at bestemme virkningerne af forbindelser på proinflammatorisk mediatorsekretion. De immunmodulerende virkninger af forbindelserne (Q og Q5) blev oprindeligt evalueret i kulturer af peritoneale makrofager gennem produktion af nitrogenoxid. Som forventet øgede makrofagaktivering med LPS PLUS IFNy mængden af ​​nitritproduktion (figur 2B, E). Behandling med quercetin hæmmede på en koncentrationsafhængig måde produktionen af ​​nitrit (p.<>

Pentadactylforbindelsen (Q5) udviste ikke lignende aktivitet ved 20 μM. Interessant nok var aktiviteten signifikant ved de højeste testede koncentrationer （40 og 80 μM） for begge forbindelser. Ved den højeste testede koncentration (80 uM) lignede virkningerne af forbindelserne dem, der blev observeret i kulturer af aktiverede makrofager og behandlet med 20 μM dexamethason. Forbindelserne var ikke cytotoksiske for peritoneale makrofager ved de testede koncentrationer (20, 40 og 80 μM).

For en bedre karakterisering afanti-inflammatoriskvirkningen af ​​forbindelserne (O og O5), blev det inflammatoriske cytokin TNF kvantificeret ved hjælp af Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) metoden. Makrofagestimulering ved hjælp af LPS plus INF-y inducerede en fremtrædende stigning i TNF-produktion. Behandling med Q og Q5 reducerede produktionen af ​​TNF signifikant (s<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

Reduktionen af ​​inflammatoriske faktorer med quercetin er forskelligt beskrevet, herunder modulering for Th-2 inflammatoriske profiler, relateret til beskyttelse i neurale sygdomme [31,32]. Den antiinflammatoriske virkning af quercetin er godt beskrevet i litteraturen [33,34]. Der er dog få undersøgelser, der viser O5-analogens antiinflammatoriske potentiale. Denne undersøgelse bekræfter resultaterne af Chen et al. [35], som påviste rollen af ​​Q og O5 i inhiberingen af ​​NO-produktionen induceret af LPS, på en koncentrationsafhængig måde uden skadelige cytotoksiske virkninger for RAW 264.7-makrofaglinjen. Desuden viste denne undersøgelse den hidtil usete effekt af Q5 til at hæmme det pro-inflammatoriske cytokin TNF.

De opnåede data indikerer bevarelsen af ​​virkningerne på det semisyntetiske molekyle (O5); dog kan doseringen af ​​andre faktorer, såsom cytokinet IL-10, være et perspektiv i evalueringen af ​​disse profiler. Derfor kan Q5 betragtes som et potentielt molekyle til fremtidige in vitro- og in vivo-tests med henblik på et yderligere terapeutisk alternativ med anti-inflammatorisk aktivitet.

Cytotoksiciteten af ​​de testede forbindelser (Q og Q5) blev evalueret ved 20, 40 og 80 uM ved hjælp af AlamarBlue kolorimetriske metode i en sund cellelinje (MRC-5, humane lungefibroblaster) og i to forskellige cancercellelinjer , HepG2 (humant hepatocellulært carcinom) og HL-60 (human promyelocytisk leukæmi), som vist i figur 3. Doxorubicin var standardlægemidlet anvendt som en positiv kontrol.

Som vist i figur 3, for HepG2-celler, viste quercetin (Q) ikke signifikant cytotoksisk aktivitet ved den højeste undersøgte koncentration (80 μM), og dets pentaacetatanalog (Q5) viste reduceret aktivitet (IC{{4) }}.9μM). For HL-60-cancercellelinjen blev quercetin vist ikke at være særlig aktivt (IC50=51.3 uM); Interessant nok var Q5 imidlertid signifikant mere aktiv end quercetin med en IC50 på 33,6 uM. Standardlægemidlet doxorubicin havde IC50-værdier i området fra 0,1 til 0,2 uM for cancercellelinjer, der viste signifikante cytotoksiske effekter mod den raske cellelinje MRC-5(tabel 1), hvilket ikke blev set for forbindelserne (Q og Q5) .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, der viser en selektiv profil mod cancercellelinjen. Få undersøgelser har vist aktiviteten af ​​quercetin O5-analogen i cancercellelinjer. Q5-aktivitet i en HeLa-tumorcellelinje blev imidlertid dokumenteret af Danihelovået al. [22], som viste, at acetylerede estere af quercetin var de mest effektive cytotoksiske derivater. Der blev ikke fundet data om den cytotoksiske rolle af Q5 i HepG2-celler. Kun én undersøgelse blev fundet i litteraturen, der afslørede, at den tetra-acetylerede analog af quercetin havde en signifikant effekt på hæmningen af ​​HL-60-afstamningsceller gennem aktivering af caspase-3, hvilket fremmer apoptose [36].

Et MTT-assay med kolorimetrisk metode blev brugt til at få adgang til cytotoksiciteten i C6-cellekultur. Quercetin og Q5 inducerede et fald i 57{{10}} nm MTT-absorbans, der repræsenterer mitokondriel dehydrogenaseaktivitet og antyder et fald i cellelevedygtigheden i C6-celler. Som vist i figur 4 var quercetin-induceret cytotoksicitet i C6-celler i koncentrationer højere end 25 uM i 72 timer (Figur 4A), mens 0.78 μM af Q5 i 72 timer var i stand til at reducere cellelevedygtighed (Figur 4B) ). Det blev observeret, at 50 uM quercetin(O) og O5 reducerede cellelevedygtigheden til henholdsvis 41,3 procent ± 2,9 procent og 47,5 procent ±1,2 procent sammenlignet med kontrolgruppen (100,0 procent ±6,4 procent) (Figur 4A, B) . Ingen signifikante ændringer i cellelevedygtighed blev visualiseret i C6-kulturer behandlet med DMSO (0,05 procent), sammenlignet med ubehandlede celler.

Baseret på de opnåede resultater undersøgte vi derefter de morfologiske virkninger af forbindelserne Q og Q5 (50 μM) på C6-cellerne ved 24, 48 og 72 timer efter behandlingen ved hjælp af optisk mikroskopi. Quercetinpentaacetat (Q5) ved 50 μM inducerede ændringer i morfologien af ​​C6-gliomceller inden for de første 24 timer, med en synlig reduktion i cytoplasmatiske forlængelser sammenlignet med kontrolgruppen (figur 5). Efter 48 timers behandling med Q5 antog cellerne en afrundet morfologi karakteriseret ved tilbagetrækning af cellelegemet og den formløse membran (som ikke blev rapporteret i den videnskabelige litteratur), i modsætning til quercetin, som i løbet af denne behandlingstid præsenterede et morfologisk aspekt ligner fibroblaster [37]. Eventuelle andre morfologiske ændringer blev visualiseret i celler under andre behandlingsbetingelser.

Hydroxylsubstitutionen med acetylgrupperne kan fremme forbedret cellulær absorption af quercetinanalogerne til fordel for forskellige biologiske tests, især i cancerceller [38,39]. Bispo da Silva et al. [40] viste, ved at behandle C6-celler med flavonoiderne rutin og quercetin, en signifikant reduktion i andelen af ​​adhærente C6-celler, med en tyndere og bipolær morfologisk fænotype, sammenlignet med kontrolkulturer. Behandling af C6-celler med flavonoider hæmmede de migrerende egenskaber af levedygtige C6-celler efter 24 timers behandling. Under kontrolforhold præsenterede mikroglia en rundere fænotype; efter rutinbehandling erhvervede mere end 50 procent af cellerne en forgrenet, multipolær fænotype, og de andre erhvervede amoeboid-fænotypen, hvilket begge indikerer aktivering.

Undersøgelser viser, at quercetin interfererer i reguleringen af ​​cellesignaltransduktionsveje forbundet med celledød ved apoptose og i stadierne af cellecyklusprogression [41,42]. Santos et al. [14] indikerede en potentiel reduktion i væksten af ​​GL-15 humane glioblastomceller. Bi et al. [43] visualiserede en induktion af autofagi af U87 og U251 humane glioblastomceller på en dosisafhængig måde.

De opnåede resultater bekræfter med Danihelova et al. [22], hvor acetylgrupperne indsat i quercetinmolekylet fremmede en forbedring af anticanceraktivitet. Desuden indikerede de en større tropisme for kræftceller, især for celler af neurale afstamninger. Denne undersøgelse er uden fortilfælde i forhold til O5-analogen i behandlingen af ​​C6-gliomceller. Dell'Albani et al. [44] viste en bedre virkning af acylderivater af quercetin i kulturer af humane gliomstammer U373-MG og murint gliom 9L, hvilket indikerer dødsveje ved apoptose. Ændringen af ​​cellemorfologi til en afrundet profil kan henvise til dødsmekanismer, såsom apoptose, der i vid udstrækning tilskrives quercetin [45-47]. I fremtidige perspektiver kan test med sunde neurale celler hjælpe med at belyse denne hypotese.

3. Materialer og metoder

3.1.Reagenser og materialer

Alle reagenser (quercetin, pyridin, eddikesyreanhydrid, trikoloroisocyanursyre, dichlormethan, 2,4-dinitro-phenylhydrazin, hydroxylaminhydrochlorid, natriumacetat, petroleumsether, svovlsyre, kaliumpersulfat og nitrat af analytisk kvalitet) var kommercielt tilgængelige (Ouimex, Merck, Brasilien og Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Til fremstilling af alle standardopløsninger og prøver blev der brugt ultrarent vand (med resistivitet 18 MOcm-I) opnået fra Milli-Q Plus vandrensningssystemet (Millipore, Molsheim, Frankrig). Alt laboratorieglas blev vasket i en 10 % （ o/ø） HNO3-opløsning i 24 timer, skyllet med højrent vand og tørret ved omgivelsestemperatur.

3.2. Syntese og karakterisering

Den strukturelle analog blev opnået efterquercetinmolekylær modifikation fra den mere tilgængelige og reproducerbare syntetiske vej (Penta-acetylering). Vi anvendte de grønne kemiprincipper med minimering af stofbrug. Pentadactylanalogen (Q5) blev opnået efter den molekylære modifikation af quercetin fra en syntetisk vej, som anvender eddikesyreanhydrid som acyleringsmiddel og pyridin som katalysator.

Blandingen indeholdende quercetin (300 mg, 1 f.eks.), eddikesyreanhydrid (0,80 ml, 20 f.eks.) og pyridin (7,5 ml) blev holdt under magnetisk omrøring ved stuetemperatur. Efter 24 timers omrøring blev 250 ml dichlormethan tilsat til reaktionsmediet. Derefter blev reaktionsblandingen vasket med 10 procent HCl (3 x 100 ml), fortyndet NaOH (3 x 50 ml) og vand (3 x 100 ml); tørret over vandfrit natriumsulfat; filtreret; og inddampet i rotationsfordamperen (Fisatom, Minas Gerais, Brasilien)[21]. Mængden af ​​O5 og det opnåede udbytte var henholdsvis 280 mg og 54 procent.

Den strukturelle modifikationsreaktion af quercetinmolekylet blev overvåget ved tyndtlagschromatografi (TLC) under anvendelse af en blanding af hexan og ethylacetat (1:1) som opløsningsmidler. Til den fysisk-kemiske karakterisering blev smeltepunktet brugt. Fourier Transform Infrared (FTIR)-tests ved hjælp af attenuated Total Reflection (ATR)-metoden blev udført af en FTIR Spectrum 100S-model (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA), med erhvervelse af scanningsspektrene i det midt-infrarøde (4000 til 600 cm-1).

Prøven (masse~5,0 mg) blev anbragt på ATR-krystallen og udsat for et tryk på ca. 20 N ved hjælp af en manuel mekanisk presse. FTIR-spektre blev sporet af OriginPro8-software, OriginLAB4 (www.originlab.com, tilgået den 10. september 2021). Kernemagnetisk resonans(NMR)-spektre blev optaget i et Bruker Avance IⅢI500 MHz (Uster, Schweiz) spektrometer -500 MHz for 1H NMR og 125 MHz for 13C NMR under anvendelse af DMSO som opløsningsmiddel. Kemiske skift blev udtrykt i ppm-skalaen (ug/mL), og chloroform (CHCla) blev anvendt som den interne reference.

NMR-spektre blev behandlet af TopSpin⑤4.0-software (Bruker Biospin, Coventry, UK) og sammenlignet med litteraturdata [38]. NMR-dataene var: 'H NMR(500 MHz, CDCI3)2,34(6H,s,-OCOCH3);2,35(3H,s,-OCOCH3);2,35(3H,s, -OCOCH3);2,44(3H, s,-OCOCH3);6,88(1H,d, J=2,5 Hz);7,34(1H,d,J=2.0 Hz);7,36(1H,d,J=8,5);7,70 (1Hd, J=2,0Hz);7,73(1H,dd,J1=8,5 Hz,J 2=2.0Hz）;13CNMR（125 MHz, CDCl3）δ 170.04;169.24;167.86;167.79;156.87;154.28;150.43;144.42;144.42;812.40;2127.40;2127.40;2127.40; ;113.89;108.96;21.16;21.02;20.65; og 20.49.

3.3. Antioxidant ABTS* plus radikal aktivitet

ABTS* plus-sekvestreringsaktiviteten blev tilpasset fra metoden beskrevet af Dorman og Hiltunen[48]. Kaliumpersulfat og ABTS (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) blev opløst i destilleret vand til dannelse af en slutkoncentration på henholdsvis 2,45 mM og 7 mM. ABTS-opløsningen blev fremstillet ved at tilsætte begge opløsninger i en hastighed på 1:1, og derefter blev opløsningen inkuberet ved stuetemperatur i 16 timer i mørke.

Den resulterende opløsning, intenst farvet, blev justeret med ethanol i spektrofotometeret til en absorbans på {{0}}.7±0,05 nm ved 734 nm før brug. Vi brugte 30 μL af prøverne, eller Trolox (Sigma Aldrich⑧, St.Louis, MO), som referencestandard ved forskellige koncentrationer (5,10,25,50,75 og 100 μM), blev tilsat til 3 mL af ABTS* plus opløsning og ventede på at reagere i 6 min. Absorbansen blev målt ved 734 nm mod en blindprøve (ethanol). ABTS· plus rensekapaciteten blev beregnet som:

ABTS* plus renseeffekt ( procent ){{0}} (1- A0/A1)×100;

hvor A0 er absorbansen af ​​kontrollen, og A1 er absorbansen af ​​prøven eller standarden. Alle bestemmelser blev udført i tre eksemplarer. IC5so-værdier blev beregnet og udtrykt som middelværdi ± SD i μM.

3.4.Antileishmania-aktivitet

Lamazonensis (MHOM/BR88/BA-125Leila-stamme) og Lbraziliensis (MHOM/BR88/BA-3456)promastigotes (1 × 10 grader pr. brønd) blev dyrket i en 96-brøndplade i Schneider-medium (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS; GIBCO) og 50 ug mL-'gentamicin (Life, Carlsbad, CA, USA) og udsat for behandling med forskellige koncentrationer（ 100 μM; seks fortyndinger 1∶2） af Q5. Parasitterne blev inkuberet i 72 timer ved 26 grader. Derefter blev 20 μL/brønd AlamarBlue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) tilsat i løbet af 2 timer. Aflæsningen blev udført i et spektrofotometer under anvendelse af bølgelængder på 570 og 600 nm. Beregningen af ​​axenisk kulturinhibering blev bestemt baseret på den ubehandlede kontrol [49].

3.5. Anti-inflammatoriske og cytotoksiske aktiviteter

3.5.1.Narkotika

Dexamethason (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), et syntetisk glukokortikoid, blev brugt som en positiv kontrol i immunmodulerende assays. Doxorubicin (doxorubicinhydrochlorid, Laboratory IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) blev brugt som referencemiddel mod kræft. Alle forbindelser blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO; PanReac, Barcelona, ​​Spanien) og fortyndet i et cellekulturmedium til brug i assays. Den endelige koncentration af DMSO var mindre end 1 procent i alle eksperimenter.

3.5.2.Dyr

BALB/c-mus, i alderen 4-10 uger, blev leveret af vivarium fra Goncalo Moniz Institute/FIOCRUZ-BA (IGM, Salvador, Bahia, Brasilien), hvor de blev holdt i bure med højst fem mus. Alle bure blev holdt i et akklimatiseret rum ved 21 grader ±1 grad, i en 12-h lys/mørke cyklus, med vand og mad ad libitum gennem hele forsøgsperioden. Forsøgene med dyr blev godkendt af Ethics and Animal Use Committee of Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA Institute (IGM-018/15).

3.5.3. Celler

HL-60(human akut promyelocytisk leukæmi) og HepG2(humant hepatocellulært karcinom) blev opnået fra American Type Culture Collection-ATCC(Rockville, ML.USA), blev brugt. For at vurdere selektiviteten af ​​quercetin(O) og O5-derivatet på proliferationen af ​​ikke-cancerceller blev MRC-5-linjen (human lungefibroblast), også opnået fra ATCC, brugt. Cellelinjer blev dyrket i celle kulturflasker (75 cm3.250 ml volumen) ved brug af RPMI 1640 dyrkningsmedium (GibcoTM) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (GibcoM) og 50 ug/ml gentamicin (GibcoTM). Cellerne blev holdt i inkubatorer med en atmosfære på 5 procent CO, ved 37 grader og overvåges dagligt. Alle cellelinjer blev testet for mycoplasma ved anvendelse af et Hoechst-farvningsmycoplasma-detektionskit (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). C6-cellelinje blev afledt af rotte glial-tumorer induceret af n-nitrosomethylurinstof [50]. Disse gliomceller blev dyrket som beskrevet af de Oliveira et al. [51]. Cellerne blev inkuberet ved 37 grader i en befugtet inkubator ved 5 procent CO2. C6-celler blev dyrket på cellekulturskåle (100- mm Ø, TPP) i DMEM-medium suppleret med 100 UI/mL penicillin G, 100 ug/mL streptomycin, 7 mM glucose, 2 mM L-glutamin, 1 mM pyruvat, og 10 procent føtalt kalveserum. Dyrkningsmediet blev skiftet hver anden dag. Fireogtyve timer før behandlinger blev C6-celler podet i petriskåle med 35 mm i diameter eller 96-brøndsplader med en tæthed på 3,5 x 10* celler/brønd.

Alle cellelinjer blev testet for mycoplasma ved hjælp af Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich) for at validere brugen af ​​celler fri for kontaminering. Cellelinjeoplysningerne er indeholdt i databasen "Cell Bank of Rio de Janeiro (BCRJ)": HepG2-celle(Kode: 0291), HL-60-celle (Kode: 0104) og C6-celle (Kode: 0057) .

3.5.4. Cytotoksisk aktivitetsanalyse

For at vurdere cytotoksiciteten af ​​de testede forbindelser (Q og Q5) på HL-60 (human akut promyelocytisk leukæmi) og HepG2-celler blev den kolorimetriske metode af Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) brugt. Alamar Blue (resazurin) er en indikator, der producerer en kolorimetrisk ændring og et fluorescerende signal som reaktion på metabolisk aktivitet. Resazurin reduceres til resorufin af metabolisk aktive celler. Den oxiderede form er blå (ikke-fluorescerende/ikke-levedygtig celle), og den reducerede form er lyserød (fluorescerende/levedygtig celle). Reduktionen af ​​resazurin til resorufin afspejler cellelevedygtighed [52].

I analysen blev celler fordelt i {{0}}brøndsplader med en foruddefineret tæthed på 0.3×1{{10}} graders celler/ml for celler af HL-60-linjen og 0.7× 10 celler/ml for celler af HepG2-linjen. Forbindelserne blev tilsat i en serie på otte koncentrationer (80 til 0,62 uM), med undtagelse af doxorubicin, som blev anvendt i koncentrationer fra 0,003 til 5 μM. Den negative kontrol modtog den samme mængde DMSO (0,025 procent). Pladerne blev inkuberet i 72 timer i en ovn ved 37 grader og 5 procent CO2. Efter denne periode blev 20 μL/brønd Alamar Blue tilsat, og pladerne blev inkuberet i yderligere 4 timer. Pladerne blev aflæst ved anvendelse af et spektrofotometer (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ved bølgelængder på 570 og 600 nm.

C6-cellelevedygtigheden blev bestemt ved anvendelse af den kolorimetriske metode beskrevet af Hansen et al. [53]. MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl,25-diphenyltetrazoliumbromid) blev opløst i en koncentration på 5 mg/ml i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) i værelset temperatur, og opløsningen blev yderligere steriliseret ved at passere gennem et 0.2-mm filter og opbevaret ved 4 grader i mørke. I assayet blev celler fordelt i 96-brøndsplader ved en foruddefineret tæthed på 3,5 × 10* celler/ml for C6-cellelinjen. Forbindelserne blev tilsat i en serie på otte koncentrationer (80 til 0,39 uM).

MTT blev tilsat til hver brønd i en slutkoncentration på 2 mg/ml, og cellerne blev inkuberet i 2 timer. Derefter blev celler lyseret med 20 procent (w/ø) natriumdodecylsulfat (SDS) og 50 procent (o/ø) dimethylformamid (DMF) opløsning (pH 4,7) i en inkubation natten over ved stuetemperatur [54] . Absorbansen blev målt med en spektrofotometer mikropladelæser (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (version 3001, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland). Otte replikater blev anvendt for hver koncentration. Cellelevedygtighed blev udtrykt som procentdelen af ​​absorbans ved 570 nm, og kontrollen blev anvendt som 100 procent. Efter behandlinger blev cellemorfologi evalueret ved lysmikroskopi under anvendelse af et optisk mikroskop (Eclipse TS100 omvendt mikroskop, Nikon Instruments, Tokyo, Japan) og fotograferet ved hjælp af et digitalkamera (Coolpix S4300, Nikon Instruments, Tokyo, Japan).

3.5.5. Makrofager kultur

Peritoneale ekssudatmakrofager (2×105 celler/brønd) blev inkuberet i 96-brøndsplader i DMEM-medium suppleret med 10 procent PBS og 50 ug/ml gentamicin, i tre eksemplarer, stimuleret eller ej med LPS (500ng/mL) og IFN-y (5 ng/mL) og behandlet eller ej med forskellige koncentrationer af forbindelser (20, 40 og 80 uM). Cellerne blev holdt i en inkubator ved 37 grader og 5 procent CO2 i 4 24 timer. Efter denne periode blev kultursupernatanterne opsamlet for cytokiner og nitrogenoxiddosering. I nogle analyser blev supernatanten erstattet med medium-plus 10 procent Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for at vurdere cytotoksiciteten, og pladerne blev inkuberet i yderligere 4 timer. Spektrofotometeraflæsningen blev udført ved 570 og 600 nm.

3.5.6. TNF-dosering

TNF-måling blev udført fra cellekultursupernatanter under anvendelse af sandwich ELISA-teknikken, under anvendelse af Development System kitsDuoset ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MI, USA), i henhold til producentens anbefalinger. ELISA plader (NUNC—IMMUNO PLATE Maxisorp Surface) blev sensibiliseret med 50 μL/brønd af indfangningsantistoffet i en koncentration på 2 ug/ml, fortyndet i PBS 1x og inkuberet i 16 timer ved 4 grader. Pladerne blev vasket tre gange med 1 × PBS/0.05 procent tween 20 og blokeret med 100 μL/brønd af 1× PBS og 0,05 procent tween 20 og 0,1 procent bovint albumin i 2 timer .

Derefter, 50 μL/brønd af prøver, en blank- og standardkurve af rekombinanter fortyndet i Tris-saltvandsbuffer (20 mM Trix i basen og 150 mM NaCl) indeholdende 0,1 procent bovint albumin og 0,05 procent blev tilsat tween 20 i 2 timer ved stuetemperatur. Standarden blev seriefortyndet (1:2) fra startkoncentrationen på 2000 pg/ml med 11 duplikatfortyndinger. Pladen blev vasket tre gange med PBS/0,05 procent tween og inkuberet med 50 μL af detektionsantistoffet (biotinyleret) ved en koncentration på 400 ng/ml i en periode på 2 timer.

Pladen blev vasket tre gange med PBS/{{0}}.05 procent tween og inkuberet i 20 minutter med avidin-peroxidase fortyndet 1:200. Udviklingen blev udført ved tilsætning af TMB-substrat (Thermo Fisher) og afbrudt med 0,05 M phosphorsyre. Aflæsningen af ​​reaktionen blev bestemt ved anvendelse af et spektrofotometer (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) med et 450 nm filter. Analyser blev udført under anvendelse af Softmax 4.3.1-softwaren (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

3.5.7. Nitrogenoxiddosering

Produktionen af ​​nitrit i makrofagsupernatanter blev estimeret gennem kvantificeringen af ​​dets oxidative produkt, nitrit, ved Griess-metoden [50]. Absorbansen blev bestemt i et spektrofotometer (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) med et 570 nm filter. Analyser blev udført ved hjælp af Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), og resultaterne blev udtrykt i μM nitrit, baseret på en standardkurve af natriumnitrit med en startkoncentration på 400 uM.

3.6. Statistisk analyse

Envejs ANOVA-testen efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligning efter-testen blev brugt til at bestemme den statistiske signifikans af sammenligningerne mellem grupperne i undersøgelserne. Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikante, når p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4 konklusioner

Betingelserne og reaktionssyntesemedierne for quercetinanaloger viste effektivitet til opnåelse af en forbindelse behørigt karakteriseret ifølge dataene beskrevet i litteraturen. Den sammenlignende analyse af antioxidantaktiviteten af ​​Q og Q5 viste, at quercetin (O) var mere aktiv til at fjerne ABTS* plus radikaler end O5 (henholdsvis 29 procent og 18 procent). Det reducerede antioxidantpotentiale viste ikke interferens i immunmodulerende og antitumorale aktiviteter. De kemiske modifikationer, der blev foreslået i denne undersøgelse, forstærkede den antiproliferative virkning og opretholdt den antiinflammatoriske aktivitet, men ikke cytotoksicitetsaktiviteten i raske testede celler.

Det tilstedeværende acetylerede derivat (Q5) forbedrede cytotoksiciteten i cancer hepatocellulære celler (HepG2), promyelocytisk leukæmi (LH-60) celler og især i gliom (C6) celler. Rottegliom C6-cellerne, der blev handlet, viste et morfologisk hidtil uset mønster af celledød. Q5 ved 50 μM i 24 timer inducerede ændringer i C6glioma-cellemorfologi karakteriseret ved en rund kropsform (som ikke blev rapporteret i den videnskabelige litteratur), i modsætning til quercetin, som præsenterede en fibroblastlignende morfologi.

Yderligere undersøgelser skal udføres for bedre at forstå virkningerne af acetylerede derivater af quercetin, især i neuronale celler. Denne undersøgelse tillod for første gang anvendelsen af ​​strukturelt modificeret quercetin i neurale celler for potentielle neurobeskyttende virkninger.

Referencer

1. Formica, JV; Regelson, W. Gennemgang af biologien af ​​quercetin og relaterede bioflavonoider. Food Chem. Toxicol. 1995, 33, 1061-1080. [CrossRef]

2. Materska, M. Quercetin og dets derivater: Kemisk struktur og bioaktivitet - En gennemgang. Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, 58, 407-413.

3. Wang, TY; Li, Q.; Bi, KS Bioaktive flavonoider i lægeplanter: Struktur, aktivitet og biologisk skæbne. Asiatiske J. Pharm. Sci. 2018, 13, 12-23. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Andrea, G. Quercetin: En flflavonol med mangefacetterede terapeutiske anvendelser? Fitoterapia 2015, 106, 256-271. [CrossRef]

5. Araújo, MV; Queiroz, AC; Silva, JFM; Silva, AE; Silva, JKS; Silva, GR; Silva, ECO; Souza, ST; Fonseca, EJS; Camara, CA; et al. Flavonoider inducerer celledød i Leishmania amazonensis: In vitro karakterisering ved flowcytometri og Raman-spektroskopi. Analytiker 2019, 144, 5232-5244. [CrossRef] [PubMed]

6. Faixová, D.; Hrˇcková, G.; Kubašková, TM; Mudro ˇnová, D. Antiparasitiske virkninger af udvalgte isofflavoner på fladorme. Helminthology 2021, 58, 1–16. [CrossRef]

7. Manjolin, LC; Reis, MBG; Maquiaveli, CC; Santos-Filho, OA; Silva, ER Diætflavonoider fisetin, luteolin og deres afledte forbindelser hæmmer arginase, et centralt enzym i Leishmania (Leishmania) amazonensis-infektion. Food Chem. 2013, 141, 2253-2262. [CrossRef]

8. Tasdemir, D.; Kaiser, M.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, TJ; Tosun, F.; Rüedi1, P. Antitrypanosomal og antileishmaniale aktiviteter af flflavonoider og deres analoger: In vitro, in vivo, struktur-aktivitetsforhold og kvantitative struktur-aktivitetsforholdsstudier. Antimikrob. Agenter Chemother. 2006, 50, 1352-1364. [CrossRef] 9. Lee, WJ; Hsiao, M.; Chang, JL; Yang, SF; Tseng, TH; Chang, CW; Chow, JM; Lin, KH; Lin, YW; Liu, CC; et al. Quercetin inducerer mitokondrie-afledt apoptose via reaktive oxygenarter-medieret ERK-aktivering i HL-60 leukæmiceller og xenograft. Arch. Toxicol. 2015, 89, 1103-1117. [CrossRef]

10. Drummond, EM; Harbourne, N.; Marete, E.; Martyn, D.; Jacquier, J.; O'Riordan, D.; Gibney, ER Hæmning af pro-inflammatoriske biomarkører i THP1-makrofager af polyphenoler afledt af kamille-, eng- og pilebark. Phytother Res. 2013, 27, 588-594. [CrossRef]