Udskilt neutrofil gelatinase-associeret lipocalin viser stærkere evne til at hæmme cysteforstørrelse af ADPKD-celler sammenlignet med ikke-udskilt form Ⅲ
Jun 25, 2024
3.4. Effekter af mNGAL på cystedannelse af 2L3-celler i 3D-kultur
Celleproliferationer unormalt øget i 2L3 mus og fører til cystedannelse og forstørrelse [17]. Baseret på de tidligere resultater, som mNGAL hæmmede2L3 celleproliferation i 2D kultur(Figur 3) spekulerede vi i, at mNGAL yderligere kunne hæmme cystedannelse i 2L3-celler. For at undersøge, om mNGAL kunne hæmme cystedannelse i 2L3-celler, etablerede vi en 3D-kulturplatform, der gav et passende miljø med Matrigel til cystedannelse (figur 6). Celler blev podet i 96-brøndsplader (1000 celler/brønd) oven på præformet Matrigel natten over. Efter at cellerne var blevet fastgjort til gelen, blev mere Matrigel tilsat til cellerne for at danne et sandwich-lignende mønster (figur 6A). Celler blev holdt i 3D-kultur ved 37 ◦C og 5 % CO2 i mindst 5 dage for at danne cyster. Cyster i 3D-kultur voksede sig større med en forlænget dyrkningstid (figur 6B). For at bekræfte, at de sfæriske konstruktioner observeret i 3D-kultur var cyster med et lumen, fikserede og farvede vi dem med DAPI og E-cadherin og actin-antistoffer for at identificere henholdsvis cellekerner, celle-celleadh, esion og apikale membran. Forskellige optiske z-sektioner af en 2L3-cyste i 3D-kultur fra toppen (lag 1) til midten (lag 5) blev observeret ved konfokal mikroskopi, og lumenet blev bekræftet i den sfæriske cyste (Figur 6C, Supplerende materiale)
NYE URTER TIL ADPKD(POLYCYSTISK NYRESYGDOM)
For at undersøge virkningerne af mNGAL på cystedannelse af 2L3-celler i 3D-kultur blev celler i 3D-kultur behandlet med forskolin fra dag 1 til 3 for at inducere cystedannelse. Cellerne blev derefter behandlet med eller uden mNGAL fra dag 4 til 8, og cystediametre blev målt hver dag (figur 6D). Cyster i 3D-kultur voksede proportionalt med antallet af dyrkningsdage, med diametre fra 40 til 120 µm (figur 6E-G), mens mNGAL signifikant undertrykte cystediametrene (figur 6F) og arealet (figur 6G) indtil dag 8. var der ingen signifikant forskel i stigningen i cysteantal mellem kontrol- og mNGAL-behandlede grupper fra dag 4 til 8 (figur 6H). Vi analyserede yderligere antallet af store cyster (diameter > 100 µm) mellem de to grupper og fandt, at mNGAL signifikant reducerede procentdelen af store cyster sammenlignet med kontrolgruppen på dag 8 (figur 6I).
3.5. Virkninger af transfektion med pN + LS og pN - LS på NGAL-ekspression og celleproliferation i 2L3-celler
For at undersøge, om behovet for en højere koncentration af mNGAL (2 mg/ml) i 3D-kultur for at hæmme cystevækst af 2L3-celler (figur 6) skyldtes manglen på posttranslationel modifikation af mNGAL, designede vi en konstruktion til overekspression af mNGAL i 2L3 celler. Derudover er det blevet påvist, at NGAL kan interagere med NGAL-R og yderligere inducere apoptose [29]. Derfor for at forstå, om NGAL interagerede med NGAL-R for at inducere apoptose og yderligerehæmmer cellernes levedygtighed(figur 3) og cystevækst (figur 6), en konstruktion til overekspression af ikke-udskilt NGAL (uden ledersekvensen) blev også transficeret ind i 2L3-celler.
Muse-NGAL (NP_032517.1) og human NGAL (NP_005555.2) er henholdsvis 200-aa- og 198-aa-proteiner, og begge har en {{6 }} et signalpeptid til sekretion placeret ved N-terminalen af NGAL-proteinet (figur 7A). Sekvenssammenligning viste 62 % identitet og 80 % positivitet mellem mus NGAL og human NGAL. Muse-NGAL blev vist at have to N-koblede glycosyleringssteder på asparagin (Asn, N) ved aa 81 og 85, mens human NGAL havde et sted ved aa 85 (figur 7A), hvilket afslørede forskellen mellem dem i posttranslationel modifikation.
Figur 7. Effekter af transfektion med pN + LS og pN - LS på NGAL-ekspression og celleproliferation i 2L3-celler. (A) Justering af muse NGAL (NP_032517.1) og humane NGAL (NP_005555.2) proteiner. 20-aa-signalpeptiderne er vist i blåt. De to rapporterede N-koblede glycosyleringssteder på Asn (N) ved aa 81 og 85 af muse NGAL og en ved aa 85 af human NGAL er markeret med en stjerne (*). Identiteter: ubrudt linje; positive: parrede prikker. Sekvensinformationen ovenfor er fra BLASTP-programmet på National Center for Biotechnology Information (NCBI) hjemmeside. (B) Konstruer et diagram af mNGAL med (pN + LS) eller uden (pN − LS) den udskilte Igκ-ledersekvens på pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd-vektoren. (C) Resultatet af gelelektroforese bekræftede konstruktionen af pN + LS (647 bp) og pN - LS (587 bp) fordøjet af Nhel og NotI. (D) Tidslinje for infektion og udvælgelse af 2L3-celler med pN + LSog pN − LS, henholdsvis. 2L3-cellerne blev inficeret pN + LS eller pN - LS i 6a-brøndspladen på dag 1. Selektion med blasticidin startede på dag 2, og mediet blev skiftet hver 3. dag. Efter selektion i en uge blev celler opsamlet for at blive analyseret ved RT-QPCR, western blot og ELISA. (E) Påvisning af ekspression af reporter eGFP for at undersøge transfektionseffektiviteten af pN + LS og pN - LS på dag 2. Omkring 10% af cellerne var inficeret med GFP-konstruktionen. Målestok: 50 µm. RT-qPCR-resultater viste, at pN + LS og pN - LS begge havde højere ekspression af Lcn2 (repræsenteret totalt NGAL-niveau) (F) og c-myc (repræsenteret transficeret eksogent NGAL-niveau) (G) sammenlignet med kontrolgruppen. (H) Der var ingen signifikant forskel oinSlc22a17 (NGAL-R) mellem grupperne. RQ: relativ kvantificering=2−∆∆Ct; Gapdh blev brugt som den interne kontrol af hver prøve. Værdierne blev normaliseret til kontrolgruppen. (I) Western blot-resultater viste pN + LS og pN - LS havde højere ekspression af NGAL end kontrolgruppen. (J) ELISA viste, at pN + LS og pN - LS celler beggeudskilte signifikant højere NGAL end kontrolgruppen, mens den udskilte NGAL mængde af pN - LS celler var signifikant mindre end pN + LS celler. (K) BrdU-inkorporering viste, at pN + LS- og pN - LS-celler havde et lavere celleproliferationsforhold end kontrolgruppen, mens pN - LS-celler havde en højere end pN + LS-celler. Elevens t-test blev udført for at bestemme signifikansen mellem de to grupper (n=3 i RT-qPCR og ELISA, n=4 i western blot og BrdU-inkorporering). *p < 0.05; ** p < {{10}}.01; ***p < 0,001 vs. 2L3 af hver gruppe; # p < 0,05; ### p < 0,001 vs. pN + LS gruppe; ns: ingen signifikant forskel.
I denne undersøgelse brugte vi en murin Igκ-kædeledersekvens (LS) [44] i stedet for det originale signalpeptid af mNGAL for at sikre øget sekretion af eksogent mNGAL-protein. For at overudtrykke udskilt eller ikke-udskilt NGAL blev NGAL med eller uden LS i pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd-vektorer, nemlig pN + LS og pN - LS, brugt og er vist i figur 7B. To promotorer, pCMV og hPGK, blev brugt til at drive den uafhængige ekspression af to proteiner, NGAL-c-myc-His6 og eGFP. For at sikre insertion af konstruktionen blev NheI og NotI brugt til at fordøje de to plasmider, og gelelektroforeseresultaterne viste et 647-bp-bånd fra pN + LS og et 587-bp-bånd fra pN - LS (på grund af manglen på en 60-bp ledersekvens) (figur 7C).
Til infektion af pN + LS og pN-SP i 2L3-celler blev polybrene og lentivirus tilsat til celler og inkuberet ved 37 ◦C i 24 timer efterfulgt af selektion med blasticidin (figur 7D). Påvisning af GFP-ekspression blev udført ved fluorescensmikroskopi efter infektion (figur 7E). Inficerede celler blev høstet en uge efter blasticidin-selektion for RT-qPCR, western blot og ELISA for at analysere niveauet af NGAL-ekspression (figur 7F-J). RT-qPCR-resultaterne viste, at infektion af 2L3-celler med pN + LS og pN - LS førte til stigende ekspression af Lcn2 (figur 7F) og Lcn2-c-myc (figur 7G), som repræsenterede niveauerne af total og eksogen NGAL, mens der ikke var nogen forskelle i niveauerne af Slc22a17 (NGAL-R) ekspression (figur 7H). Western blot-resultaterne viste, at pN+LS- og pN-LS-celler havde højere niveauer af intracellulær NGAL-ekspression end kontrol-2L3-cellerne (figur 7I). ELISA-resultater for cellesupernatanten viste, at pN+LS- og pN-LS-celler begge havde signifikant højere niveauer af udskilt NGAL end 2L3-cellekontrolgruppen (figur 7J). Derudover var mængden af NGAL udskilt af pN - LS-celler signifikant mindre end den, der udskilles af pN + LS-celler (Figur 7J), mens de to grupper havde lignende NGAL-ekspressionsniveauer (Figur 7I). Dette fund understøttede vores forudsigelse om, at overekspression af NGAL uden et signalpeptid (pN - LS) begrænsede sekretionen af NGAL på trods af tilstedeværelsen af et højt niveau af intracellulær NGAL. For at undersøge om udskilt NGAL i stedet for ikke-udskilt NGAL hæmmede celleproliferation, blev der udført et BrdU-inkorporeringsassay, som viste, at pN + LS og pN - LS celler havde signifikant lavere proliferation end kontrolgruppen (figur 7K). Derudover havde pN - LS-celler signifikant højere proliferation end pN + LS-celler (figur 7K). Disse resultater antydede, at NGAL-sekretion fra 2L3-celler var påkrævet for at inhibere celleproliferation.
3.6. Effekter af mental overekspression, der fører til signalveje i 2L3-celler
Baseret på vores tidligere resultater, der viser, at mNGAL kunne hæmme ERK- og AKT-vejene i 2L3-celler (figur 4) og yderligere reducere celleproliferation (figur 3) og cysteforstørrelse (figur 6), brugte vi western blotting til at analysere, om ERK og AKT pathways blev påvirket i pN + LS og pN - LS celler (figur 8). Western blot-resultaterne viste, at pN + LS- og pN - LS-grupperne havde et signifikant lavere forhold af p-ERK (T202/Y204)/ERK end kontrolgruppen, og pN - LS-gruppen havde et højere forhold af p-ERK (T202/Y204)/ERK end pN + LS-gruppen (figur 8A). Forholdet mellem p-AKT (S473)/AKT var lavere i pN + LS-gruppen end i kontrolgruppen, mens pN - LS-celler ikke var signifikant forskellige fra dem i kontrol- og pN + LS-grupperne (figur 8B). Forholdet mellem p-CREB (S133)/CREB var signifikant højere i pN - LS-gruppen end i pN + LS-gruppen, mens hverken pN + LS eller pN - LS viste en signifikant forskel fra kontrolgruppen (figur 8C). Disse resultater tydede på, at pN + LS og pN - LS havde statistisk signifikante forskelle i forholdet mellem p-ERK/ERK (Figur 8A), mens pN + LS-gruppen ikke viste en bedre effekt i AKT (Figur 8B) og CREB ( Figur 8C) aktivering.
Ifølge de tidligere resultater, at mNGAL-applikation kunne inducere apoptose (figur 3) og autofagi i 2L3-celler (figur 5) og reducere celleproliferation (figur 3) og cysteforstørrelse (figur 6), brugte vi western blotting til at undersøge effekten på apoptose og autofagi i pN + LS og pN - LS celler (figur 9). Western blot-resultaterne viste, at pN + LS-celler havde et signifikant højere forhold mellem spaltet-/pro-caspase-3 (Figur 9A) og spaltet-/pro-PARP (Figur 9B) end kontrolgruppen; pN - LS-celler viste ingen signifikant forskel i forholdet mellem spaltet-/pro-caspase-3 (Figur 9A) og spaltet-/pro-PARP (Figur 9B) sammenlignet med kontrolgruppen, og forholdet mellem spaltet- /pro-caspase-3 var signifikant lavere end i pN + LS-gruppen (figur 9B). Disse resultater viste, at overekspression af udskilt NGAL snarere end ikke-udskilt NGAL inducerede apoptose i 2L3-celler.
Et højere forhold mellem LC3B II/LC3B I (figur 9C) og et lavere forhold mellem p62/GAPDH (figur 9D) blev identificeret i pN + LS-celler sammenlignet med kontrolgruppen; pN - LS-celler havde ingen signifikant forskel i forholdet mellem LC3B II/LC3B I (Figur 9C) og p62/GAPDH (Figur 9D) sammenlignet med kontrolgruppen, og forholdet mellem LC3B II/LC3B I var signifikant lavere end i pN + LS gruppe (figur 9C). Dette resultat afslørede, at overekspression af udskilt NGAL snarere end ikke-udskilt NGAL inducerede autofagi i 2L3-celler.
3.7. Effekter af overekspression af mNGAL på cystedannelse af 2L3-celler i 3D-kultur
Baseret på de tidligere resultater om, at mNGAL inhiberede 2L3-celleproliferation og cysteforstørrelse i henholdsvis 2D- og 3D-kultur (figur 3 og 6), havde vi mistanke om, at overekspression af udskilt NGAL yderligere kunne hæmme cysteforstørrelse af 2L3-celler gennem inhibering af celleproliferation ( Figur 7K).
For at undersøge virkningerne af NGAL-overekspression i 2L3-celler på cystedannelse blev 2L3-kontrollen, pN + LS og pN - LS celler behandlet med forskolin på dag 1-3 for at inducere cystedannelse. Cystediametrene, arealet og antallet blev målt dagligt efter forskolin-induktion (figur 10A). Cyster af 2L3-kontrollen, pN + LS- og pN-LS-celler i 3D-kultur voksede på en måde afhængig af dyrkningsdagene (figur 10B) og viste tydelige forskelle i cystestørrelse fra dag 4 til 8. pN + LS-gruppen havde signifikant mindre cystediametre (figur 10C) og områder (figur 10D) end kontrolgruppen fra dag 4 til 8, mens pN-LS-gruppen havde signifikant mindre cystediametre end kontrolgruppen på dag 6 og 8 (figur 10C). Der var ingen signifikant forskel i cystearealet mellem kontrol- og pN-LS-grupperne. Derudover havde pN - LS-gruppen signifikant større cystediametre og -arealer end pN + LS-gruppen på dag 8 (figur 10C, D). Selvom der ikke var nogen signifikant forskel i hastigheden af stigning i antallet af cyster blandt kontrol-, pN + LS- og pN - LS-cellerne (figur 10E), havde pN + LS- og pN - LS-grupperne begge signifikant lavere procentdel af store (diameter > 100 µm) cyster end kontrolgruppen (figur 10F) fra dag 4 til 8. Disse resultater viste, at pN + LS og pN - LS begge hæmmede cysteforstørrelse, mens den hæmmende effekt af pN - LS var svagere end den af pN + LS . Dette fund afslørede, at overekspression af udskilt mNGAL havde en overlegen evne til at inhibere cysteforstørrelse af 2L3-celler i 3D-kultur end ikke-udskilt mNGAL.
-En test blev udført for at bestemme signifikansen mellem grupper (n=3). * p < 0.05; *** p < 0.001 vs. kontrolgruppe; # p < 0,05 vs. pN + LS gruppe
caspase{{0}} (A) og spaltet-/pro-PARP (B) end kontrolgruppen, som repræsenterede induktionen af apoptose af udskilt mNGAL. pN - LS-celler havde ingen signifikant forskel i forholdet mellem spaltet-/pro-caspase-3 og spaltet-/pro-PARP sammenlignet med kontrolgruppen. pN + LS-celler havde et højere forhold mellem LC3B II/LC3B I (C) og det lavere forhold af p62 (D) sammenlignet med kontrolgruppen. pN-LS-celler havde ingen signifikant forskel i forholdet mellem LC3B II/LC3B I og p62 sammenlignet med kontrolgruppen. Tubulin, Vinculin og GAPDH blev brugt som de interne kontroller af hver prøve. Værdierne blev normaliseret til kontrolgruppen. Elevens t-test blev udført for at bestemme signifikansen mellem grupper (n=3). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 vs. kontrolgruppe; # p < 0,05; ## p < 0,01 vs.pN + LS gruppe.
Figur 9. Effekter af overekspression af mNGAL-protein på apoptose og autofagi i 2L3-celler. Western blot-resultater viste, at pN + LS-celler havde et signifikant højere forhold mellem spaltet-/pro-caspase-3(A) og spaltet-/pro-PARP (B) end kontrolgruppen, hvilket repræsenterede induktionen af apoptose af udskilt mNGAL. pN-LS-celler havde ingen signifikant forskel i forholdet mellem spaltet-/pro-caspase-3 og spaltet-/pro-PARP sammenlignet med kontrolgruppen. pN + LS-celler havde et højere forhold mellem LC3BII/LC3B I (C) og det lavere forhold af p62 (D) sammenlignet med kontrolgruppen. pN-LS-celler havde ingen signifikant forskel i forholdet mellem LC3B II/LC3B I og p62 sammenlignet med kontrolgruppen. Tubulin, Vinculin og GAPDH blev brugt som de interne kontroller af hver prøve. Værdierne blev normaliseret til kontrolgruppen. Elevens t-test blev udført for at bestemme signifikansen mellem grupper
(n {{0}}). * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001 vs. kontrolgruppe; # p < 0,05; ## p < 0,01 vs. pN + LS gruppe
4-8. Cystetal på dag 4 i hver gruppe blev brugt som kontrol til at beregne cysteantalforholdet. (F) Procentdel af store cyster i 3D-kulturen af kontrolgruppen, pN + LS og pN - LS celler i løbet af dag 4-8. Elevens t-test blev udført for at bestemme signifikansen mellem grupper (n=3). * p < {{10}}.05; ** p < 0.01 vs. kontrolgruppe; # p < 0,05; ## p < 0,01 vs. pN + LS gruppe.
