Sårbarhedssted på SARS-CoV-2 Spike inducerer bredt beskyttende antistof mod antigenisk distinkte Omicron-subvarianter

Den hurtige udvikling af det svære akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Omicron-varianter har understreget behovet for at identificere antistoffer med bred neutraliserende evne til at informere fremtidige monoklonale terapier og vaccinationsstrategier. Heri identificerede vi S728-1157, et bredt neutraliserende antistof (bnAb) rettet mod receptorbindingsstedet (RBS), som var afledt af et individ, der tidligere var inficeret med WT SARS-CoV-2 før spredningen af varianter af bekymring (VOC'er). S728-1157 viste bred krydsneutralisering af alle dominerende varianter, inklusive D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu og Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Ydermere beskyttede S728-1157 hamstere mod in vivo-udfordringer med WT-, Delta- og BA.1-virus. Strukturel analyse viste, at dette antistof retter sig mod en klasse 1/RBS-A-epitop i receptorbindingsdomænet via multiple hydrofobe og polære interaktioner med dets tunge kæde-komplementaritetsbestemmende region 3 (CDR-H3), foruden almindelige motiver i CDR-H1/ CDR-H2 af klasse 1/RBS-A antistoffer. Det er vigtigt, at denne epitop var lettere tilgængelig i åben tilstand og præfusionstilstand eller i de hexaprolin (6P)-stabiliserede spidskonstruktioner sammenlignet med diprolin (2P)-konstruktioner. Samlet set udviser S728-1157 et bredt terapeutisk potentiale og kan informere måldrevne vaccinedesigns mod fremtidige SARS-CoV-2-varianter.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Introduktion

Siden pandemiens start i december 2019 har det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus ført til over 660 millioner tilfælde af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) og over 6,5 millioner dødsfald globalt. Selvom den hurtige udvikling og distribution af vacciner og terapeutika i vid udstrækning har bremset virkningen af ​​COVID-19, udgør fremkomsten af ​​cirkulerende bekymringsvarianter (VOC'er) fortsat en stor trussel på grund af potentialet for yderligere immunundvigelse og øget patogenicitet. D614G-varianten var den tidligste variant, der dukkede op og blev universelt udbredt derefter. Sammenlignet med WT udviste D614G-varianten øget transmissibilitet snarere end øget patogenicitet og var derfor usandsynligt at reducere effektiviteten af ​​vacciner i kliniske forsøg (1). Mellem fremkomsten af ​​D614G til oktober 2021 udviklede 4 yderligere betydelige VOC'er sig verden over, inklusive Alpha, Beta, Gamma og Delta. Blandt disse varianter blev Delta en alvorlig global trussel på grund af dets overførbarhed, øgede sygdomssværhedsgrad og delvis immunundvigelse, som vist ved den reducerede evne af polyklonalt serum og mAbs til at neutralisere denne stamme (2-6). Kort efter, i november 2021, blev Omicron-varianten identificeret og annonceret som en ny VOC. Denne variant havde det største antal mutationer til dato og så ud til at sprede sig hurtigere end tidligere stammer (7, 8). I øjeblikket er der en bred vifte af Omicron-underafstamninger, der fører til nye COVID-19-tilfælde, hvor BQ.1, BQ.1.1 og XBB.1.5 bliver dominerende over BA.5 og tegner sig for de fleste nye tilfælde på verdensplan på det tidspunkt af at skrive. Omicron-varianterne kan undslippe genkendelse af COVID-19-vaccine-associeret immunitet i varierende omfang og reducerer derved signifikant den neutraliserende styrke af serumantistoffer fra rekonvalescente, fuldt mRNA-vaccinerede individer og individer boostet med den nye WT/BA.5 bivalente mRNA-vaccine (9, 10). Tilsvarende var Omicron-varianter i stand til at undslippe bindingen af ​​flere terapeutiske mAb'er (EUA), selvom disse tidligere havde vist sig at være effektive mod tidligere VOC'er (10-12). På grund af den reducerede neutralisering mod Omicron og den fortsatte trussel fra fremtidige VOC'er, er der et presserende behov for at identificere brede og potente neutraliserende antistoffer, der kan beskytte mod forskellige, udviklende SARS-CoV-2-linjer. I denne undersøgelse identificerede vi et potent receptorbindende domæne-reaktivt (RBD-reaktivt) mAb fra det perifere blod fra et SARS-CoV-2-rekonvalescent individ, der effektivt neutraliserede Alpha, Beta, Kappa, Delta, Mu, og Omicron-varianter (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 og XBB). Denne mAb, S728-1157, reducerede signifikant BA.1 Omicron, Delta og WT virale belastninger i lungerne og næseslimhinden efter in vivo udfordring hos hamstere. S728-1157 binder receptorbindingsstedet (RBS), der er fuldstændigt eksponeret, når RBD'en på spidsen er i opkonformationen. mAb'et bruger motiver fundet i CDR-H1 og CDR-H2, der er fælles for IGHV3-53/3-66 klasse 1/RBS-A antistoffer (13, 14), men også gennem omfattende unikke kontakter med CDR -H3 for at omgå mutationer i VOC's spidser. Dette tyder på, at det rationelle design af fremtidige vaccineforstærkninger, der dækker Omicron-varianter, bør modificeres til at præsentere en stabiliseret spids i den mest opadgående konfiguration for optimalt at inducere klasse 1/RBS-A mAbs, der har lignende CDR-H3-egenskaber.

cistanche fordele-styrker immunsystemet

Resultater

Isolering af RBD-reaktive mAbs, der udviser forskellige mønstre for neutralisering og styrke. Før spredningen af ​​Omicron-afstamningerne karakteriserede vi tidligere 43 mAbs rettet mod forskellige epitoper på spikeproteinet, inklusive det N-terminale domæne (NTD), RBD og underenhed 2 (S2). Ingen af ​​disse antistoffer var i stand til at neutralisere SARS-CoV-2-varianterne, der cirkulerede på det tidspunkt (15). I denne undersøgelse blev et yderligere panel af RBD-reaktive mAb'er udtrykt fra 3 individer med høj respons, som havde robuste anti-spike IgG-responser, som defineret tidligere (16) (Supplerende tabel 1 og 3; supplerende materiale tilgængeligt online med denne artikel; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Selvom andelen af ​​spike RBD-bindende B-celler var ens i høj-respondere sammenlignet med mid- og lav-respondere (Figur 1, A-C), var tung kæde somatiske hypermutationshastigheder signifikant større i høj-responder-gruppen (Figur 1) , D og E), hvilket tyder på, at disse individer kan have det højeste potentiale til at generere kraftige krydsreaktive mAb'er (16). Disse antistoffer blev yderligere undersøgt mod RBD-mutanter for at identificere deres epitopklassifikationer (17). Blandt 14 RBD-reaktive mAb'er identificerede vi 4 klasse 2 mAb'er, 2 klasse 3 mAb'er og 8 uklassificerede mAb'er, der viste ringe eller ingen reduktion i binding mod nogen af ​​de testede nøgle-RBD-mutanter (figur 1F). Det skal bemærkes, at klasse 2, klasse 3 og klasse 4 antistoffer omtrent svarer til RBS BD, S309 og CR3022 epitoperne defineret i tidligere undersøgelser (13, 18). Klasse 2 og 3 RBD mAbs genkendte ikke en multivariant RBD mutant indeholdende K417N/E484K/L452R/N501Y substitutioner, en kunstigt designet RBD til at inkludere nøglemutationer for virusudslip (17, 18), og de viste heller ikke nogen krydsreaktivitet til RBD af SARS-CoV-1 og mellemøstligt respiratorisk syndrom (MERS)-CoV (figur 1F). Funktionelt neutraliserede klasse 2 og 3 RBD mAb'er potent D614G og Delta varianter, men neutraliserende aktivitet var mere begrænset mod Beta, Kappa og Mu (figur 1G). Ingen af ​​de analyserede klasse 2 eller 3 antistoffer neutraliserede nogen testet Omicron-variant.

I modsætning hertil bandt størstedelen af ​​uklassificerede mAbs til RBD multivarianten og krydsreagerede til SARS-CoV-1 RBD (figur 1F). Blandt disse identificerede vi 3 mAbs, S451-1140, S626-161 og S728-1157, som viste høj neutraliseringsstyrke mod D614G og krydsneutraliseret Beta, Delta, Kappa, Mu og Omicron BA.1 med 99 % hæmmende koncentration (IC99) i området 20-2.500 ng/ml (figur 1G). I betragtning af den brede neutraliseringsstyrke af disse 3 mAbs udførte vi udover plaque-analyseplatformen også neutraliseringsaktiviteten mod autentisk BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 og XBB virus ved hjælp af fokusreduktionsneutraliseringstest (FRNT) (figur 1G). Af disse udviste S728-1157 høje neutraliserende aktiviteter mod panelet af Omicron-varianter, herunder BA.1, BA.2, BA.4 og BA.5, med en IC99 op til 100 ng/mL målt ved en plaque assay. Et lignende scenarie blev observeret ved brug af FRNT, hvor S728-1157 bevarede sin høje neutraliseringsaktivitet mod BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 og XBB med en IC50 i området 8-300 ng /ml (figur 1G). S451-1140 neutraliserede BA.1, BA.2, BA.2.75 og BL.1 kraftigt, men ikke BA.4 og BA.5, som observeret i begge neutralisationsanalyseplatforme. På den anden side udviste S626-161 ikke neutraliserende aktivitet mod Omicron-varianter ud over BA.1-varianten (figur 1G). Selvom S626-161 havde en lavere neutraliseringsstyrke mod de testede VOC'er end de andre 2 antistoffer, var det det eneste mAb, der viste krydsreaktivitet ikke kun over for SARS CoV-1 RBD, men var også i stand til at neutralisere flagermus coronavirus WIV-1 og RsSHC014 (figur 1, F og G). Disse data tyder på, at S626-161 genkender en konserveret epitop, der er delt mellem disse arbovirus-afstamninger, men er fraværende i BA.2 og senere stammer. Sammenlignet med S728-1157 og S451-1140 har S626-161 desuden en længere CDR-H3, der kunne give en forbedret evne til at genkende et meget konserveret plaster af rester, der deles på tværs af arbovirus, som beskrevet i en tidligere undersøgelse (19) (Supplerende figur 1). Ved sammenligning af immunoglobulin tunge (IGHV) og lette kæder (IGLV eller IGKV) variable gener af disse 3 mAbs med den tilgængelige SARS-CoV -2 neutraliserende mAbs database (13, 15, 20-27), fandt vi, at tung kæde variable gener brugt af S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) og S626-161 (IGHV4-39) har tidligere blevet rapporteret at koder for flere potent neutraliserende SARS-CoV-2-antistoffer rettet mod RBD (21, 22, 28, 29). Imidlertid havde kun S728-1157 unikke variable genparringer af tung og let kæde, som ikke er blevet rapporteret i databasen (supplerende tabel 3), hvilket indikerer, at det ikke er en offentlig klontype.

Figur 1. Karakterisering af RBD-reaktive mAbs isoleret fra COVID-19-rekonvalescente individer

Disse 3 mAbs (S451-1140, S626-161 og S728-1157) blev karakteriseret yderligere for at bestemme deres bindingsbredde mod SARSCoV-2 VOC'er (figur 2, A og B) . Den præfusionsstabiliserede spids indeholdende 2-prolinsubstitutioner i S2-underenheden (2P; diprolin) har vist sig at være et overlegent immunogen sammenlignet med WT-spidsen og er grundlaget for adskillige nuværende SARS-CoV-2 vacciner, herunder mRNA-baserede vacciner (30, 31). For nylig blev spidsprotein stabiliseret med 6 proliner (6P; hexaprolin) rapporteret at booste ekspression og være endnu mere stabil end den oprindelige diprolinkonstruktion; som følge heraf er det blevet foreslået til brug i næste generation af COVID-19-vacciner (32, 33). For at bestemme, om der er antigenicitetsforskelle mellem diprolin- og hexaprolin-spidskonstruktionerne, blev begge immunogener inkluderet i vores testpanel. Som målt ved ELISA fandt vi, at 3 mAbs bandt 6P-WT spike-antigen i højere grad sammenlignet med WT-2P spike (figur 2, A og B). Alle 3 mAbs viste sammenlignelig binding til spidserne af alfa-, beta-, gamma- og deltavirus i forhold til bindingen af ​​WT-2P (figur 2, A og B). Imidlertid blev bindingsreaktiviteten af ​​disse 3 mAb'er væsentligt reduceret mod et panel af Omicron-familieantigener (figur 2, B og C). S451-1140-binding var følsom over for mutationer fundet i BA.1 og BA.2, hvilket resulterede i et stort fald i binding og et 31-fold fald i neutralisering mod disse varianter sammenlignet med WT-2 henholdsvis P-antigen og D614G-virus (figur 2B). Det sarbecovirus-krydsneutraliserende mAb, S626-161, viste også 1.2- til 3.5-fold reduceret binding til spike BA.1-antigen, hvilket kan forklare en {{45} } gange reduktion i neutraliseringsaktivitet mod BA.1 (figur 1G og figur 2, B og C). For det mest potente bredt neutraliserende antistof (bnAb), S728-1157, var binding til Omicron-antigener reduceret i mindre grad (fra 1.1- til 4.4-fold) sammenlignet med WT-2P-spids og var upåvirket af neutraliserende aktivitet (figur 1G og figur 2, B og C). Det væsentlige fald i den Omicron-neutraliserende mAb-binding til BA.1-spidsen kan skyldes ændringer i dens mobilitet og relateret til den tætte pakning af Omicron 3-RBD-down-strukturerne og præference for 1- op RBD, der hjælper med at undgå antistoffer, som rapporteret af en tidligere undersøgelse (34). De 2P- og 6P-stabiliserende mutationer har også forskellige virkninger i Omicron-varianter, hvor alle 3 mAbs viste over 2.8-fold øget binding til spike BA.1-6P sammenlignet med BA.1-2P version, men kun marginalt øget binding til spike BA.2- og BA.4/5 6P-versioner sammenlignet med deres 2P-versioner med 1,2 × til 1,4 ×, hvilket tyder på lidt bedre tilgængelighed af Omicron-neutraliserende mAbs til hexapol-versionerne, især for spike BA.1 konstruktionen. Ud over ELISA blev biolagsinterferometri (BLI) brugt til at kvantificere bindingshastigheden og ligevægtskonstanterne (kon, koff og KD) af disse 3 mAb'er til et panel af spidsantigener (supplerende figur 2). Genkendelseshastighederne for fragmentantigenbindingen (Fab) til hexaprolinspidser var 1.5- til 3.3-fold hurtigere sammenlignet med diprolinspidser (Supplerende figur 2, B og C), hvilket viser, at antistofferne bandt til 6P-konstruktionen hurtigere end til 2P-konstruktionen. Dette kunne have været forventet, hvis epitoperne var mere tilgængelige på RBD i åben tilstand på hexaprolin-spidsen. Bortset fra S626- 161 dissocierede Fabs fra hexaprolinspidsen langsommere (havde en lavere koff) end diprolinspidsen, således at den samlede KD viste, at S728-1157 og S451-1140 bandt til hexaprolinspidsen med større affinitet (Supplerende figur 2, B og C). Stigningen i binding til hexaprolin-spidsen var endnu mere bemærkelsesværdig for intakt IgG ved 1:2-interaktionsmodellen som vist af S728-1157 og S451- 1140 mAbs, i overensstemmelse med eksponering af flere epitoper med 6P-stabilisering, hvilket tillader forbedret aviditet (Supplerende figur 2, A og C). Tilsammen tyder disse resultater på, at de målrettede epitoper kan være forholdsvis mere tilgængelige på den 6P-stabiliserede spids, når RBD er i åben tilstand. Strukturelle analyser blev derefter udført for at bekræfte denne formodning.

Figur 2. Bindingsbredde af Omicron-neutraliserende mAbs

Strukturel analyse af bredt neutraliserende mAbs. Som en første tilnærmelse af bundne epitoper blev et ELISA-konkurrenceassay brugt til at bestemme, om disse 3 bredt neutraliserende mAb'er delte nogen overlapning med vores nuværende panel af mAb'er, en samling af mAb'er med kendte epitopspecificiteter fra tidligere undersøgelser (15, 25, 35) , og 2 andre mAbs i øjeblikket i klinisk brug, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) og REGN10933 (Regeneron) (37). Bindingsstederne for S451-1140 og S728-1157 overlappede delvist med CC12.3 (23, 25), et klasse 1-neutraliserende antistof, og de fleste klasse 2-antistoffer, inklusive LY-CoV555 og REGN10933, men ikke med klasse 3 og klasse 4 antistoffer (figur 3A). S626-161 delte et bemærkelsesværdigt overlap i bindingsregionen med klasse 1 CC12.3, adskillige klasse 4 antistoffer, herunder CR3022 og andre uklassificerede antistoffer, mens de havde en vis delvis overlapning med adskillige klasse 2 og et enkelt klasse 3 antistoffer (figur 3A). Analogt afslørede et BLI-konkurrenceassay, at S451-1140 og S728-1157 konkurrerede stærkt med hinanden om binding til spike WT-6P, hvorimod S626-161 ikke gjorde det (Supplerende figur 3). Samlet set tyder disse data på, at S451-1140 og S728-1157 genkender lignende epitoper, der er forskellige fra S626-161.

Figur 3. Mekanisme for bred neutralisering af S728-1157

Antistof S728-1157 blev kodet af IGHV3-66 og havde en kort komplementaritetsbestemmende region 3 (CDR-H3). Især mAb'er, der binder RBS'en i bindingstilstand 1 (dvs. RBS-A eller klasse 1-sted), karakteriseret ved CC12.1, CC12.3, B38 og C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), har tendens til at bruge IGHV3-53 eller 3-66 og er følsomme over for VOC-mutationer (40). CDR-H3-regionen af ​​S728-1157 er imidlertid meget forskellig fra andre antistoffer af denne klasse, hvilket potentielt kan forklare dets bredere aktivitet. For at forstå det strukturelle grundlag for bred neutralisering af S728-1157 ved denne epitop, løste vi en kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) struktur (figur 3B) af IgG S728-1157 i kompleks med spike WT{ {31}}P-Mut7, en version af spike WT-6P med en interprotomer disulfidbinding ved C705 og C883, ved ca. 3,3 Å global opløsning (supplerende figur 4E). Ved hjælp af symmetriudvidelse, fokuseret klassificering og forfiningsmetoder opnåede vi lokal opløsning ved RBD-Fv-grænsefladen til cirka 4 Å (Supplerende Figur 4E og Supplerende Tabel 8). En krystalstruktur af S728-1157 Fab blev bestemt ved 3,1 Å opløsning og brugt til at bygge atommodellen ved RBD-Fv-grænsefladen. Vores strukturer bekræfter, at S728-1157 bandt RBS-A (eller klasse 1)-epitopen i RBD-up-konformationen (Figur 3B og Supplerende Figur 4E), svarende til andre IGHV3-53/{{55} } antistoffer (figur 3C). Sterisk blokering af det angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2) bindingssted af S728-1157 forklarer dets høje neutraliseringsstyrke mod SARS-CoV-2. 32NY33-motivet og 53SGGS56-motivet (23) i S728-1157 CDR-H1 og -H2 interagerer med RBD på næsten samme måde som CC12.3 (Supplerende figur 4, B og C). Sammenlignet med VH 98DF99 i CC12.3 danner VH 98DY99 i S728-1157 CDR-H3 imidlertid mere omfattende interaktioner, herunder både hydrofobe og polære interaktioner, med RBD, hvilket kan forklare den brede neutralisering mod VOC'er (figur 3D og supplerende tabel 6 og 7). Diglycinet VH 100GG101 i S728- 1157 CDR-H3 kan også lette mere omfattende binding sammenlignet med VH Y100 i CC12.3, sandsynligvis på grund af fleksibiliteten i glycinresterne, der fører til en anden konformation af spidsen af ​​CDR'en -H3-løkke og en relativ forskydning af rester ved 98DY99.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Selvom Omicron VOC'erne har omfattende mutationer i RBD, interagerer de fleste af disse rester ikke med S728-1157, da binding stadig observeres (Supplerende figur 4A). Fra vores spike WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157-model forventes Y505 til VL Q31 og E484 til VH Y99 at danne hydrogenbindinger (Supplerende Figur 4D og Supplerende Tabel 6 ), som har potentiale til at blive forstyrret af Omicron-mutationerne Y505H og E484A. En Y505H-mutation ville dog stadig tillade en hydrogenbinding med VL Q31, og en E484A-mutation ville tilføje en anden hydrofob sidekæde nær hydrofobe rester VL Y99, F456 og Y489. Disse kontakter kan til dels forklare mekanismen, der gør det muligt for S728-1157 at bevare neutraliserende aktivitet, omend reduceret, mod spidsen BA.1-antigenet (figur 1G og figur 2B). BA.1-antigenet er til gengæld muligvis relateret til Omicron-mutationerne, der ændrer det konformationelle landskab af spikeproteinet (34). Imidlertid er flere somatisk muterede rester, dvs. VH L27, L28, R31, F58 og VL V28 og Q31, i S728-1157 involveret i interaktion med SARS-CoV-2 RBD (Supplerende figur 1 og Supplerende tabel 7), som også kan bidrage til dens brede reaktivitet sammenlignet med CC12.3. Samlet set afslørede vores strukturelle undersøgelser grundlaget for bred neutralisering af S728-1157, der kan rumme de fleste mutationer i SARS-CoV-2 VOC'erne.

Figur 4. Beskyttende effekt af bnAbs mod SARS-CoV-2-infektion hos hamstere.

S728-1157 reducerer replikering af SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta og WT SARS-CoV-2 hos syriske hamstere. For at evaluere den beskyttende effektivitet af vores bredt neutraliserende mAbs, brugte vi en gylden syrisk hamster-infektionsmodel, som er blevet meget brugt til SARS-CoV-2. Hamstere modtog 5 mg/kg af vores test-mAbs eller en isotypekontrol målrettet mod et irrelevant antigen (ebolavirusglycoprotein) via intraperitoneal injektion 1 dag efter infektion med SARS CoV-2-vira. Lunge- og næsevæv blev opsamlet 4 dage efter infektion (figur 4A). Terapeutisk administration af S728-1157 resulterede i reducerede titere af WT-, BA.1 Omicron- og Delta-varianter i både nasale turbinater og lunger hos inficerede hamstere (figur 4, B-D). Interessant nok var virkningen af ​​S728-1157 i lungerne dramatisk, hvilket reducerede WT- og BA.1 Omicron-virusbelastningen med ca. 104PFU, hvor virustitrene for BA.1 Omicron-varianten blev fuldstændig afskaffet (figur 4C). I modsætning til in vitro-neutralisering (figur 1G) reducerede S451-1140 ikke BA.1 Omicron viral replikation i lunge- og nasale turbinater, hvilket indikerer en afbrydelse mellem in vitro-neutralisering og in vivo-beskyttelse for denne klon (figur 4E) . Til sammenligning resulterede S626-161-administration i marginalt signifikante reduktioner i lungevirustitre efter WT- og BA.1-udfordringen (figur 4, F og G). Disse data understreger, at for præcist at definere bredt beskyttende mAbs, er det nødvendigt at evaluere beskyttelseseffektiviteten parallelt med neutraliseringsaktivitet. Fremover vil det være interessant at undersøge, i hvilket omfang beskyttelseskapaciteten af ​​S728-1157 er Fc-afhængig. Samlet set repræsenterer S728-1157 et lovende mAb med bred neutraliseringseffektivitet mod SARS CoV-2-varianter, der er i stand til dramatisk at reducere WT-, Delta- og BA.1-replikation in vivo.

SARS-CoV-2-infektion fremkalder sjældent potente S728-1157-lignende krydsneutraliserende mAbs. I betragtning af det krydsneutraliserende og profylaktiske potentiale af S728-1157, forsøgte vi at evaluere, om S728-1157-lignende antistoffer almindeligvis induceres blandt polyklonale responser hos SARS-CoV-2-patienter. For at vurdere dette udførte vi konkurrence-ELISA'er ved hjælp af rekonvalescent serum til at detektere anti-RBD-antistoftitre, der kunne konkurrere om binding med S728-1157 (figur 5A). Forsøgspersoner blev opdelt i 3 grupper baseret på størrelsen af ​​antistofresponser som defineret tidligere (15, 16). Selvom høje og moderate respondere havde højere titere af S728-1157-kompetitive serumantistoffer sammenlignet med lav-responsører (figur 5B), var titrene ret lave på tværs af alle grupper, hvilket tyder på, at det er ualmindeligt at opnå høje niveauer af S{{ 18}}-lignende antistoffer i polyklonalt serum efter WT SARS-CoV-2-infektion. Ud over S728-1157 testede vi konkurrencen af ​​rekonvalescent serum med andre mAbs, herunder S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 og CC12.3. I lighed med S728-1157 observerede vi relativt lave titere af antistoffer, der konkurrerede med S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 og CC12.3 i polyklonalt serum fra det meste af de rekonvalescente individer (figur 5, C–F og H). Ikke desto mindre havde høje respondere en tendens til at have signifikant højere titere mod de neutraliserende mAbs end lav respondere (figur 5, B-F og H). I modsætning hertil var antistoffer rettet mod CR3022-epitopstedet mere udtalte hos rekonvalescente individer, hvilket tyder på berigelsen af ​​klasse 4 RBD-antistoffer i polyklonalt serum (figur 5G). Navnlig var der ingen signifikant forskel i titere af CR3022 på tværs af de 3 respondergrupper, hvilket tyder på, at CR3022-site-antistoffer konsekvent blev induceret under WT SARS-CoV-2-infektion hos de fleste individer. Interessant nok, sammenlignet med CC12.3, blev S728-1157 detekteret ved 4-fold lavere niveauer i serumet hos personer med høj respons. På trods af at klasse 1-antistoffer ofte induceres af naturlig infektion og vaccination (14, 20, 28, 29, 41-43), tyder vores data på, at S728-1157-lignende antistoffer, der repræsenterer en undergruppe af denne klasse, er forholdsvis sjældne.

Derudover undersøgte vi forskellen i reaktivitet til 2P versus 6P-stabiliseret spids i vores rekonvalescente kohortesera (figur 5, I-K). Vi fandt, at alle 3 respondergrupper monterede anti-spike-reaktive antistoffer mod 6P-stabiliseret spike-WT i højere grad end 2P-stabiliseret spike-WT, med en faktor på 6-til-11-fold (figur 5J), hvilket indikerer, at store antigene epitoper var bedre udstillet eller stabiliseret på 6P-stabiliseret antigen. Ved at bruge de samme prøver havde høje og moderate respondere også lavere titre af anti-spike-antistoffer mod BA.1-2P end BA.1-6P, 4-til-5-fold (Figur 5K). Det skal bemærkes, at lavt respondere havde en mindre foldændring i bindingsreaktivitet mod spike BA.1 Omicron-2P og 6P (2-fold reduktion) sammenlignet med WT-2P og 6P spike ({ {28}}foldsreduktion) (figur 5, J og K), hvilket tyder på, at serumantistof mod BA.1 Omicron-reaktive epitoper kan være mere begrænsede hos lav-responderende personer. Samlet set tyder disse data på, at der er forbedret polyklonal binding induceret af naturlig infektion til 6P-stabiliseret spike, både for WT og Omicron virus.

S728-1157-lignende antistoffer induceres optimalt i forbindelse med hybridimmunitet. Primær SARS-CoV-2-infektion uden vaccination er blevet sjælden i det nuværende globale miljø, og adskillige undersøgelser har rapporteret, at SARS-CoV-2-immunitet er forskellig mellem individer med specifik vaccinations-/infektionshistorie. Som et resultat forsøgte vi dernæst at undersøge, hvilke almindelige eksponeringer, bortset fra WT-infektion med forfædres SARS-CoV-2 alene, effektivt ville inducere S728-1157-lignende antistoffer i plasma fra monovalente mRNA-baserede vaccinerede med og uden forudgående infektion. Vi fik den nødvendige bioprøve fra undersøgelseskohorten Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARIS), som har fulgt sundhedspersonale i længderetningen siden begyndelsen af ​​pandemien (44). Vi udvalgte plasmaprøver fra fuldt immuniserede (2 × vaccinerede) undersøgelsesdeltagere med og uden infektion samt fra boostede deltagere (3 × vaccinerede) med og uden infektion. Derudover inkluderede vi også prøver fra undersøgelsesdeltagere, der havde modtaget den bivalente mRNA-vaccine (forfædres WA1/2020 plus Omicron BA.5) (figur 6A og supplerende tabel 2). De banebrydende infektioner hos deltagere, der havde modtaget boostervaccinationer, opstod på et tidspunkt, hvor Omicron-slægterne havde fortrængt alle andre SARS-CoV--2-slægter i hovedstadsområdet i New York. Vi fandt ud af, at dobbeltvaccinerede individer havde de laveste titere af S728-1157-konkurrerende serumantistoffer blandt de 5 testgrupper af prøver (figur 6B). Disse niveauer svarede især til det, der blev observeret for vores rekonvalescent-uvaccinerede kohorte (alle respondere; figur 5B). Til sammenligning udviste individer med en historie med naturlig infektion, inklusive rekonvalescente individer med 2 af 3 vaccinedoser, og individer, der havde oplevet en gennembrudsinfektion og fik en bivalent booster, signifikant højere niveauer af S728-1157-elicitation sammenlignet med uinficerede men vaccinerede individer (figur 6B). Selvom den uinficerede 3-dosisgruppe kun udviste en ikke-signifikant stigning sammenlignet med 2-dosisgruppen, viste parret opdeling efter vaccinetype, at homologe tredje doser af BNT162b2 og mRNA-1273 signifikant øgede S{{ 38}} som neutraliserende antistoftitre med henholdsvis 2,72 × og 2,85 × (figur 6, C og D). For at bemærke, blandt deltagerne med 3 samlede kontakter med spike på nogen måde, var S728-1157-lignende antistoftitre 3 × højere hos rekonvalescente dobbeltvaccinerede sammenlignet med infektionsnaive triple-vaccinerede, hvilket tyder på, at SARS-CoV{{ 51}} infektion inducerer denne klontype mere optimalt. Blandt hybridimmunitetsgrupper bemærkede vi, at et flertal af de boostede individer med gennembrud, som modtog den bivalente boostervaccinedosis, kun havde marginalt højere S728-1157-antistoftiter sammenlignet med præ omicron-rekonvalescentvaccinerede grupper, hvilket tyder på, at S{{53 }} titer nærmede sig sandsynligvis et plateau efter 3 eksponeringer. Vi undersøgte også titerne af polyklonale antistoffer, der konkurrerede med CC12.3 og CR3022 ud over S728-1157. Alle individer udviste relativt høje titre af CC12.3- og CR3022-lignende antistoffer, uafhængigt af antallet og typen af ​​eksponeringer (Supplerende figur 5), i modsætning til hvad vi observerede for S728-1157- som antistoffer. Samlet set indikerer disse data, at SARS-CoV-2-infektion og mRNA-vaccination begge bidrager til S728-1157-lignende antistofinduktion, hvor infektion spiller en mere dominerende rolle hos vaccinerede individer.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Endelig fandt vi, ved at sammenligne responser mod 2P- versus 6P-stabiliseret spids i mRNA-vaccinationskohorten, at de fleste grupper fremkaldte lignende niveauer af antistoffer mod begge konstruktioner. Undtagelsen fra dette var den uinficerede tredobbelte vaccinerede gruppe, som viste statistisk højere, men kun lidt øget, reaktivitet over for 2P sammenlignet med den 6P-stabiliserede spids (figur 6E). Disse data tyder på, at i modsætning til naturlig infektion (figur 5, J og K) producerer vaccination alene en polyklonal respons, der er mere begrænset til epitoper i Spike-2P-konstruktionen, på linje med Spike{{12 }}P-formulering af nuværende vacciner. I sidste ende understøtter disse resultater ideen om, at 6P-stabilisering af fremtidige SARS-CoV-2-vacciner kan være til stor fordel ved at inducere bredt beskyttende antistofklonotyper som S728-1157.

Figur 5. Konvalescent serumantistofkonkurrence med bredt neutraliserende RBD-reaktive mAbs og sammenligning af serumantistofrespons mod 6P- versus 2P-stabiliserede spidser

Figur 6. mRNA-vaccineret serumantistofkonkurrence med S728-1157-neutraliserende RBD-reaktive mAbs og sammenligning af serumantistofrespons mod 6P- versus 2P-stabiliserede spidser.

Diskussion

I denne undersøgelse identificerer vi et potent bnAb isoleret fra en hukommelses-B-celle fra en person, der var kommet sig fra SARS-CoV-2-infektion under den indledende bølge af COVID-19-pandemien. Dette bnAb, S728- 1157, opretholdt væsentlig bindingsreaktivitet og havde konsekvent neutraliserende aktivitet mod alle testede SARS-CoV-2 VOC, inklusive Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 og XBB og var i stand til væsentligt at reducere infektiøse virale titere efter Delta- og BA.1-infektion hos hamstere.

Vi fandt ud af, at rekonvalescent serum fra vores kohorte indeholdt lave koncentrationer af antistoffer, der konkurrerer med S728-1157 (et klasse 1/RBS-A antistof) og klasse 2 epitop mAbs. Dette tyder på, at S728-1157 er noget unikt i forhold til andre antistoffer, der retter sig mod klasse 1-epitoper og sjældent induceres i den RBD-specifikke hukommelse B-cellepulje. I stedet så vores naturlige infektionskohorte ud til at inducere antistoffer rettet mod CR3022 (klasse 4) epitopen; antistoffer med denne specificitet er ofte krydsreaktive, men mindre potent neutraliserende end RBS-målrettede antistoffer (14, 17). Disse data er komplementære til vores tidligere resultater, der viser, at en overflod af klasse 3/S309 antistoffer i rekonvalescent sera kan bidrage til neutraliserende aktivitet mod alfa- og gamma-varianter, hvorimod mangel på klasse 2-antistoffer kan forklare reduceret neutraliseringsevne mod Delta (15) . På trods af det rapporteres aktivitetsbredden af ​​de fleste af disse RBS-målrettede antistoffer (RBS-A/klasse 1, RBS-B, C/klasse 2 og RBS-D, S309/klasse 3) mod Omicron-varianter at være meget begrænset (11, 40, 45).

Den vigtigste udfordring fremover vil være at bestemme, hvordan man forbedrer fremkaldelsen af ​​bredt krydsreaktive antistoffer mod konserverede RBS-epitoper. I denne forbindelse observerede vi her, at individer med hybridimmunitet havde signifikant højere titre af S728-1157-lignende antistoffer end vaccinerede individer uden forudgående infektion. Det er vigtigt, at dette fænomen blev bemærket, selv når antallet af eksponeringer var kontrolleret for (dvs. hos rekonvalescente dobbeltvaccinerede versus uinficerede tripelvaccinerede), hvilket tyder på, at et eller andet element af infektionsassocieret immunitet (eller en vaccineformulering, der kan efterligne denne type immunitet) er vigtig for fremkaldelsen af ​​denne klontype. Dette er i overensstemmelse med eksperimentelle beviser, der dokumenterer, at individer med hybridimmunitet har bredere antistofreaktivitetsprofiler sammenlignet med dem, der kun har en vaccinationsinduceret eller primær infektionsinduceret immunrespons (9).

Strukturerne heri illustrerede, at S728-1157 bandt RBS-A/klasse 1-epitopen i opkonformationen RBD. Denne epitop ser ud til at være lettere tilgængelig på 6P-stabiliserede spidser, som er blevet rapporteret at præsentere 2 RBD'er i upstate sammenlignet med 2P spidser, som kun præsenterer 1 (30, 33, 46, 47), og som vores antistoffer mod. specifik for up-conformation spike viser forbedret binding. S728-1157 blev isoleret efter naturlig infektion; i sådanne sammenhænge er oddsene for at inducere S728-1157-lignende kloner sandsynligvis højere, da RBD skal være i stand til at adoptere en opkonformation, selv forbigående, for at binde til ACE2 og derved blotlægge denne epitop. I modsætning til størstedelen af ​​IGHV3-53/3-66 RBS-A/klasse 1-antistoffer kan S728-1157 rumme nøglemutationer i VOC-spidser ved hjælp af omfattende interaktioner mellem CDR-H3 og RBD (29, 48-50). S728-1157 bruger også en anden let kæde (IGLV3-9) sammenlignet med andre mindre brede antistoffer såsom CC12.3 (IGKV3-20), hvilket kan påvirke de overordnede bindingsinteraktioner; vores analyse indikerer imidlertid, at der er mindre hydrogenbinding mellem den lette S728-1157-kæde og RBD sammenlignet med CC12.3 (Supplerende tabel 7). Selvom de fleste af de CDR-H3-kontaktrester, der er kritiske for VOC-krydsreaktivitet i denne interaktion, er kimlinjekodede og ikke introduceret af somatiske mutationer, er adskillige somatisk muterede rester i rammeregioner eller CDR-H1, CDR-H2 og CDR-L1 involveret i interaktion med SARS-CoV-2 RBD. På den ene side tyder dette på, at hukommelses-B-celler, der koder for IGHV3-53/66-klasse antistoffer, kunne opnå en tilsvarende grad af krydsreaktivitet ved yderligere affinitetsmodning. På den anden side indikerer dette også muligheden for at designe germline-målrettede immunogener, der målretter mod S728-1157-lignende naive B-celler. Selvom det kan være udfordrende at designe vacciner, der specifikt kan fremkalde S728-1157-lignende antistoffer med udvalgte CDR-H3'er, der er i stand til at overvinde VOC-mutationerne, er det opmuntrende, at IGHV-genrestriktion observeres i andre potente SARS-CoV{ {58}} neutraliserende mAbs-undersøgelser (13, 15, 20-27). Alternativt kan dette også være muligt gennem iterativ immunisering med optimerede RBD-immunogener, som det tidligere er blevet rapporteret for andre patogener (51-55).

Selvom mange mutationer er blevet observeret i RBS-A/klasse 1-antigenstedet (18), med hensyn til S728-1157-epitopen, 13 af 15 totale RBD-kontaktrester og 2 af 3 CDR-H{{9} }bundne RBD-kontaktrester bevares i Omicron og alle andre VOC'er. Dette tyder på, at RBD-regionen, hvor S728-1157-epitopen findes, kan omfatte rester, der er kritiske for dens dynamiske funktion og virale fitness, og derfor ville være mindre tolerant over for mutationer og antigendrift end omgivende RBS-A/klasse 1-stedrester. Hvis dette er tilfældet, bør tendensen til, at denne særlige epitop går tabt, efterhånden som virale varianter udvikler sig, reduceres, hvilket gør karakterisering af S728-1157 og lignende antistoffer og epitoper vigtig for variantresistente vacciner eller mAb-terapeutisk udvikling. Sammenfattende identificerer vores undersøgelse bnAbs, der kan informere immunogendesign til næste generations variantsikre coronavirus-vacciner eller tjene som mAb-terapi, der er resistente over for SARS CoV-2-udvikling. Især med hensyn til kombineret styrke og bredde ser S728-1157 ud til at være det bedste antistof i klassen, der er isoleret til dato. I betragtning af at dette antistof binder lettere med 6P-stabilisering, forudsiges det at blive præferentielt induceret af 6P-stabiliserede rekombinante spikeproteiner eller hele virus, hvilket tyder på, at hexaprolinmodifikation kan gavne fremtidige vaccinekonstruktioner for at beskytte optimalt mod fremtidig SARS-CoV -2 varianter og andre arbovirus.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Metoder

Monoklonal antistofisolering. PBMC'er blev isoleret fra leukoreduktionsfiltre og frosset som beskrevet tidligere (24). B-celler blev beriget fra PBMC'er via FACS. Celler blev farvet med CD19, CD3 og antigenprober konjugeret til oligo-fluorofor; celler af interesse blev identificeret som CD3-CD19+ Antigen+. Alle mAb'er blev genereret fra oligo-mærkede, antigen lokkemad-sorterede celler identificeret gennem enkeltcellet RNA-Seq, som beskrevet tidligere (15, 24). De enkelte B-celledata genereret i denne undersøgelse er blevet deponeret til Gene Expression Omnibus: GSE171703 og GSM5231088-GSM5231123.

Antigen-specifikke B-celler blev udvalgt til at generere mAb'er baseret på antigen-probe-intensitet analyseret af JMP Pro 15. Antistof-tunge og lette kædegener blev syntetiseret af Integrated DNA Technologies (IDT) og klonet ind i humant IgG1 og humant κ eller λ let-kæde ekspressionsvektorer ved hjælp af Gibson-samling, som tidligere beskrevet (56). De tunge og lette kæder af det tilsvarende mAb blev transient cotransficeret ind i HEK293T-celler (ATCC). Efter transfektion i 18 timer blev de transficerede celler suppleret med proteinfri hybridommediumsupernatant (PFHM-II, Gibco). Supernatanten indeholdende udskilt mAb blev høstet på dag 4 og oprenset under anvendelse af protein A-agaroseperler (Thermo Fisher Scientific) som beskrevet tidligere (56). Sekvenser af tunge og lette kæder af de velkarakteriserede antistoffer blev afledt fra Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) og REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) og blev syntetiseret som beskrevet ovenfor. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) blev leveret af Meng Yuan ved Scripps Research Institute (San Diego, Californien, USA). Rekombinant spidsproteinekspression. Den rekombinante D614G SARS-CoV-2 fuldlængde (FL) spids, BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, enkelte RBD-mutanter (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493Y, N Y505A og Y505F), kombination RBD mutant (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD og MERS-CoV RBD blev genereret internt. Kort fortalt blev de rekombinante antigener udtrykt under anvendelse af Expi293F-celler (Thermo Fisher Scientific). Genet af interesse blev klonet ind i en pattedyrsekspressionsvektor (in-house modificeret AbVec) og transficeret under anvendelse af ExpiFectamine 293-kittet (Thermo Fisher Scientific) i henhold til producentens protokol. Supernatanten blev høstet på dag 4 efter transfektion og inkuberet med Ni-nitrilotrieddikesyre (Ni-NTA) agarose (Qiagen). Oprensningen blev udført under anvendelse af en tyngdekraftsstrømningssøjle og elueret med imidazolholdig buffer som tidligere beskrevet (57, 58). Eluatet blev bufret og udskiftet med PBS under anvendelse af en Amicon centrifugalenhed (Millipore). De rekombinante FL-spidser stabiliseredes af 2P-mutationer af varianterne B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 og BA.4 Omicron og var produceret i Sather Laboratory ved Seattle Children's Research Institute. K417V, N439K og E484K RBD'erne og den rekombinante FL spike WT-2P og 6P blev produceret i Krammer-laboratoriet på Icahn School of Medicine ved Mount Sinai. SARS-CoV-2-6P-Mut7 og spike BA.1-6P blev designet og produceret som beskrevet i en tidligere undersøgelse (59). Proteinsekvenserne og ressourcerne for hvert antigen er anført i supplerende tabel 4. ELISA. Rekombinante SARS-CoV-2 spike/RBD-proteiner blev coatet på højproteinbindende mikrotiterplader (Costar) ved 2 ug/mL i PBS ved 50 μL/brønd og holdt natten over ved 4 grader. Pladerne blev vasket med PBS indeholdende 0,05% Tween 20 (PBS-T) og blokeret med 150 μL PBS indeholdende 20% FBS i 1 time ved 37 grader. Monoklonale antistoffer blev serielt fortyndet 3-fold fra 10 ug/ml i PBS og inkuberet i brøndene i 1 time ved 37 grader. Pladerne blev derefter vasket og inkuberet med HRP-konjugeret gede-anti-humant IgG-antistof (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) i 1 time ved 37 grader. Efter vask blev der tilsat 100 μL Super AquaBlue ELISA-substrat (eBioscience) pr. brønd. Absorbans blev målt ved 405 nm på et mikropladespektrofotometer (Bio-Rad). Assayene blev standardiseret under anvendelse af kontrolantistof S144-509 (15), med kendte bindingskarakteristika i hver plade, og pladerne blev udviklet, indtil absorbansen af ​​kontrollen nåede en OD på 3,0. Alle mAbs blev testet i duplikat, og hvert eksperiment blev udført to gange.

Serum ELISA. Højproteinbindende mikrotiterplader blev coatet med rekombinante SARS-CoV-2 spike-antigener ved 2 ug/mL i PBS natten over ved 4 grader. Pladerne blev vasket med PBS 0.05 % Tween og blokeret med 200 μL PBS 0,1 % Tween + 3% skummetmælkspulver i 1 time ved stuetemperatur (RT). Plasmaprøver blev varmeinaktiveret i 1 time ved 56 grader før udførelse af serologieksperimentet. Plasma blev seriefortyndet 2-fold i PBS 0,1 % Tween + 1 % skummetmælkspulver. Plader blev inkuberet med serumfortyndinger i 2 timer ved stuetemperatur. Det HRP-konjugerede gede-anti-humane Ig sekundære antistof fortyndet ved 1:3,000 med PBS 0,1% Tween + 1% skummetmælkspulver blev brugt til at detektere bindingen af ​​antistoffer. Efter 1 times inkubation blev pladerne udviklet med 100 μL SigmaFast OPD-opløsning (Sigma-Aldrich) i 10 minutter. Derefter blev 50 μL 3M HCl brugt til at stoppe udviklingsreaktionen. Absorbansen blev målt ved 490 nm på et mikropladespektrofotometer (Bio-Rad). Slutpunktstitre blev ekstrapoleret fra den sigmoide 4PL (hvor x er log koncentration) standardkurve for hver prøve. Detektionsgrænsen (LOD) er defineret som middelværdien af ​​+ 3 SD af OD-signalet optaget ved hjælp af plasma fra præ-SARS-CoV-2 individer. Alle beregninger blev udført i GraphPad Prism-software (version 9.0).

Konkurrence ELISA. For at bestemme målepitopklassificeringen af ​​RBD-reaktive mAb'er blev konkurrence-ELISA'er udført under anvendelse af andre mAb'er med kendte epitopbindingskarakteristika som konkurrerende mAb'er. Konkurrent-mAb'er blev biotinyleret under anvendelse af EZ-Link sulfo-NHS-biotin (Thermo Fisher Scientific) i 2 timer ved stuetemperatur. Det overskydende biotin af biotinylerede mAb'er blev fjernet med 7k molekylvægt-cutoff (MWCO) Zeba spin-afsaltningssøjler (Thermo Fisher Scientific). Plader blev coatet med 2 ug/ml RBD-antigen natten over ved 4 grader. Pladerne blev blokeret med PBS–20% FBS i 2 timer ved stuetemperatur, og 2-fold fortyndingen af ​​mAbs fra en ikke-bestemt klasse eller serum blev tilføjet, startende ved 20 ug/ml mAbs og en 1:10 fortynding af serum. Efter antistofinkubation i 2 timer ved stuetemperatur blev det biotinylerede konkurrerende mAb tilsat i en koncentration, der var dobbelt så stor som dets dissociationskonstant (KD) og inkuberet i yderligere 2 timer ved stuetemperatur sammen med mAb'et eller serumet, der tidligere var tilsat. Pladerne blev vasket og inkuberet med 100 μL HRP-konjugeret streptavidin (Southern Biotech) i en fortynding på 1:1,000 i 1 time ved 37 grader. Pladerne blev udviklet med Super AquaBlue ELISA-substratet (eBioscience). For at normalisere assayene blev det konkurrerende biotinylerede mAb tilsat til en brønd uden nogen konkurrerende mAb'er eller serum som kontrol. Data blev registreret, når absorbansen af ​​kontrolbrønden nåede en OD på 1,0-1,5. Den procentvise konkurrence mellem mAbs blev derefter beregnet ved at dividere en prøves observerede OD med OD opnået af den positive kontrol, trække denne værdi fra 1 og gange med 100. For serum blev OD'er log10 transformeret og analyseret ved ikke-lineær regression for at bestemme 50 % hæmningskoncentration (IC50) værdier ved brug af GraphPad Prism-software (version 9.0). Dataene blev transformeret til Log1P og plottet ind i en graf, der repræsenterer reciprok serumfortynding af IC50 af serumfortynding, der kan opnå 50 % konkurrence med konkurrentens mAb af interesse. Alle mAbs blev testet i duplikat, hvert eksperiment blev udført 2 gange uafhængigt, og værdier fra 2 uafhængige eksperimenter blev beregnet som gennemsnit.

Plaque assays. Plaqueassays blev udført med SARS-CoV-2-variantvirus på Vero E6/TMPRSS2-celler (japansk samling af forskningsbioressourcer (JCRB)) (supplerende tabel 5). Celler blev dyrket for at opnå 90% konfluens, før de blev trypsinbehandlet og podet ved en tæthed på 3 × 104 celler/brønd i 96-brøndsplader. Den følgende dag blev 102 PFU'er af SARS-CoV-2-variant inkuberet med 2-fold-fortyndede mAbs i 1 time. Antistof-virusblandingen blev inkuberet med Vero E6/TMPRSS2-celler i 3 dage ved 37 grader. Plader blev fikseret med 20% methanol og derefter farvet med krystalviolet opløsning. De fuldstændige inhiberende koncentrationer (IC99) blev beregnet ved hjælp af log(inhibitoren) versus normaliseret respons (variabel hældning), udført i GraphPad Prism (version 9.0). Alle mAbs blev testet i duplikat, og hvert eksperiment blev udført to gange. Fokusreduktionsneutraliseringstest. Fokusreduktionsneutraliseringstest (FRNT'er) blev brugt til at bestemme neutraliseringsaktiviteter som en yderligere platform bortset fra plakanalysen. Seriefortyndinger af serum startende ved en slutkoncentration på 1:20 blev blandet med 103 fokusdannende enheder af virus pr. brønd og inkuberet i 1 time ved 37 grader. En samlet præpandemisk serumprøve tjente som kontrol. Antistof-virusblandingen blev inokuleret på Vero E6/TMPRSS2-celler (JCRB) i 96-brøndsplader og inkuberet i 1 time ved 37 grader. Et lige så stort volumen methylcelluloseopløsning blev tilsat til hver brønd. Cellerne blev inkuberet i 16 timer ved 37 grader og derefter fikseret med formalin. Efter at formalinen var fjernet, blev cellerne immunfarvet med et muse-mAb mod SARS-CoV-1/2-nukleoprotein [klon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], efterfulgt af et HRP-mærket gede-anti-muse-immunoglobulin (Sigma- Aldrich; A8924). De inficerede celler blev farvet med TrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences) og derefter vasket med destilleret vand. Efter tørring blev fokustallene kvantificeret ved at bruge en ImmunoSpot S6 Analyzer, ImmunoCapture-software og BioSpot-software (Cellular Technology). IC50 blev beregnet ud fra den interpolerede værdi fra log(inhibitoren) versus normaliseret respons ved hjælp af variabel hældning (4 parametre) ikke-lineær regression udført i GraphPad Prism (version 9.0).

Referencer

1. Hou YJ, et al. SARS-CoV-2 D614G-varianten udviser effektiv replikation ex vivo og transmission in vivo. Videnskab. 2020;370(6523):1464-1468.

2. Garcia-Beltran WF, et al. Flere SARS CoV-2 varianter undslipper neutralisering ved vaccine-induceret humoral immunitet. Celle. 2021;184(9):2523.

3. Wall EC, et al. Neutraliserende antistofaktivitet mod SARS-CoV-2 VOC'er B.1.617.2 og B.1.351 ved BNT162b2-vaccination. Lancet. 2021;397(10292):2331-2333.

4. Edara VV, et al. Infektion og vaccine-inducerede neutraliserende antistof-responser på SARS-CoV-2 B.1.617-varianterne. N Engl J Med. 2021;385(7):664-666.

5. Zhou D, et al. Bevis for undslippe af SARS-CoV-2 variant B.1.351 fra naturlige og vaccine-inducerede sera. Celle. 2021;184(9):2348-2361.

6. Weisblum Y, et al. Undslip fra neutraliserende antistoffer ved hjælp af SARS-CoV-2 spike proteinvarianter. Elife. 2020;9:e61312.

7. Graham F. Daglig briefing: Omicron coronavirus-variant sætter videnskabsmænd i alarmberedskab. Natur. 2021;.

8. Karim SSA, Karim QA. Omicron SARS-CoV-2-variant: et nyt kapitel i COVID-19-pandemien. Lancet. 2021;398(10317):2126-2128.

9. Carreño JM, et al. Aktivitet af rekonvalescent- og vaccineserum mod SARS-CoV-2 Omicron. Natur. 2021;602(7898):682-688.

10. Wang Q, et al. Alarmerende antistofunddragelsesegenskaber for stigende SARS-CoV-2 BQ- og XBB-undervarianter. Celle. 2022;186(2):279-286.

11. VanBlargan LA, et al. En infektiøs SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron-virus undslipper neutralisering af terapeutiske monoklonale antistoffer. Nat Med. 2022;28(3):490-495.

12. Takashita E, et al. Effekten af ​​antistoffer og antivirale lægemidler mod Covid-19 Omicron Variant. N Engl J Med. 2022;386(10):995-998.

13. Yuan M, et al. Genkendelse af SARS-CoV-2-receptorbindingsdomænet ved neutraliserende antistoffer. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192-203.

14. Barnes CO, et al. SARS-CoV-2 neutraliserende antistofstrukturer informerer om terapeutiske strategier. Natur. 2020;588(7839):682-687.

15. Changrob S, et al. Krydsneutralisering af nye SARS-CoV-2-varianter, der giver anledning til bekymring, ved hjælp af antistoffer rettet mod forskellige epitoper på spike. Mbio. 2021;12(6):e0297521.

16. Guthmiller JJ, et al. SARS-CoV-2-infektionssværhedsgrad er forbundet med overlegen humoral immunitet mod spidsen. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.

17. Greaney AJ, et al. Kortlægning af mutationer til SARS-CoV-2 RBD, der undslipper binding af forskellige klasser af antistoffer. Nat Commun. 2021;12(1):4196.

18. Liu H, Wilson IA. Beskyttende neutraliserende epitoper i SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76-92.

19. Jette CA, et al. Bred krydsreaktivitet på tværs af arbovirus udvist af en undergruppe af COVID-19 donor-afledte neutraliserende antistoffer. Cell Rep. 2021;36(13):109760.

20. Brouwer PJM, et al. Potente neutraliserende antistoffer fra COVID-19-patienter definerer flere sårbarhedsmål. Videnskab. 2020;369(6504):643-650.

21. Pinto D, et al. Krydsneutralisering af SARS CoV-2 af et humant monoklonalt SARS-CoV-antistof. Natur. 2020;583(7815):290-295.

22. Robbiani DF, et al. Konvergerende antistofreaktioner på SARS-CoV-2 hos rekonvalescente individer. Natur. 2020;584(7821):437-442.

23. Yuan M, et al. Strukturelt grundlag for et delt antistofrespons på SARS-CoV-2. Videnskab. 2020;369(6507):1119-1123.

24. Dugan HL, et al. Profilering af B-celle-immunodominans efter SARS-CoV-2-infektion afslører antistofudvikling mod ikke-neutraliserende virale mål. Immunitet. 2021;54(6):1290-1303.

25. Rogers TF, et al. Isolering af potente SARS CoV-2 neutraliserende antistoffer og beskyttelse mod sygdom i en lille dyremodel. Videnskab. 2020;369(6506):956-963.

26. Schmitz AJ, et al. Et vaccine-induceret offentligt antistof beskytter mod SARS-CoV-2 og nye varianter. Immunitet. 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. Shi R, et al. Et humant neutraliserende antistof målretter mod receptorbindingsstedet for SARS-CoV-2. Natur. 2020;584(7819):120-124.

28. Cao Y, et al. Potente neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 identificeret ved high-throughput enkeltcelle-sekventering af rekonvalescente patienters B-celler. Celle. 2020;182(1):73–84.

29. Barnes CO, et al. Strukturer af humane antistoffer bundet til SARS-CoV-2-spidsen afslører almindelige epitoper og tilbagevendende træk ved antistoffer. Celle. 2020;182(4):828-842.

30. Corbett KS, et al. SARS-CoV-2 mRNA-vaccinedesign muliggjort af prototype-patogenberedskab. Natur. 2020;586(7830):567-571.

31. Amanat F, et al. Introduktionen af ​​to proliner og fjernelse af det polybasiske spaltningssted førte til højere effektivitet af en rekombinant spike-baseret SARS-CoV-2-vaccine i musemodellen. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. Sun W, et al. En Newcastle disease-virus, der udtrykker et stabiliseret spidsprotein af SARS-CoV-2, inducerer beskyttende immunresponser. Nat Commun. 2021;12(1):6197.

33. Hsieh CL, et al. Strukturbaseret design af præfusionsstabiliserede SARS-CoV-2-spidser. Videnskab. 2020;369(6510):1501-1505.

34. Gobeil SM, et al. Strukturel mangfoldighed af SARS-CoV-2 Omicron-spidsen. Mol Cell. 2022;82(11):2050-2068.

35. Yuan M, et al. En meget konserveret kryptisk epitop i de receptorbindingsdomæner af SARS-CoV-2 og SARS-CoV. Videnskab. 2020;368(6491):630-633.

36. Starr TN, et al. Komplet kort over SARS-CoV-2 RBD-mutationer, der undslipper det monoklonale antistof LY-CoV555 og dets cocktail med LY-CoV016. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.

37. Baum A, et al. REGN-COV2-antistoffer forebygger og behandler SARS-CoV-2-infektion hos rhesus-makakaber og hamstere. Videnskab. 2020;370(6520):1110-1115.

38. Wu NC, et al. En alternativ bindingsmåde for IGHV3-53-antistoffer til SARS-CoV-2-receptorbindingsdomænet. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y, et al. Et ikke-konkurrerende par humane neutraliserende antistoffer blokerer COVID-19-virusets binding til dets receptor ACE2. Videnskab. 2020;368(6496):1274-1278.

40. Yuan M, et al. Strukturelle og funktionelle konsekvenser af antigen drift i nyere SARS-CoV-2 varianter. Videnskab. 2021;373(6556):818-823.

41. Yan Q, et al. Germline IGHV3-53-kodede RBD-målrettede neutraliserende antistoffer er almindeligvis til stede i antistofrepertoirerne hos COVID-19-patienter. Emerg Microbes Infect. 2021;10(1):1097-1111.

42. Zhang Q, et al. Potente og beskyttende IGHV3- 53/3-66 offentlige antistoffer og deres delte flugtmutant på toppen af ​​SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021;12(1):4210.

43. Wang Z, et al. mRNA-vaccine-fremkaldte antistoffer mod SARS-CoV-2 og cirkulerende varianter. Natur. 2021;592(7855):616-622.

44. Simon V, et al. PARIS og SPARTA: at finde akilleshælen til SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN, et al. SARS-CoV-2 RBD-antistoffer, der maksimerer bredden og modstanden mod undslippe. Natur. 2021;597(7874):97-102.

46. ​​Walls AC, et al. Struktur, funktion og antigenicitet af SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Celle. 2020;181(2):281-292.

47. Henderson R, et al. Styring af SARS-CoV-2 spike glycoprotein konformation. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925-933.

48. Shrestha LB, et al. Bredt neutraliserende antistoffer mod nye SARS-CoV-2-varianter. Front Immunol. 2021;12:752003.

49. Greaney AJ, et al. Antistoffer fremkaldt af mRNA-1273-vaccination binder bredere til det receptorbindingsdomæne end dem fra SARS-CoV-2-infektion. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM, et al. SARS-CoV-2 Beta-variantinfektion fremkalder potente afstamningsspecifikke og krydsreaktive antistoffer. Videnskab. 2022;375(6582):782-787.

51. Wrammert J, et al. Bredt krydsreaktive antistoffer dominerer den humane B-celle-respons mod 2009 pandemisk H1N1-influenzavirusinfektion. J Exp Med. 2011;208(1):181-193.

52. Guthmiller JJ, et al. Første eksponering for den pandemiske H1N1-virus-inducerede bredt neutraliserende antistoffer rettet mod hæmagglutinin hovedepitoper. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajic G, et al. Influenzaantigenteknologi fokuserer på immunresponser på en subdominant, men bredt beskyttende viral epitop. Celleværtsmikrobe. 2019;25(6):827-835.

54. Nachbagauer R, et al. En kimærisk hæmagglutinin-baseret universel influenzavirusvaccinemetode inducerer bred og langvarig immunitet i et randomiseret, placebokontrolleret fase I-forsøg. Nat Med. 2021;27(1):106-114.

55. Angeletti D, et al. Outflankerende immundominans for at målrette subdominante bredt neutraliserende epitoper. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ, et al. En effektiv metode til at generere monoklonale antistoffer fra humane B-celler. Metoder Mol Biol. 2019;1904:109-145.

57. Amanat F, et al. Et serologisk assay til at påvise SARS-CoV-2 serokonversion hos mennesker. Nat Med. 2020;26(7):1033-1036.

58. Stadlbauer D, et al. SARS-CoV-2 serokonversion hos mennesker: en detaljeret protokol for en serologisk analyse, antigenproduktion og testopsætning. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.

59. Torres JL, et al. Strukturel indsigt i et meget potent pan-neutraliserende SARS-CoV-2 humant monoklonalt antistof. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C, et al. Automatiseret molekylær mikroskopi: det nye Leginon-system. J Struct Biol. 2005;151(1):41-60.

61. Lander GC, et al. Appion: en integreret, database-drevet pipeline til at lette EM billedbehandling. J Struct Biol. 2009;166(1):95-102.

62. Voss NR, et al. DoG Picker og TiltPicker: softwareværktøjer til at lette partikeludvælgelse i enkeltpartikelelektronmikroskopi. J Struct Biol. 2009;166(2):205-213.

63. Pettersen EF, et al. UCSF Chimera--et visualiseringssystem til udforskende forskning og analyse. J Comput Chem. 2004;25(13):1605-1612.

64. Punjani A, et al. Ikke-ensartet forfining: adaptiv regularisering forbedrer enkelt-partikel kryo-EM-rekonstruktion. Nat Metoder. 2020;17(12):1214-1221.

65. Zhang K. Gctf: CTF-bestemmelse og korrektion i realtid. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.

66. Zivanov J, et al. Nye værktøjer til automatiseret cryo-EM-strukturbestemmelse i høj opløsning i RELION-3. Elife. 2018;7:e42166.

67. Casanal A, et al. Aktuelle udviklinger inden for hønsehøne til makromolekylær modelopbygning af elektronkryo-mikroskopi og krystallografiske data. Protein Sci. 2020;29(4):1069-1078.

68. Frenz B, et al. Automatisk fiksering af fejl i glykoproteinstrukturer med rosetta. Struktur. 2019;27(1):134–139.

69. Klaholz BP. Udledning og raffinering af atommodeller i krystallografi og kryo-EM: de seneste Phenix-værktøjer til at lette strukturanalyse. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(pkt. 10):878-881.

70. Pettersen EF, et al. UCSF ChimeraX: Strukturvisualisering for forskere, undervisere og udviklere. Protein Sci. 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. Behandling af røntgendiffraktionsdata indsamlet i oscillationstilstand. Metoder Enzymol. 1997;276:307-326.

72. McCoy AJ, et al. Phaser krystallografiske software. J Appl Crystallogr. 2007;40(pkt. 4):658-674.

73. Qiang M, et al. Neutraliserende antistoffer mod SARS CoV-2 blev udvalgt fra et humant antistofbibliotek konstrueret for årtier siden. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: modelbygningsværktøjer til molekylær grafik. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60(punkt 12 punkt 1):2126-2132.

75. Adams PD, et al. PHENIX: et omfattende Python-baseret system til makromolekylær strukturløsning. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(pkt. 2):213–221.

76. Montiel-Garcia D, et al. Epitope-Analyzer: Et strukturbaseret webværktøj til at analysere bredt neutraliserende epitoper. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.