Liposom-baseret co-immunterapi med TLR-agonist og CD47-SIRP Checkpoint-blokade til effektiv behandling af tyktarmskræft

Abstrakt:

Antitumorimmunitet er en essentiel komponent i kræftbehandling og medieres primært af det medfødte immunrespons, som spiller en afgørende rolle i at initiere og forme det adaptive immunrespons. Nye beviser har identificeret medfødte immunkontrolpunkter og mønstergenkendelsesreceptorer, såsom CD47 og Toll-like receptor 7 (TLR7), som lovende terapeutiske mål for kræftbehandling. Baseret på fusionsproteinet Fc-CV1, som omfatter en SIRP-variant med høj affinitet (CV1), og Fc-fragmentet af det humane IgG1-antistof, udnyttede vi et præparat, der koblede Fc-CV1 til imiquimod (TLR7 agonist)-ladede liposomer ( CILP'er) for aktivt at målrette CT26. WT syngene colon tumormodeller. In vitro undersøgelser afslørede, at CILP'er udviste overlegne egenskaber ved langvarig frigivelse og celleoptagelseseffektivitet sammenlignet med fri imiquimod. In vivo viste assays, at CILP'er udviste mere effektiv akkumulering i tumorer og en mere signifikant tumorundertrykkelseseffekt end kontrolgrupperne. Dette immunterapipræparat havde fordelene ved lave doser og lav toksicitet. Disse resultater viste, at en kombination af immun checkpoint blokade (ICB) terapi og medfødte immunitet agonister, såsom Fc-CV1 og imiquimod-loaded liposom præparat anvendt i denne undersøgelse, kunne repræsentere en yderst effektiv strategi for tumorterapi.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

Nøgleord:

imiquimod; liposom; Fc-CV1; immunterapi; tyktarmskræft

1. Introduktion

Den globale forekomst af kræft fortsætter med at stige årligt, hvilket udgør en alvorlig trussel mod verdens befolknings sundhed og lægger en stor byrde på sundhedssystemerne. Ifølge en rapport fra Verdenssundhedsorganisationen skete der i 2020 19,29 millioner nye tilfælde af kræft og 9,96 millioner kræftdødsfald på verdensplan [1]. Men med den kontinuerlige fremgang inden for klinisk diagnose, kirurgi, strålebehandling og kemoterapi er den samlede overlevelse og livskvalitet for kræftpatienter forbedret betydeligt. Især immunterapi, som opstod med Coley-vaccinen i 1890'erne [2], går forud for både strålebehandling og kemoterapi og har gjort betydelige fremskridt i det sidste årti, til gavn for kræftpatienter.

Tumorimmunterapi er blevet anerkendt for sin fremragende biokompatibilitet og høje specificitet og er i stand til at inducere immunresponser for at eliminere tumorceller [3-5]. To hovedstrategier for tumorimmunterapi er immunforstærkning og immunnormalisering [6]. Mønstrene for immunforstærkning består hovedsageligt af cytokinterapi, tumorterapeutiske vacciner og monoklonale antistoffer. Toll-lignende receptorer (TLR'er) betragtes som potentielle mål for cancerimmunterapi på grund af deres rolle i aktiveringen af ​​det medfødte immunsystem. TLR-agonister er blevet udviklet som en immunadjuvans, og en række TLR-agonister gennemgår kliniske forsøg [7]. Monophosphoryl lipid A og imiquimod, TLR4 og TLR7 agonister, henholdsvis, har modtaget godkendelse fra Food and Drug Administration til klinisk anvendelse [7-9]. Imiquimod, en TLR7-agonist [9], aktiverer immunresponser og øger antitumoraktivitet ved at udløse TLR7 [10,11]. Immunnormaliseringsstrategien er repræsenteret af immun checkpoint blokade (ICB) lægemidler, som regulerer den defekte adaptive tumor immunrespons. Siden den første checkpoint-hæmmer, ipilimumab blev godkendt til klinisk anvendelse i USA i 2011, har immun-checkpoint-hæmmere, såsom PD1/PDL1-hæmmere, fået et gennembrud inden for cancerimmunterapi [12-14]. Bortset fra tilpassede immunkontrolpunkter, der ligner PD1/PDL1, har nogle medfødte immunkontrolpunkter, såsom SIRP-CD47, også tiltrukket sig meget opmærksomhed og blevet områder af betydelig interesse i udvikling af antistoflægemidler [15-17].

SIRP -CD47 kontrolpunktet blev først identificeret i 1999 [18,19]. SIRP er en CD47-receptor udtrykt i centralnervesystemets neuroner [20] og myeloidceller, herunder monocytter, makrofager, granulocytter og dendritiske celler. CD47 er et "selvmærkende molekyle" udtrykt på næsten alle normale celler og overudtrykt på de fleste tumorceller [21]. På overfladen af ​​tumorceller binder CD47 til SIRP, hvilket hæmmer makrofag-medieret fagocytose, som er et vigtigt middel til tumorimmunescape [22]. Det er blevet vist, at fagocytose af makrofager i tumormikromiljøet kan forstærkes, når bindingen af ​​CD47 og SIRP er blokeret [20-25]. Derfor er immun checkpoint-hæmmere, der blokerer CD47/SIRP-vejen, blevet udviklet og anvendt i cancerterapi [26].

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

I denne undersøgelse brugte vi en kombination af imiquimod og fusionsprotein (Fc-CV1) til behandling af tyktarmskræft. CV1 er et modificeret humant rekombinant SIRP-protein, der har en 50,000-fold højere affinitet for CD47 end det oprindelige protein [27]. Fc-CV1 blev konstrueret ved hjælp af "Knobs-into-holes"-teknologi, baseret på CV1-monomeren og Fc-fragmentet af humant IgG1. For at overvinde begrænsningerne af dårlig terapeutisk effekt og systemisk toksicitet forbundet med imiquimod [28,29], forberedte vi nanoliposomer gennem ethanolinjektionsmetoden. Nanoliposomerne har karakteristika af lav toksicitet i lægemiddellevering [30,31]. Efterfølgende blev imiquimod indkapslet i liposomer, som overfladekonjugerede Fc-CV1. Endelig kan dette nye nanopræparat aktivt levere TLR7-agonister til tumorvæv og har dobbelte funktioner som et ICB-lægemiddel og en TLR-agonist. Den blev brugt til at behandle CD47+ CT26.WT syngenisk colontumormodel [32].

2. Resultater og diskussion

2.1. Karakterisering af LP'er (Blank Liposomes), ILP'er (Non-CD47-Targeted Imiquimod-Encapsulated Liposomes), CLP'er (CD47 Targeted Liposomes) og CILP'er (Koblet Fc-CV1 til Imiquimod (TLR7 agonist)-loadede liposomer)

CILP'er blev med succes fremstillet ved ethanolinjektion og ammoniumsulfatgradientmetoden. Figur 1A viser synteseprocessen af ​​CILP'er. En TEM-analyse viste, at CILP'erne var sfæriske og ensartede i form (figur 1B). Ydermere afslørede DLS-resultatet, at partikelstørrelsen af ​​de fire liposomer var unimodal fordeling (figur 1C). Bindingshastigheden (BR) blev verificeret af SDS-PAGE, som er vist i figur 1D, E. Figur 1D viser molekylvægten af ​​Fc-CV1 og den relative båndlysstyrke af dialyserede og præ-dialyserede CILP'er. BR blev beregnet til at være 67,13 ± 37,10 % gennem Image J's scanning densitometri af elektroforetiske bånd (Figur 1E), hvilket giver mulighed for CD{14}}målretning mod tumorceller.

Figur 1. (A) Skematisk illustration af syntesen af ​​CILP'er. (B) TEM-billede af CILP'er

HPLC blev brugt til at detektere indkapslingseffektiviteten (EE) af imiquimod (Supplerende figur S1). Som vist i supplerende figur S1A viste den frie imiquimod en signifikant enkelt top, mens CLP'erne ikke viste nogen top under de samme testbetingelser (Supplerende figur S1B). Derfor er det muligt at detektere CILP'erne direkte under testbetingelserne. Som forventet blev detektionsværdierne af CILP'er før og efter dialyse betragtet som henholdsvis det samlede lægemiddelindhold og lægemiddelindholdet i liposomer (Supplerende figur S1C, D). EE for imiquimod blev beregnet til at være 85,44 ± 4,11%. Sammenlignet med det rapporterede passiv-loading-lægemiddelleveringssystem [33-35] opnåede denne undersøgelse højere indkapslingseffektivitet og en mere bekvem forberedelsesproces.

DLS viste, at diametrene af LP'er var 111.567 ± 0.655 nm, mens CLP'er, ILP'er og CILP'er viste en lidt større størrelse på 117.467 ± 0.34{{10} } nm, 120.233 ± 0.776 nm og 13{{30}}. 033 ± 0.974 nm, henholdsvis (tabel 1). Ændringerne i størrelsen af ​​disse liposomer kan tilskrives modifikationen af ​​Fc-CV1 og imiquimod. PDI var tæt på 0,1 (tabel 1), hvilket indikerer, at disse lægemiddelleveringsbærere var meget homogene i deres fordeling. Derudover blev zeta-potentiale værdier for LP'er, CLP'er, ILP'er og CILP'er målt til at være -2,231 ± 0,167 mV, −2,492 ± 0,033 mV, −2,383 ± 0,070 mV og ± 2,07 mV og ± 2,07 mV respektivt ± 2,07 mV. , hvilket tyder på, at den overfladekonjugerede Fc-CV1 og indkapslede imiquimod havde ringe effekt på ladningen af ​​liposomer.

Tabel 1. Diametrene, zeta-potentialet, PDI og EE for henholdsvis LP'er, CLP'er, ILP'er og CILP'er.

2.2. In vitro celleoptagelseseffektivitet

Celleoptagelseseffektiviteten af ​​CILP'er blev evalueret gennem fluorescensintensiteten af ​​Cy5 optaget af CT26.WT-celler under anvendelse af et højindholds-billeddannelsessystem. Som vist i figur 2, sammenlignet med frie Cy5- og ILP-Cy5-grupper, udviste CILPs-Cy5-grupper en stærkere celleoptagelseskapacitet efter 30 minutters inkubation. Disse resultater udledte, at Fc-CV1 forbedrede den intracellulære leveringsevne af imiquimod-ladede liposomer på grund af den specifikke affinitet til Fc-CV1-receptoren, hvilket førte til en mere potent antitumoreffekt.

Figur 2. Billederne af CT26.WT-celler efter inkubation med den frie Cy5, ILPs-Cy5 og CILPs-Cy5 (rød) i 0,5 timer og farvning med DAPI (blå). Målestok: 50 µm. (n {{10}}). * p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Frigivelseskurver af liposomer

Lægemiddelfrigivelseskurverne for de frie imiquimod, ILP'er og CILP'er blev målt i et simuleret in vivo-miljø. Figur 3 viser, at den frie imiquimod blev frigivet fuldstændigt efter 1 time, mens frigivelseshastigheden (RR) af imiquimod, der var indkapslet med ILP'er og CILP'er, kun var 54,75 ± 4.08 % og 39,70 ± 0,05 % efter 12 timer , henholdsvis. Desuden kunne den langsomme frigivelse af imiquimod i ILP'er og CILP'er lukkes med liposomernes kontrollerede lægemiddelfrigivelsesegenskaber. RR for imiquimod i ILP'er og CILP'er viste ingen signifikant forskel efter 96 timer, hvilket indikerer, at "post-insertion" udviste en ubetydelig indvirkning på membranstabiliteten af ​​liposomer.

figur 3. Imiquimod-frigivelseskurver for de frie imiquimod, ILP'er og CILP'er i PBS ved 37 ◦C. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Cytotoksicitetsundersøgelse

For at studere cytotoksiciteten af ​​CILP'er in vitro blev CCK{{0}}-assayet udført på CT26.WT-celler. Som vist i figur 4 udviste CILP'er i lave koncentrationer (0,1-1 µg/ml) ikke cytotoksicitet, hvilket er i overensstemmelse med sikkerheden ved immuniseringsterapi. Cellelevedygtighed var let nedsat efter 5 µg/ml imiquimod-behandling, sandsynligvis på grund af ROS og endoplasmatisk retikulum-medieret immunogen celledød induceret af imiquimod [36]. Desuden fører CILP'er til et signifikant fald i cellelevedygtighed sammenlignet med kontrolgrupper, hvilket tilskrives den synergistiske effekt af imiquimod og Fc-CV1.

Figur 4. Levedygtigheden af ​​cellerne behandlet med Fc-CV1, imiquimod, CLP'er, ILP'er og CILP'er i 24 timer. Koncentrationen af ​​Fc-CV1 og imiquimod var begge 0-10 µg/mL. * p < 0.05, ** p < 0.01, ns=ingen signifikante forskelle

2.5. Biodistributionsundersøgelse

Fordelingen og akkumuleringen af ​​forskellige formuleringer i tumorer og større organer påvirker direkte den terapeutiske effekt. Efter intravenøs administration blev fluorescenssignalerne overvåget ved hjælp af et nær-infrarødt vivisektionssystem for at vurdere fordelingen og akkumuleringen af ​​forskellige formuleringer i tumorer og større organer efter 24 timer. Som vist i figur 5 var den totale fluorescensintensitet af ILPs-Cy5 og CILPs-Cy5 højere end fri Cy5, hvilket indikerer, at liposomerne havde en langcirkulerende egenskab in vivo. Derudover var fluorescensintensiteten af ​​CILPs-Cy5-behandlingsgruppen den højeste i tumorvæv, hvilket kunne tilskrives den tumormålrettede virkning af Fc-CV1-ligander, hvorved antitumoreffekten blev forbedret. Påfaldende nok var fluorescensintensiteten af ​​lever og milte mere potent end andre organer, hvilket sandsynligvis skyldes fagocytose af liposomer af det retikuloendoteliale system (RES) i leveren og nyrerne [37].

Figur 5. Fordelingen af ​​Cy5-fluorescens i tumorer og større organer 24 timer efter intravenøs administration. Data vises som middel ± standardafvigelse (n=3). **** p < 0.0001

2.6. In vivo tumorhæmningsundersøgelse

Det terapeutiske skema (figur 6A) og virkningerne af forskellige præparater er vist i figur 6. Sammenlignet med PBS- og LP-grupperne udviste andre behandlingsgrupper visse tumor-suppressor-effekter. Navnlig var tumorvolumenet minimal efter behandling med CILP'er, hvilket tyder på, at CILP'er havde en fremragende tumorundertrykkende effekt (figur 6B).

Figur 6. (A) Skematisk illustration af behandling mod tyktarmskræft på CT26.WT-tumormodellen. (B) Vækstkurverne for tumorvolumen under behandlingsperioden. (C) Relative tumorfotografier og (D) vægt af tumoren indsamlet fra forskellige behandlingsgrupper på dag 17. (E) Det relative kropsvægtforhold mellem kropsvægten sammenlignet med 0 dag. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (n=5). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev musene aflivet, og deres tumorer blev skåret ud, fotograferet og vejet for at bestemme den terapeutiske effektivitet af forskellige præparater. Som vist i figur 6C, D havde behandlingsgruppen af ​​CILP'er de mindste og letteste tumorer sammenlignet med andre grupper, hvilket viser, at CILP'er havde de største tumorundertrykkende virkninger. Tabel 2 viser, at tumorvækstinhiberingsraten for CILP'er blev beregnet til at være 84,35%. Derudover var tumorundertrykkelsesraten på 84,35 % signifikant højere end for CLPs og ILPs grupperne, og det betyder, at der er en synergistisk effekt af blokeringen af ​​"spiser mig ikke"-aksen og aktiveringen af ​​immunresponset . Sammenlignet med det ækvivalente præparat in vitro (2,5-5 µg/ml) var den højere hæmningshastighed tæt forbundet med den for det formuleringsaktiverede immunrespons og blokerede immunflugtsmekanismen in vivo, som ikke var tilgængelig in vitro.

Tabel 2. Data for tumorvægt og tumorvækstinhibering (TGI) for forskellige behandlingsgrupper.

2.7. CILP'er øget T-celleinfiltration og sekretion af IFN

For at udforske tumorernes immuncellemiljø blev immuncellen induceret af CILP'er analyseret immunhistokemisk i slutningen af ​​antitumorassayet. CD4+- og CD8+-T-cellerne blev forøget i tumorsektionerne i CILPs-grupperne (figur 7). Samleveringen af ​​Fc-CV1 og imiquimod-terapi resulterede i signifikant CD4+ og CD8+ T-celleinfiltration. Derudover var der en signifikant IFN-sekretion i de tumorer, der undergik CILPs-behandling, hvilket skyldtes, at CILP'er udløste Toll-lignende receptor 7 og aktiverede immunresponset.

Figur 7. Immunhistokemi af musetumorvæv; positive celler farves brune. Målestok, 50 µm (n=5).

2.8. Biosikkerhedsvurdering af CILP'er

Biosikkerheden af ​​CILPs-medieret terapi var også et vigtigt indeks med hensyn til adgang til den terapeutiske evaluering. Under tumorhæmningsundersøgelsen in vivo inducerede CILP'er ikke signifikant vægttab i behandlingsperioden (figur 6D). De biokemiske parametre for leveren og nyrerne var alle i det normale område ifølge standardreferenceområdet for mus (tabel 3), og organhistologien viste ingen signifikante ændringer, hvilket indikerer, at CILP'erne havde fremragende biosikkerhed (figur 8). Disse resultater er afgørende for vurderingen af ​​potentialet af CILP'er som et sikkert og effektivt immunterapeutisk middel til cancerbehandling.

Tabel 3. De biokemiske parametre for lever og nyre

Figur 8. H&E (hæmatoxylin og eosin) farvning af hovedorganerne. Målestok, 50 µm (n=3)

3. Materialer og metoder

3.1. Materialer

Imiquimod blev købt fra MedChem Express (Shanghai, Kina). Fc-CV1 blev leveret af State Key Laboratory of Antibody Drugs and Targeted Therapy. Kolesterol, hydrogeneret lecithin (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS og DSPE-PEGCy5 blev købt fra Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Kina). 40,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) blev opnået fra Keygen Biotech (Nanjing, Kina). Ammoniumsulfat blev opnået fra Sinopharm (Shanghai, Kina). Methanol (kromatografisk kvalitet) og acetonitril (kromatografisk kvalitet) blev købt fra Aladdin Reagent Company (Shanghai, Kina). De andre reagenser er alle af national analytisk kvalitet. Muse tyktarmskræftcellelinje CT26. WT blev leveret af Cell Bank of the Chinese Academy of Science. Cellerne blev dyrket i en celleinkubator i RPMI 1640-mediet indeholdende 10 % FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) ved 5 % CO2 og 95 % luft. BALB/c hunmus på 4-6 uger blev leveret af Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Kina).

3.2. Fremstilling af tomme liposomer

Først blev 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000 og 4,7095 mg kolesterol præcist vejet og opløst i 0,1 ml ethanol (HSPC: DSPE-PEG2000:cholesterol.5:12} 5,05:39,3 molforhold). For det andet blev ethanolopløsningen hurtigt injiceret i en forvarmet ammoniumsulfatopløsning (250 mM, 1 ml, 65 ◦C) via en sprøjte og derefter inkuberet i 30 minutter ved 65 ◦C under magnetisk omrøring. Efterfølgende blev den fremstillede opløsning successivt ekstruderet gennem polycarbonatmembranerne (Avanti, Alabaster, AL, USA); størrelsen var henholdsvis 200 nm, 100 nm og 50 nm. Endelig var den resulterende opløsning blindliposomer (LP'er) med en lipidkoncentration på 22,5 mg/ml.

3.3. Fremstilling af CD47-målrettede Imiquimod-indkapslede liposomer

Først blev DSPE-PEG2000-NHS opløst i ddH2O (60 ◦C) og derefter blandet med Fc-CV1 og inkuberet i et rystebord ved stuetemperatur i 5 timer (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 molforhold). Den kemiske reaktionsmekanisme i forbindelsen mellem Fc-CV1 og DSPE-PEG2000-NHS involverede, at NHS-esteren reagerede med den primære amin på Fc-CV1 og dannede et tabel-aminbindingskonjugat. Den forberedte opløsning blev proportionelt blandet med LP'er og inkuberet ved 60 ◦C i 1 time for at indsætte Fc-CV1 i liposomer, som blev kaldt "post-insertion" [38]. Blandingsforholdet var, at 2,25 mg Fc-CV1 blev modificeret pr. 22,5 mg liposomer. De CD47-målrettede liposomer (CLP'er) blev derefter opnået.

Efterfølgende blev CLP'er anbragt i en dialysepose (300 kDa) og dialyseret mod HEPES (10 mM, pH=7.4) i 1 time for at fjerne ammoniumsulfat og resterende Fc-CV1 i den ydre vandige fase. De dialyserede CLP'er blev inkuberet med imiquimod-opløsning (5 mg/ml) i et forhold på 1 mg til 7 µmol totale phospholipider ved stuetemperatur i 24 timer og derefter dialyseret mod PBS (300 kDa) tre gange for at eliminere uindkapslet imiquimod, som refererede til ammoniumsulfatgradientteknikken [39]. CILP'erne blev derefter opnået. Derudover blev de ikke-CD47-målrettede imiquimod-indkapslede liposomer (ILP'er) fremstillet. CLP'er og ILP'er blev betragtet som kontrollen for CILP'er.

3.4. Karakterisering

Morfologien af ​​disse liposomer blev fotograferet med et transmissionselektronmikroskop (TEM, Joel, Tokyo, Japan). Størrelsen, zeta-potentialet og polymerdispersitetsindekset (PDI) af disse liposomer blev bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS) og elektroforetisk lysspredning (ELS) under anvendelse af Malverns Zeta sizer ZSE (Malvern, UK). Bindingshastigheden (BR) af Fc-CV1 indsat i liposomer blev målt ved 15% natriumlaurylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Image J-software (Bethesda, MD, USA). Indkapslingseffektiviteten (EE) af imiquimod blev påvist ved højtydende væskekromatografi (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA).

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

3.5. In vitro celleoptagelsesundersøgelse

In vitro-celleoptagelsen af ​​disse liposomer blev bestemt af den kumulative fluorescensintensitet af Cy5 i CT26. WT-celler. DSPE-PEG-Cy5 blev inkuberet med CILP'er og ILP'er (DSPE-PEG-Cy5: CILP'er eller ILP'er=1:5 masseforhold) ved 6 0 ◦C i henholdsvis 1 time og derefter fluorescerende liposomer navngivet som CILPs-Cy5 og ILPs-Cy5 blev opnået. CT26.WT-celler blev podet i 96-brøndsplader og tilfældigt opdelt i tre grupper (1 × 104 celler/brønd, n=3). Efter at cellesammenflydningen nåede 50-70 %, blev hver gruppe inkuberet med henholdsvis fri Cy5, ILPs-Cy5 og CILPs-Cy5 i 30 minutter ved 37 ◦C, hvor de endelige koncentrationer af Cy5 var 1 µg/ml i 0,1 ml RPMI 1640 medium. Efterfølgende blev cellerne immobiliseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter efter at være blevet vasket to gange med PBS og derefter farvet med 10 µL DAPI (1 µg/µL) i 10 minutter efter at være blevet vasket to gange med PBS. Endelig blev optagelsen af ​​hver gruppe af celler registreret af et højindholds-billeddannelsessystem (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) efter vask to gange med PBS.

3.6. Imiquimod-udgivelsesundersøgelsen

Frigivelseskurverne for forskellige lægemiddelfyldte liposomer blev udført ved hjælp af dialysemetoden (300 kDa), og resultaterne blev sammenlignet med den frie imiquimod-opløsning. Kort fortalt blev 0,6 ml ILP'er, CILP'er og imiquimod-opløsningen pakket separat i dialyseposerne og derefter anbragt i 500 ml PBS-opløsning (pH=7,4, 37 ◦C). Lige store mængder prøver blev ekstraheret fra poserne med forudbestemte tidsintervaller (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 og 96 timer) og frigivelseshastigheden (RR) af imiquimod blev beregnet ved hjælp af følgende ligning:

hvor Sund og Sd repræsenterede HPLC-toparealet af imiquimoden i henholdsvis præ-dialyserede og dialyserede præparater på forskellige tidspunkter (n=3).

3.7. Cytotoksiciteten af ​​CILP'er

CT{{0}}.WT-celler blev podet i en 96-brøndsplade (1 × 104/brønd, n=3) og dyrket i 100 µL RPMI 1640-medium indtil sammenflydningen nåede tæt på 70 %. For at bestemme cytotoksiciteten af ​​CILP'er blev RPMI 1640-mediet fjernet fra hver brønd og erstattet med en kompleks opløsning af CILP'er og RPMI 1640-medium med koncentrationer af Fc-CV1 og imiquimod i området fra 0 til 10 µg/ml. Cellerne blev inkuberet med en kompleks opløsning i 24 timer. Derudover blev cellerne, der blev behandlet med Fc-CV1, CLP'er, imiquimod-opløsning og ILP'er i en lignende koncentration, betragtet som kontrolgrupper. De overlevende celler blev påvist med et CCK-8-assay efter 24 timer, og levedygtigheden af ​​de ubehandlede celler blev betragtet som 100 %.

3.8. Biodistributionsundersøgelse

Ni BALB/c hunmus blev injiceret subkutant med CT26. WT-celler (5 × 105) i højre flanke og disse tumorbærende mus blev tilfældigt opdelt i tre grupper (n=3). Tumorvolumener blev målt ved hjælp af skydelære og blev beregnet ved følgende formel:

Da tumorvolumenet nåede 100 mm3, blev fri Cy5, ILP-Cy5 og CILPs-Cy5 injiceret intravenøst ​​i en dosis på Cy5 på 0,4 mg/kg. Fireogtyve timer efter intravenøs injektion blev tumor, hjerte, lever, milt, lunge og nyre taget ud. Tumorernes og hovedorganernes fluorescenssignaler blev detekteret af det optiske billeddannelsessystem IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. In vivo tumorhæmningsundersøgelse

Femogtredive hun BALB/c mus blev tilfældigt opdelt i syv grupper (n=5) og 5 × 105 CT26. WT-celler blev injiceret subkutant i højre flanke af hver mus. Når musetumorstørrelsen var ca. 100 mm3, blev behandlingen påbegyndt. PBS, LP'er, imiquimod, Fc-CV1, ILP'er, CLP'er og CILP'er blev injiceret intravenøst ​​på dag 0, 4, 8 og 12. Dosis af imiquimod var 2,5 mg/kg i den første og anden injektion og 5 mg/kg i den tredje og fjerde injektion. I alle injektioner var dosis af Fc-CV1 5 mg/kg. Ved denne dosis var lægemiddelkoncentrationen i kroppen 2,5-5 µg/mL, hvilket udøvede cytotoksicitet på celler i et in vitro-eksperiment. Tumordiametre og kropsvægt blev målt hver dag under behandlingen. På dag 17 blev musenes tumorer taget ud, og deres vægte blev målt. Tumorvækstinhibering (TGI) blev beregnet i henhold til følgende formel:

3.10. Immunhistokemi

Immunhistokemi-farvning af CD4, CD8 og IFN blev udført i tumorvæv i henhold til en standardprotokol. Efter afparaffinisering og rehydrering af paraffinsektionen af ​​sektionerne af tumorvæv blev 3% BSA tilsat til cirklen for at dække vævet, og det blev derefter forseglet i 30 minutter ved stuetemperatur. Sektionerne blev farvet med CD4-, CD8- og IFN-antistofferne (Servicebio, Wuhan, Kina) natten over ved 4 ◦C og derefter inkuberet med et sekundært antistof (HRP-mærket, Servicebio, Wuhan, Kina) ved stuetemperatur i 50 min. efter to vaske med PBS. Til sidst blev snittene visualiseret under mikroskopet (Nikon, E100, Tokyo, Japan) efter at have reageret med det DAB-kromogene middel.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

3.11. Biosikkerhedsvurdering af CILP'er

Ved afslutningen af ​​tumorhæmningsundersøgelsen blev alle tumorerne opsamlet, og vægten af ​​disse tumorer blev målt. De biokemiske parametre, herunder alanintransaminase (ALT), aspartattransaminase (AST), kreatinin (CREA) og urinstof (UREA), blev påvist i blodet hos mus. Frisk tumorvæv og større organer blev fikseret med 4% paraformaldehyd og indlejret i paraffin ved hjælp af en indlejringsmaskine (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Kina). Vævsskiver med en tykkelse på 5 µm blev skåret gennem mikrotomen (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, Kina) og derefter farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E) i henhold til protokollen. Efterfølgende blev farvningsskiverne observeret under et mikroskop (Nikon, E100, Tokyo, Japan).

3.12. Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middelværdi ± SD. Signifikansniveauet mellem grupper blev testet ved envejs ANOVA ved hjælp af Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 blev defineret som en signifikant forskel.

3.13. Dyreetik

Alle procedurer og anbefalinger vedrørende dyr blev godkendt af den særlige komité for videnskabelig forskningsetik ved Liaocheng University efter de nationale retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr (godkendelseskode: 2022111010; godkendelsesdato: 1. november 2022).

cistanche planteforøgende immunsystem

4 konklusioner

Sammenfattende blev imiquimod-indkapslede CD47-målrettede liposomer udviklet med succes, og in vitro-resultaterne viste, at CILP'erne havde en bedre vedvarende frigivelse og specifik målretningseffekt. In vivo-resultaterne viste, at præparatet effektivt kunne optages af tumorceller, og at det udviste fremragende tumorbehandlingseffektivitet og biosikkerhed på grund af den dobbelte funktion af immunrespons og den medfødte immunkontrolpunktblokade. Derfor ser imiquimod-indkapslede liposomer koblet til Fc-CV1 ud til at være lovende ny nanomedicin til at forbedre CD47-ekspression tumorbehandling. Immunterapi baseret på medfødt immunitet kan tjene som en generel strategi mod tumorvækst for synergistiske kombinationer med ICB i fremtiden.

Referencer

1. Sung, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, I.; Jemal, A.; Bray, F. Global Cancer Statistics 2020: Globocan-estimater af forekomst og dødelighed på verdensplan for 36 kræftsygdomme i 185 lande. CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209-249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: Fra Coleys til moderne kræftimmunterapi. Toxins 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, RR Immunterapier og kombinationsstrategier for immunonkologi. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5009. [CrossRef]

4. Hegde, PS; Chen, DS Top 10 udfordringer i kræftimmunterapi. Immunitet 2020, 52, 17-35. [CrossRef]

5. Jain, KK Personlig immuno-onkologi. Med. Princ. øv. 2021, 30, 1-16. [CrossRef]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Et paradigmeskifte i kræftimmunterapi: Fra forbedring til normalisering. Celle 2018, 175, 313-326. [CrossRef]

7. Hussein, WM; Liu, TY; Swarczynski, M.; Toth, I. Toll-Like Receptor Agonists: A Patent Review (2011-2013). Ekspert udtalelse. Ther. Klappe. 2014, 24, 453-470. [CrossRef]

8. Chi, H.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Antitumoraktivitet af afgiftslignende receptor 7-agonister. Foran. Pharmacol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Wang, Y.; Zhang, S.; Li, H.; Wang, H.; Zhang, T.; Hutchinson, MR; Yin, H.; Wang, X. Småmolekylemodulatorer af vejafgiftslignende receptorer. Acc. Chem. Res. 2020, 53, 1046-1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirak, V.; Gobert, M.; Durand, I.; Dubois, B.; Treilleux, I.; Marvel, J.; Vlach, J.; et al. Tumorfremme ved intratumorale plasmacytoide dendritiske celler vendes ved Tlr7-ligandbehandling. Cancer Res. 2013, 73, 4629-4640. [CrossRef]

11. Ma, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Tlr7-agonisterne Imiquimod og Gardiquimod forbedrer DC-baseret immunterapi for melanom hos mus. Celle. Mol. Immunol. 2010, 7, 381-388. [CrossRef]

12. Billan, S.; Kaidar-Person, O.; Gil, Z. Behandling efter fremskridt i immunterapiens æra. Lancet Oncol. 2020, 21, e463-e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Immune Checkpoint-hæmmere: Nylige fremskridt og potentielle biomarkører. Exp. Mol. Med. 2018, 50, 1-11. [CrossRef] [PubMed]

14. Li, B.; Chan, HL; Chen, P. Immune Checkpoint-hæmmere: Grundlæggende og udfordringer. Curr. Med. Chem. 2019, 26, 3009-3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Jia, X.; Yan, B.; Tian, ​​X.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway medierer kræftimmunflugt og immunterapi. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 3281-3287. [CrossRef]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Løftet om makrofagstyrede checkpoint-hæmmere i myeloid malignitet. Bedste praksis og forskning. Clin. Hæmatol. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, WA Medfødte immunkontrolpunkthæmmere: Det næste gennembrud inden for medicinsk onkologi? Mol. Kræft Ther. 2021, 20, 961-974. [CrossRef]

18. Jiang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Integrin-associeret protein er en ligand for P84 neurale adhæsionsmolekyle. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559-562. [CrossRef]

19. Seiffert, M.; Cant, C.; Chen, Z.; Rappold, I.; Brugger, W.; Kanz, L.; Brown, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ Humant signalregulerende protein udtrykkes på normalt, men ikke på undergrupper af leukæmiske myeloidceller og medierer cellulær adhæsion, der involverer dets modreceptor Cd47. Blood 1999, 94, 3633-3643. [CrossRef]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK The Cd47-Sirpalpha Signaling Axis as an medfødt immun checkpoint i kræft. Immunol. Rev. 2017, 276, 145-164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Zheleznyak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Rolle af Cd47 som en markør for selv på røde blodlegemer. Science 2000, 288, 2051-2054. [CrossRef]

22. Li, Z.; Li, Y.; Gao, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Cai, M.; Wang, H.; Tong, T. Rollen af ​​Cd47-Sirpalpha Immune Checkpoint i Tumor Immune Evasion og medfødt immunterapi. Life Sci. 2021, 273, 119150. [CrossRef]

23. Hayat, SMG; Bianconi, V.; Pirro, M.; Jaafari, MR; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Rolle i immunsystemet og anvendelse til kræftterapi. Celle. Oncol. 2020, 43, 19-30. [CrossRef]

24. Huang, Y.; Kan.; Gao, P.; Yao, Z. Targeting Cd47: Præstationerne og bekymringerne ved nuværende undersøgelser om kræftimmunterapi. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168-E174. [CrossRef]

25. Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Fremskridt i antitumorbehandlinger rettet mod Cd47/Sirpalpha-aksen. Foran. Immunol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Liu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Cd47-blokade udløser T-celle-medieret ødelæggelse af immunogene tumorer. Nat. Med. 2015, 21, 1209-1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; Ring, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, AM; Volkmer, AK; Ozkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; et al. Konstrueret Sirpalpha-varianter som immunterapeutiske adjuvanser til anticancer-antistoffer. Science 2013, 341, 88-91. [CrossRef]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, JR Topisk Imiquimod har terapeutiske og immunmodulerende virkninger mod intrakranielle tumorer. J. Immunother. 2011, 34, 264-269. [CrossRef]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. En gennemgang af Imiquimod-terapi og diskussion om optimal behandling af basalcellekarcinomer. Clin. Narkotikaundersøgelse. 2018, 38, 883-899. [CrossRef]

30. Liu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Målrettet Liposomal Drug Delivery: A Nanoscience and Biophysical Perspective. Horiz i nanoskala. 2021, 6, 78-94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, MR Nanofarmaceutiske lægemidler og nanomedicin i øjeblikket på markedet: udfordringer og muligheder. Nanomedicin 2019, 14, 93-126. [CrossRef]

32. Zhou, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, Q.; Sun, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; et al. Repositionering af azelnidipin som en dobbelthæmmer rettet mod Cd47/Sirpalpha og Tigit/Pvr-veje til cancerimmunterapi. Biomolecules 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ni, K.; Luo, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Jiang, X.; Lin, W. Nanoscale Metal-Organic Framework co-leverer Tlr-7 agonister og anti-Cd47 antistoffer til at modulere makrofager og orkestrere kræftimmunterapi. J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 12579-12584. [CrossRef]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Fototermisk terapi med immunadjuverende nanopartikler sammen med kontrolpunktblokade for effektiv kræftimmunterapi. Nat. Commun. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Long, Y.; Guo, R.; Liu, X.; Tang, X.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Z.; Li, M.; He, Q. Multifunktionel polymer micelle-baseret kemo-immunoterapi med immunkontrolpunktblokade til effektiv behandling af ortotopisk og metastatisk brystkræft. Acta Pharm. Synd. B 2019, 9, 819-831. [CrossRef]

36. Huang, SW; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; et al. Imiquimod udøver antitumoreffekter ved at inducere immunogen celledød og forstærkes af den glykolytiske inhibitor 2-deoxyglucose. J. Investig. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. Wang, B.; Han, X.; Zhang, Z.; Zhao, Y.; Feng, W. Metabolisme af nanomaterialer in vivo: blodcirkulation og organrensning. Acc. Chem. Res. 2013, 46, 761-769. [CrossRef]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, MR-målretning, biodistributiv og tumorvækstinhiberende karakterisering af anti-Her2 affibody-kobling til liposomalt doxorubicin ved brug af Balb/C-mus, der bærer tubotumorer. Int. J. Pharm. 2016, 505, 89-95. [CrossRef]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Liposomforberedelse og størrelseskarakterisering. Metoder Enzymol. 1989, 171, 193-217. [PubMed]