Enkeltcellet transkriptomik afslører forstyrret nyrefilter celle-celle-interaktioner efter tidlig og selektiv podocytskade
Jul 02, 2024
Resultater
Single-Cell Profiling of >29,000 Glomerulært berigede nyreceller
Nuværende enkeltcelle protokoller tilidentificere hele nyren<2.5% glomerular cells,9 and although a oprenset glomerulær præparatved at bruge magnetiske perler beriger denne befolkningsgruppe,22 formår den ikke at fange andre cellertyper af nyreder kan være af interesse. En sigtemetode blev brugt til samtidig at berige glomeruli og indfange yderligere nyrecelletyper for at udvide disse fund og udvikle en detaljeret forståelse af celle-celle-interaktioner i glomerulus i sammenhæng med hele det cellulære landskab i nyren, før og efter podocytskade.
For at identificere de tidlige transkriptionelle virkninger af podocytablation på en celletypespecifik måde blev scRNAseq udført mednyrevævfra WT og iCTCFpod / mus opsamlet ved seriel sigtning efter 1 uges doxycyclinbehandling (figur 1A). Nyrevæv fra fire WT-dyr (fire biologiske replikater) og fire iCTCFpod/dyr gav i alt 14.783 WT og 14.727 iCTCFpod/celler profileret efter filtrering (Supplerende figur S1, A og B; Supplerende tabeller S1 og S2). Data blev normaliseret for at fjerne effekter på grund af antallet af UMI'er og procentdelen af mitokondrieaflæsninger. Efter integration af WT og iCTCFpod / prøver blev en lav opløsning af clustering brugt til at detektere ni klynger (figur 1B). Biologiske replikater af WT og iCTCFpod / prøver blev fordelt blandt alle klynger (Supplerende figur S2, AC). Alle celletyper af glomerulus, såvel som yderligere nyrecelletyper, blev identificeret ved hjælp af etablerede og data-afledte markører (figur 1C; Supplerende Tabel S3; Supplerende Figur S3A).
Glomerulære celler, der repræsenterer i alt 82,1% af alle genvundne celler [36,9% podocytter, 42,1% glomerulære endotelceller (GEC'er), 2,7% mesangiale celler og 0.36% PEC'er] blev isoleret og samlet (Figur 1D) . Fire klynger af podocytter, fem klynger af GEC'er og en klynge hver af mesangiale celler og PEC'er, der udtrykker kanoniske celletypemarkører, blev identificeret (figur 1E; Supplerende figur S3B). Biologiske replikater af WT og iCTCFpod / prøver blev fordelt over alle klynger (Supplerende Figur S2, DF; Supplerende Tabel S4). Som forventet indeholdt 13 iCTCFpod/prøver en lavere procentdel af podocytter end WT-prøver (figur 1F; Supplerende tabel S5), da podocytspecifik CTCF-deletion fører til histologisk påviselig podocyttab efter 2 uger. iCTCFpod / prøver havde 13,1 % færre podo-cytter, 11,9 % flere GEC'er og 1,5 % flere mesangiale celler end WT-prøver (Supplerende tabel S5). PEC'er bidrog<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.
Podocyt-specifik inducerbar CTCF-deletion fører til ændringer i genekspression i alle glomerulære celletyper
Differentiel ekspressionsanalyse blev udført i hver af 11 klynger, der sammenlignede iCTCFpod / og WT-celler (Supplerende tabel S6). Gener blev betragtet som differentielt udtrykt, hvis de blev fundet i mindst 10% af cellerne i en given klynge, med en minimums absolut log-fold-ændring på 0.1 og en justeret P < 0. 05. Ctcf blev differentielt udtrykt i hver af de fire podocytklynger med gennemsnitlige log-foldændringer på henholdsvis 0.390, 0.189, 0.331 og 0.303. Antallet af celler i hver klynge blev nedprøvet, og den differentielle ekspressionsanalyse blev gentaget for at sammenligne antallet af differentielt udtrykte gener blandt de 11 klynger. Podocytklyngerne havde de mest differentielt udtrykte gener, efterfulgt af GEC-1 og GEC-2 (figur 1G). De resterende tre klynger af GEC'er, sammen med de mesangiale celler og PEC'er, havde langt færre differentielt udtrykte gener (figur 1G), hvilket tyder på, at GEC-1 og GEC-2 blandt alle glomerulære klynger var mest påvirket af følgevirkningerne af CTCF-deletionsdrevet podocytskade.
Sygdomsassocierede genprogrammer identificeret i specifikke podocyt- og endotelcelleklynger
Denne undersøgelse søgte først at undersøge, hvordan de individuelle podocytklynger reagerer på skade. Et Venn-diagram af de differentielt udtrykte gener i hver af de fire podocytklynger afslørede, at podocyt 1 havde de mest unikt differentielt udtrykte gener af de fire podocytklynger (figur 2A; Supplerende tabel S7). Observationen af, at en af fire podocytklynger var mere fremtrædende påvirket, er i overensstemmelse med tidligere histologiske data, der indikerer, at ikke alle podocytter er påvirket med samme alvorlighed i lyset af skader og fremhæver styrken af scRNAseq til molekylært at karakterisere heterogeniteten af celletilstande inden for samme celletype.23
En overrepræsentationsanalyse blev udført for at identificere genprogrammer beriget som en konsekvens af CTCF-tab i podocyt 1-klyngen (Supplerende tabel S8). De øverste berigede udtryk blev visualiseret med et berigelseskort for at klynge gensidigt overlappende gensæt (figur 2B). En fremtrædende gruppe af berigede udtryk var mitokondrielle funktioner, herunder ATP-syntese, mitokondriel organisering, elektrontransportkæde og oxidativ fosforylering (figur 2B). Disse data udvider det seneste arbejde, der peger på mitokondriel dysfunktion som et tegn på podocytskade.24 Derudover har human genetik peget på vigtigheden af mitokondrielle funktioner i podocytter, herunder adskillige mutationer i CoQ biosyntesevejen (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, og ADCK4), der forårsager nefrotisk syndrom, hovedsageligt hos børn.25,26 Det er derfor blevet postuleret, at podocyt-mitokondriel dysfunktion kan repræsentere en fremtrædende celletilstand, der er forbundet med alle sygdomme, der stammer fra podocyttab.24 Dataene giver støtte til denne opfattelse ved enkeltstående -celleopløsning, hvilket tyder på, at mitokondriel dysfunktion kan repræsentere den tidligste skadestilstand i en specifik population af podocytter, hvilket fører til podocyttab.
En overrepræsentationsanalyse blev udført for at identificere genprogrammer beriget som en konsekvens af CTCF-tab i podocyt 1-klyngen (Supplerende tabel S8). De øverste berigede udtryk blev visualiseret med et berigelseskort for at klynge gensidigt overlappende gensæt (figur 2B). En fremtrædende gruppe af berigede udtryk var mitokondrielle funktioner, herunder ATP-syntese, mitokondriel organisering, elektrontransportkæde og oxidativ fosforylering (figur 2B). Disse data udvider det seneste arbejde, der peger på mitokondriel dysfunktion som et tegn på podocytskade.24 Derudover har human genetik peget på vigtigheden af mitokondrielle funktioner i podocytter, herunder adskillige mutationer i CoQ biosyntesevejen (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, og ADCK4), der forårsager nefrotisk syndrom, hovedsageligt hos børn.25,26 Det er derfor blevet postuleret, at podocyt-mitokondriel dysfunktion kan repræsentere en fremtrædende celletilstand, der er forbundet med alle sygdomme, der stammer fra podocyttab.24 Dataene giver støtte til denne opfattelse ved enkeltstående -celleopløsning, hvilket tyder på, at mitokondriel dysfunktion kan repræsentere den tidligste skadestilstand i en specifik population af podocytter, hvilket fører til podocyttab.
En af hovedgrupperne af berigede udtryk fra overrepræsentationsanalysen (figur 2B) var cytoskeletorganisation samt en relateret enkelt beriget term for celle-matrix-adhæsion. Actincytoskelettet spiller en væsentlig rolle i at opretholde podocytternes unikke og komplekse struktur, og adhæsion til GBM er afgørende for podocytfunktionen.27 Modne fokale adhæsioner indeholder hundredvis af proteiner, der forbinder actincytoskelettet, receptormatrixbinding, intracellulær signaltransduktion og actinpolymerisation. Et af de mest nedregulerede gener i podocyt 1 var Rhpn1 (supplerende figur S4A), en essentiel komponent til etablering af podocytcytoskeletdynamik og opretholdelse af podocytfodprocesarkitektur.28 Arp2/3-komplekskomponenten Arpc3, en driver bag actinpolymerisering, var opreguleret i podocyt 1-klyngen (figur 2C; Supplerende figur S4B). Et gen for en yderligere komponent af komplekset, Actr2, blev også opreguleret i både podocyt 1 og podocyt 4. Derudover aktiverer Wasl, hvis proteinprodukt, N-WASP, Arp2/3-komplekset og er påkrævet til vedligeholdelsen af podocytfodprocesser in vivo29, blev også opreguleret i podocyte 1, podocyte 3 og podocyte 4. Cytoskeletregulatoren Arhgdia, hvis deletion er forbundet med nefrotisk syndrom hos mus,30 blev nedreguleret i podocyte 1 (figur 2C). Ekspressionsniveauerne af to Rho GTPaser
Figur 3 Podocytklynge opregulerer Col4a5. A: Col4a5 var signifikant opreguleret i inducerbare podocytspecifikke CTCF-deletion (iCTCFpod / ) podocyte 1-celler sammenlignet med vildtype (WT) podocyte 1-celler. Kollagen type IV ɑ5 (COL4A5) receptorer blev stærkt udtrykt i mesangiale celler og glomerulære endotelcelle (GEC) subclusters 1 til 4. Størrelsen af pilespidsen repræsenterer den relative ekspression af receptoren. B: Kvantificering af hybridiseringskædereaktion (HCR). Col4a5 var signifikant opreguleret i iCTCFpod/Nphs2-udtrykkende celler sammenlignet med WT Nphs{{20}}udtrykkende celler. Fire WT og fire iCTCFpod/mus blev evalueret. Alle glomeruli fra tre billeder blev kvantificeret. C: Col4a5-ekspression i glomeruli af WT og iCTCFpod/dyr som evalueret af HCR. *P < 0,0001 (tosidet t-test med Welch-korrektion). Original forstørrelse, 40; 63 (forstørrelser af indrammede områder) (C). Skala stænger Z 50 mm (C). IFI, immunfluorescerende billeddannelse.
GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 unikt differentielt udtrykte gener (Supplerende figur S6A; Supplerende tabel S9). Overrepræsentationsanalyse indikerede, at de unikt differentielt udtrykte gener i GEC -1 blev beriget i genprogrammer for cellemigration og adhæsion (Supplerende figur S6, B og C; Supplerende tabel S10). Disse analyser afslørede de tidligste transkriptionelle ændringer, der forekommer i GEC'er som et svar på podocytskade.
Modellering af intercellulær kommunikation afslører nøgleinteraktioner mellem celletyper som reaktion på tidlig podocytskade
Efter at have identificeret forstyrrede genprogrammer i flere forskellige celleklynger, forsøgte undersøgelsen derefter at forstå, hvordan glomerulær celle-celle-krydstale blev påvirket af podocyt-skade. Undersøgelsen undersøgte først listen over differentielt udtrykte gener i podocyt-, GEC- og mesangiale celleklynger. Ekspressionen af to centrale autokrine prosurvival-ligander, Vegfa og Pdgfb, såvel som ekspressionen af PDGFB-receptoren, Pdgfrb, blev forstyrret (Supplerende tabel S6). Vegfa-ekspression blev reduceret i alle podocytklynger (gennemsnitlig log-foldændring mellem 0.034 og 0.149). I modsætning hertil blev Pdgfb-ekspression øget i alle GEC-klynger (gennemsnitlig log-fold ændring mellem 0.031 og 0,140), og receptoren Pdgfrb blev opreguleret i mesangiale celler (gennemsnitlig log-fold ændring på 0,155). Denne analyse antydede, at podocytskade fører til nedsat ekspression af prosurvival-liganden Vegfa, hvilket påvirker GEC'er negativt. For at kompensere kan GEC'er opregulere prosurvival-liganden Pdgfb, hvilket udløser mesangiale celler til at opregulere receptoren Pdgfrb.
NicheNet, en ny algoritme, der udleder, hvordan ligand-receptor-interaktioner afledt af ekspressionsdata kan påvirke specifikke mål ved at integrere allerede eksisterende viden om signal- og regulatoriske netværk, blev brugt til mere dybtgående undersøgelse af ligand-receptor-interaktioner og deres formodede målgener.20 NicheNet blev anvendt til at model i interaktioner mellem podocytter og GEC'er såvel som mesangiale celler og GEC'er, der potentielt kunne inducere differentielt udtrykte gener (målgener) i GEC'er i omgivelserne af podocytskade (figur 4A). Til denne analyse blev alle klynger af hver celletype kombineret til en enkelt klynge. De mest forudsagte ligander udtrykt af mesangiale celler og/eller podocytter var pleiotrophin (Ptn), angiopoietin 2 (Angpt2), Col4a1, vaskulær celleadhæsionsmolekyle 1, knoglemorfogenetisk protein 4 (Bmp4), Ephrin B1, bindevævsvækstfaktor og semaforering 3e (Sema3e) (figur 4B). Ekspressionsmønsteret af GEC-receptorer, hvorigennem disse ligander vides at virke, blev kortlagt ved siden af ligandaktivitetsanalysen. Derudover blev de forudsagte målgener, der var differentielt udtrykt i iCTCFpod / GEC'er sammenlignet med WT-kontroller, også kortlagt. Resultaterne i figur 4B er opsummeret som cirkulære plots i figur 4, C og D.
Adskillige ligander, receptorer og målgener var bemærkelsesværdige fra denne analyse. Pleiotrophin, en ligand, der er stærkt udtrykt i mesangiale celler (figur 4B), er en udskilt vækstfaktor, der kan binde og hæmme proteintyrosinphosphatase-receptor type B, hvilket stimulerer endotelcellemigration via øget Tek (Tie2)/Angpt137 og Kdr (Vegfr2)/Vegfa38 signalering. Følgelig blev Tek signifikant opreguleret i GEC'er (figur 4B). Angpt2, stærkt udtrykt i mesangiale celler, er en antagonistisk ligand af Tek, der hæmmer bindingen af Angpt1.39 Fordi Angpt1-signalering er kendt for at fremme podocytoverlevelse, og en forstyrrelse af Angpt1/Angpt2-forholdet bidrager til udviklingen af DKD,40, denne ligand receptoranalyse så ud til at pege på maladaptiv Tek-signalering i GEC'er som en af de tidligste konsekvenser af podocytskade
Denne undersøgelse fandt også fremtrædende ændringer i type IV kollagenekspression i flere glomerulære celler (figur 4B). Normalt produceret af sunde podocytter, overgår kollagen IV heterotrimerer fra ɑ1ɑ1ɑ2 til ɑ3ɑ4ɑ5 under glomerulær udvikling, hvilket er nødvendigt for korrekt GBM dannelse og funktion.33,34 Opregulering af Col4a1, sammen med udvidelse af den mesangiale matrix, er hyppigt observeret i DKD.41,42 I den aktuelle analyse blev Col4a1 udtrykt af både mesangiale celler og GEC'er (gennemsnitlig ekspression af ligand-varmekort) (figur 4B) og blev specifikt opreguleret i iCTCFpod / GEC'er sammenlignet med WT-kontroller. Disse data tyder på, at GEC'er opregulerer Col4a1 i forbindelse med podocytskade, hvilket kan føre til en stivere, fibrotisk GBM, der bidrager til udviklingen af segmental sklerose.33
Bmp4 var en højt udtrykt mesangial ligand identificeret ved NicheNet-analyse (figur 4, BD). BMP'er spiller nøgleroller i nyreudvikling og sygdom.43 Bmp4 er opreguleret i forbindelse med diabetisk nefropati hos rotter42, og behandling af mus med diabetes med et anti-BMP4-antistof forhindrer opregulering af Col4a1 og mesangial matrixudvidelse .44 Af særlig interesse blev mesangial Bmp4 fundet at udløse GEC Smad6-ekspression (figur 4B). Ekspression af Smad6 induceres af BMP'er, og i en negativ feedback-loop hæmmer Smad6 specifikt BMP'er, inklusive BMP4.45 Smad6 blev nedreguleret i iCTCFpod/GEC'er sammenlignet med WT-kontroller, hvilket tyder på øget BMP-signalering i endotelceller i forbindelse med podocytskade .
En af de prioriterede ligander identificeret i podocytter var Sema3e (figur 4, BD). Klasse 3 semaphoriner er udskilte proteiner, der fungerer i en række biologiske processer, herunder angiogenese, lymfangiogenese og sygdom.46 Sema3a er opreguleret i human DKD,47 og Sema3g blev for nylig identificeret som et podocytspecifikt gen, der beskytter podocytter mod inflammation in vivo. 48 Sema3e's rolle i podocytten er stadig uklar. Den nuværende analyse afslørede et tidligere ikke-genkendt receptor-ligand-par, hvorved podocyt Sema3e interagerer med plexinD1 på GEC'er for at udløse flere nedstrøms genmål i indstillingen af podocytskade (figur 4, C og D).
Blandt flere nyligt identificerede GEC-målgener blev Hes1 og Cx3cl1 også fundet i adhæsionsgenprogrammerne beriget med GEC -1 (Figur 4, BD; Supplerende Figur S6). Hes1 er et mål for Notch-signalering, som spiller en vigtig rolle i den udviklende nyre, men reaktivering kan føre til fibrose.49 Cx3cl1 er et kemokin hovedsageligt produceret af glomerulært endotel, der fungerer som et kemoattraktant og adhæsionsmolekyle for dets receptor, Cx3cr1, som er allestedsnærværende udtrykt på mononukleære og cirkulatoriske lymfatiske leukocytter.50 Cx3cl1 er blevet impliceret i enforskellige nyresygdomme, herunderDKD, IgA nefropati og glomerulonephritis.50 Hes1 og Cx3cl1 blev begge opreguleret i iCTCFpod/GEC'er sammenlignet med WT-kontroller, hvilket tyder på, at GEC'er reagerer på podocytskade ved at opregulere proinflammatoriske og profibrose-programmer.
Endelig, fordi mange af liganderne og målene identificeret i NicheNet-analysen er impliceret i DKD, i både gnavermodeller såvel som mennesker, blev datasættet sammenlignet med et enkelt nuclei transkriptomisk datasæt af tidlig human DKD.10 En specifik sammenligning blev foretaget af differentielt udtrykte gener mellem humane og muse celleklynger. Af de 138 differentielt udtrykte gener i humane DKD GEC'er blev 25 gener også identificeret i muse iCTCFpod / endotelceller, inklusive Col4a1 (Supplerende figur S7; Supplerende tabel S11). Tilsammen antyder disse resultater, at endotelcelleprogrammer, der ofte afbrydes i human DKD, delvist kan rekapituleres i musemodellen for tidlig glomerulær skade via selektiv podocytablation. Derudover tyder disse resultater på, at der ud over podocytter kan være potentielle endotelspecifikke mål og terapeutiske strategier til at standse eller bremse udviklingen af komplekse og stærktudbredte nyresygdomme, som f.eksDKD.
