Den renale androgenreceptors rolle i kønsforskelle i ammoniakmetabolisme

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Autumn N. Harris et al

Abstrakt

Der er kønsforskelle i renal ammoniakmetabolisme og struktur, hvoraf mange er medieret aftestosteron. Målet med nærværende undersøgelse var at bestemme rollen af ​​det renale ekspression aftestosteronkanonisk receptor, androgenreceptor (AR), i disse seksuelle dimorfismer. Vi studerede mus mednyre-specifik AR-sletning [KS-AR-knockout (KO)] genereret ved hjælp af Cre/loxP-teknikker; kontrolmus var Cre-negative kuldkammerater (vildtype). Hos hanmus, men ikke hunmus, øgede KS-AR-KO ammoniakudskillelsen, hvilket eliminerede kønsforskelle. Selvom renal strukturel størrelse typisk er parallel med ammoniakudskillelse, faldt KS-AR-KOnyrestørrelse, kortikal proksimale tubuli volumen tæthed og cortical proksimal tubuli cellehøjde hos mænd – ingen af ​​dem blev ændret hos kvinder, og opsamlingskanal volumen tæthed var uændret hos begge køn. Analyse af nøgleprotein involveret i ammoniakhåndtering viste hos hanmus, at KS-AR-KO øgede både phosphoenolpyruvat carboxykinase (PEPCK) og Na þ -K þ -2Cl cotransporter (NKCC2) ekspression og nedsatte Na þ/H þ veksler isoform 3 (NHE3) og elektrogen Na þ -bicarbonat cotransporter 1 (NBCe1)-A ekspression. Hos hunmus ændrede KS-AR-KO ikke disse parametre. Disse virkninger opstod, selvom KS-AR-KO ikke ændrede plasmatestosteron, fødeindtagelse eller serum Na þ, K þ eller HCO3 signifikant hos begge køn. Som konklusion, AR-afhængige signalveje hos mænd, men ikke kvinder,nyrerregulerer PEPCK- og NKCC2-ekspression og fører til de seksuelle forskelle i ammoniakudskillelse. Modsatrettede effekter på NHE3 og NBCe1-Et udtryk begrænser sandsynligvis størrelsen af ​​ændringer i ammoniakudskillelsen. Da AR ikke er til stede i det tykke stigende lem, er effekten af ​​KS-AR-KO på NKCC2-ekspression indirekte. Endelig formidler AR det størrenyrestørrelse og proksimal tubuli volumen tæthed hos hanner sammenlignet med hunmus.

NYT & BEMÆRKELIGTSeksuelle dimorfier i ammoniakmetabolisme involverer androgenreceptor (AR)-afhængige signalveje hos mænd, men ikke kvinder,nyrersom fører til ændret proksimal tubuli (PT), phosphoenolpyruvat carboxykinase og tykt stigende lem Na þ -K þ -2Cl cotransporter udtryk. Adaptive responser i Na þ/H þ veksler 3 og elektrogen Na þ -bi- carbonat cotransporter 1- Et udtryk begrænser størrelsen af ​​effekten på ammoniakudskillelse. Endelig er den større nyrestørrelse og PT-volumendensitet hos hanmus resultatet af PT-androgensignalering gennem AR.

nøgleord: syre-base; ammoniak; androgen receptor; kønsforskelle;testosteron

cistanche øger testosteron

INTRODUKTION

The presence of sex differences in many aspects of mammalian biology has been well established with sexual dimorphisms in structure and/or function have been identified in nearly every organ, including the kidney (1–3). Sex affects many aspects of kidney function and disease. Sex differences in blood pressure are widely recognized and thought to be related to sex-specific variations in nitric oxide, the renin-angiotensin-aldosterone system, and inflammation (4, 5). There are also differences in the expression of many renal epithelial cells Naþ transporters (6, 7). Understanding these differences can identify new disease mechanisms and/or new and improved therapeutic opportunities. The kidney regulates acid-base homeostasis, which is critical for normal health (8, 9). Renal ammonia Fn1 1 metabolism has a major role in acid-base homeostasis; ammonia excretion is the predominant component of basal net acid excretion, and changes in ammonia metabolism account for >80 procent af responsen på eksogene stimuli (10-16). Dysregulering af syre-base-homeostase påvirker i det væsentlige alle større organsystemer direkte, accelererer progressionen af ​​kronisk nyresygdom og korrelerer med øget dødelighed (17-19).

Vores undersøgelser har vist, at der er vigtige kønseffekter på både ammoniakmetabolisme og nyrestruktur. Den mandlige nyre udskiller mindre ammoniak end den kvindelige nyre og gør det på trods af, at den mandlige nyre er større og har større kortikalt volumen end den kvindelige nyre (20). Denne forskel i ammoniakudskillelse korrelerer med variationer i flere nyreaspekter, herunder adskillige enzymer involveret i ammoniakgenerering og -genanvendelse, i proksimal tubulistørrelse, i den tykke opadgående lem af løkken af ​​Henle (TAL) Naþ -Kþ ​​- 2Cl - cotransporter (NKCC2) ekspression, og i opsamling af kanal interkaleret cellestørrelse og Rhesus (Rh) glycoprotein ekspression (20). Endelig er der kønsforskelle i responsen på syrebelastning (21). Mange af disse kønsforskelle vendes ved orkiektomi gennem en mekanisme, der er ophævet af fysiologisktestosteronudskiftning, hvilket tyder på, at de involverertestosteron-afhængige signalveje (22).

Den kanoniske vej, hvorigennemtestosteronmedierer biologiske effekter involverer binding til androgenreceptoren (AR) (23, 24). AR-protein og mRNA-ekspression er blevet observeret i både mandlige og kvindelige nyrer i årtier (25-28). Vi har for nylig vist, at AR-protein udtrykkes specifikt i den proksimale tubuli, og at ekspressionen ikke var påviselig i hverken TAL- eller opsamlingskanalen (22), hvor der er kendte kønsforskelle i proteiner involveret i ammoniakhåndtering. Vores undersøgelser viste yderligere, at proksimal tubulus AR-ekspression var til stede i både mandlige og kvindelige nyrer, hvor ekspressionen var cirka dobbelt så meget i den mandlige nyre end i den kvindelige nyre (22). Disse observationer tyder på, at AR kan mediere nogle, men ikke alle, virkningerne af sex på nyrestrukturen og på ammoniakdannelse og -transport. De rejser også spørgsmålet om AR's rolle i den kvindelige nyre.

Formålet med denne undersøgelse var således at bestemme rollen af ​​renal AR i mediering af disse identificerede seksuelle dimorfismer i renal ammoniakmetabolisme og nyrestruktur. Fordi AR-aktivering har adskillige biologiske virkninger, som indirekte kan ændre syre-base-homeostase og dermed ammoniakhåndtering, er det kompliceret at fortolke undersøgelser, der anvender farmakologisk AR-hæmning og/eller global AR-deletion. Derfor brugte den nuværende undersøgelse mus med nyrespecifik AR-deletion [KS-AR-knockout (KO)] genereret ved hjælp af Cre-loxP-teknikker. Vi sammenlignede Cre-positive mus med deres Cre-negative kuldkammerater for at bestemme effekten af ​​KS-AR-KO. Både han- og hunmus blev evalueret for at tillade forståelse af AR's rolle i begge køn.

cistanche tubulosa rødder

METODER

Dyr

Vi brugte mus med loxP-steder, der flankerer exon 2 af AR-genet (ARflfl/flfl), som tidligere er blevet beskrevet (29-31). Vi inducerede helnyre-AR-deletion ved at avle mus, der udtrykker Cre-recombinase under kontrol af Pax-8-promotoren (Pax8Cre; 32). KS-AR-KO mus var ARflfl/flfl, Pax8-Cre þ; kontrolmus var ARflfl/flfl, Pax{10}Cre. Alle mus var på C57/Bl6-baggrundsstammen. Vi genotypede alle mus ved hjælp af DNA ekstraheret fra prøver af haleclips. Mus, der blev brugt i disse eksperimenter, var voksne han- og hunmus på -4 mdr. gamle. Mus blev holdt på en standard gnaverdiæt (18 procent protein, Harlan Teklad, Madison, WI) med fri adgang til vand. University of Florida og North Florida/South Georgia Veterans Health System Institutional Animal Care and Use Committee godkendte alle dyreprotokoller. Dyreavl blev udført i University of Florida College of Medicine Cancer and Genetics Transgenic Animal Core Facility af uddannet personale.

Metaboliske bureksperimenter

Mus blev anbragt i metaboliske bure i 3 dage og fodret med en pulveriseret normal diæt (18 procent protein, Harlan Teklad) blandet 1:1 med vand. Dagligt madforbrug blev målt, og daglige 24-h urinprøver blev indsamlet. Urinprøver blev opsamlet i rør indeholdende vand-ækvilibreret mineralolie for at forhindre fordampning og tab af gasmolekyler. Daglig urinvolumen og pH blev registreret. Urinprøver blev opbevaret ved - 20 grad, indtil de blev analyseret yderligere.

Blodanalyse

Blod blev opnået ved kanylering af den abdominale aorta hos mus bedøvet med isofluran, trukket ind i en hepariniseret sprøjte og straks analyseret for Naþ, K þ og bicarbonatkoncentrationer ved hjælp af en Siemens Microanalytic Blood Gas Analyzer (RAPIDLab 348 Analyzer, Siemens, München, Tyskland ). Serum testosteron blev målt i University of Virginia School of Medicine Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core (IBL America muse testosteron ELISA, Minneapolis, MN)

Urinanalyse

Urinammoniak blev målt under anvendelse af en modifikation af et kommercielt tilgængeligt kit (A7553, Pointe Scientific, Canton, MI), som tidligere beskrevet (20, 33). Urin pH blev målt under anvendelse af en mikro-pH elektrode (ROSS semi-mikro pH, Orion 8103BN, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Titrerbar syreudskillelse blev bestemt under anvendelse af tidligere beskrevne standardteknikker (20, 33).

Antistoffer

Tabel 1 viser antistofferne anvendt i denne undersøgelse, deres leverandører og deres katalog-/identifikationsnumre.

cistanche tubulosa-ekstrakt booster testosteron og øger den seksuelle evne

Protein forberedelse

Dyrene blev bedøvet med inhalationsmiddel isofluran, og nyrerne blev skyllet ved in vivo hjerteperfusion med PBS (pH 7,4) indeholdende 6,000 U/L Na-heparin og 120 mg/L lidocain. Den højre nyre blev fjernet hurtigt, og cortex, ydre medulla og indre medulla blev isoleret på et koldt stadium under et dissektionsmikroskop. Prøver blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret frosset ved - 80 grader indtil brug. Væv blev homogeniseret i T-PER-vævsproteinekstraktionsreagenset (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) under anvendelse af mikrorørstænger (USA Scientific, Ocala, FL), og protein blev ekstraheret i henhold til producentens anbefalinger. En alikvot blev brugt til total proteinkvantificering ved anvendelse af et bicinchoninsyre (BCA) assay, og resten blev opbevaret frosset ved 80 grader indtil brug.

Immunoblot-procedurer Ti mikrogram nyreprotein blev underkastet elektroforese på en 10 procent PAGE ReadyGel (Bio-Rad, Hercules, CA). Geler blev overført elektroforetisk til nitrocellulosemembraner, blokeret med 5 g/dL fedtfri tørmælk fortyndet i Blotto-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA og 0,05 procent Tween 20, pH 7,6) og inkuberet ved 4 C natten over. med det primære antistof i fedtfri tørmælk. Ladning og overførselsækvivalens blev vurderet med Ponceau S-farvning og ved at evaluere ekspressionen af ​​husholdningsproteinet b-actin. Efter at være blevet vasket, blev membranerne udsat for sekundært antistof (gede-anti-kanin-IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) konjugeret til peberrodsperoxidase i en fortynding på 1:5,000. Steder for antistof-antigen-reaktion blev visualiseret ved hjælp af forbedret kemiluminescens (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) og et Kodak Image Station 440CF digitalt billeddannelsessystem. I udvalgte eksperimenter blev blots strippet. Båndtæthed blev normaliseret således, at den gennemsnitlige tæthed i en region (cortex eller ydre medulla) i mandligt vildtype (WT) væv var 100. Begge køn (han og hun) og begge genotyper (WT og KO) blev belastet på det samme gel til disse eksperimenter. Fraværet af mætning blev bekræftet ved at undersøge pixelintensitetsfordeling i alle immunoblots.

Immunoblot-procedurer

Ti mikrogram nyreprotein blev underkastet elektroforese på en 10 procent PAGE ReadyGel (BioRad, Hercules, CA). Geler blev overført elektroforetisk til nitrocellulosemembraner, blokeret med 5 g/dL fedtfri tørmælk fortyndet i Blotto-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA og 0,05 procent Tween 20, pH 7,6) og inkuberet ved 4C natten over med det primære antistof i fedtfri tørmælk. Ladning og overførselsækvivalens blev vurderet med Ponceau S-farvning og ved at evaluere ekspressionen af ​​husholdningsproteinet b-actin. Efter at være blevet vasket, blev membraner udsat for sekundært antistof (ged anti-kanin IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) konjugeret til peberrodsperoxidase i en fortynding på 1:5,000. Steder for antistof-antigen-reaktion blev visualiseret ved hjælp af forbedret kemiluminescens (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) og et Kodak Image Station 440CF digitalt billeddannelsessystem. I udvalgte eksperimenter blev blots strippet. Båndtæthed blev normaliseret således, at den gennemsnitlige tæthed i en region (cortex eller ydre medulla) i mandligt vildtype (WT) væv var 100. Begge køn (han og hun) og begge genotyper (WT og KO) blev belastet på det samme gel til disse eksperimenter. Fraværet af mætning blev bekræftet ved at undersøge pixelintensitetsfordeling i alle immunoblots.

Vævsforberedelse til immunhistokemi

Mus blev bedøvet med inhalerende isofluran. Nyrerne blev konserveret ved in vivo hjerteperfusion med PBS (pH 7,4) indeholdende 6,000 U/L Na-heparin og 120 mg/L lidocain efterfulgt af periodat-lysin-2 procent paraformaldehyd, skæres på tværs i flere 2- til 3-mm tykke skiver og derefter nedsænket i 24-30 timer ved 4 grader i det samme fikseringsmiddel. Nyreprøver fra hvert dyr blev indlejret i polyestervoks fremstillet med polyethylenglycol 400 distearate (Polysciences, Warrington, PA) med 10 procent 1-hexadecanol og 2-mm tykke sektioner blev skåret og monteret på gelatinebelagt dias.

cistanche tubulosa fordel: øge den seksuelle evne

Immunhistokemi

Immunlokalisering for Rh-familie B-glycoprotein (Rhbg), Rh-familie C-glycoprotein (Rhcg), Naþ /Hþ-vekslerisoform 3 (NHE3), glutaminsyntetase (GS), NKCC2 og AR blev opnået ved hjælp af tidligere beskrevne immunoperoxidaseprocedurer (20, 22, 34-37). Kort fortalt blev sektioner afvokset i ethanol, rehydreret, opvarmet i Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) til 88 C i 30 minutter og derefter til 96 grader i 30 minutter, afkølet i 30 minutter og skyllet i PBS. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved at inkubere sektioner i 3 procent H2O2 i destilleret vand i 45 min. Sektioner blev blokeret i 15 minutter med serumfri proteinblok (Dako Cytomation) og derefter inkuberet natten over ved 4 C med det primære antistof. Sektioner blev vasket i PBS, inkuberet i 30 minutter med polymer-bundet, peroxidase-konjugeret heste-anti-kanin IgG (ImmPRESS, Vector Laboratories, Burlingame, CA), vasket igen med PBS og derefter udsat for diaminobenzidin i 5 minutter. Sektioner blev vasket med destilleret vand, dehydreret med xylen, monteret og observeret ved lysmikroskopi. Sammenligninger af mærkning blev foretaget mellem sektioner fra det samme immunhistokemiske eksperiment. Sektioner blev undersøgt på et Zeiss Axio Imager A2-mikroskop udstyret med DIC-optik og fotograferet ved hjælp af Axiocam 305 farve digitalkamera og Zen 2.3 software (Zeiss).

Immunlokalisering for phosphoenolpyruvat carboxykinase (PEPCK) blev opnået ved hjælp af modificerede immunoperoxidaseprocedurer som tidligere beskrevet (20, 22, 38-40). Kort fortalt blev sektioner afvokset i ethanol, rehydreret, opvarmet i Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) til 96 C i 6 0 minutter, afkølet i 30 minutter og skyllet i PBS. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubation af sektionerne i 3 procent H2O2 i methanol i 45 min. Sektioner blev behandlet med 0,5 procent Triton X-100 i PBS i 15 min. Sektioner gennemgik derefter adskillige vaske i PBS indeholdende 1 procent BSA, 0,05 procent saponin og 0,2 procent gelatine, efterfulgt af blokering i 15 minutter med serumfri proteinblok (DAKO Cytomation) og derefter inkuberet natten over ved 4 C med primært antistof. Sektioner blev vasket i PBS indeholdende 0,1 procent BSA, 0,05 procent saponin og 0,2 procent gelatine efterfulgt af PBS og inkuberet i 60 minutter med polymer-bundet, peroxidase-konjugeret gede-anti-kanin IgG (MACH2, Biocare Medical, Concord, CA), vasket igen i PBS og derefter udsat for diamino-benzidin i 5 min.

Negativ kontrol

Hvert immunhistokemieksperiment inkluderede et afsnit, der blev udsat for immunmærkningsprocedurerne uden primære antistoffer for at sikre, at mærket kun skyldtes primær antistofbinding.

Morfometrisk analyse

Volumentætheden af ​​den proksimale tubuli i cortex og den ydre stribe af den ydre medulla samt opsamlingskanalen i cortex og den indre stribe af den ydre medulla blev bestemt ved hjælp af standard punkttællingsteknikker som tidligere beskrevet (20-22, 41) ).

Kvantitativ immunhistokemi

Kvantitativ immunhistokemi blev udført som vi tidligere har beskrevet og valideret (20, 22, 33, 37, 42). Proksimale tubulisegmenter blev undersøgt i sektioner mærket under identiske betingelser i det samme immunmærkningseksperiment af en observatør, der var blindet for behandlingsgruppen. De specifikke målte proksimale tubuli-segmenter var den initiale proksimale viklede tubuli (PCT), defineret som PCT-segmenter kontinuerlige med Bowmans kapsel, den proksimale lige tubuli (PST) i marvstrålen og PST i den ydre stribe af den ydre medulla. Vi brugte højopløselige digitale mikrofotografier taget af tilfældigt udvalgte felter af nyrebarken og den ydre stribe af den ydre medulla ved hjælp af et Zeiss Axio Imager A2 mikroskop udstyret med et Axiocam 305 farve digitalkamera og Zen 2.3 software (Zeiss) uden brug af billedforbedringsteknikker . Ved hjælp af ImageJ-software (v, 1.34j, National Institutes of Health, Bethesda, MD) målte vi pixelintensitet på tværs af en lige linje trukket fra tubulilumen gennem en individuel celle. Disse data blev derefter analyseret ved hjælp af specialskrevet software udført i Microsoft Excel 2016. Nettointensiteten ved hver pixel på linjen blev derefter bestemt som forskellen mellem absolut intensitet og gennemsnitlig baggrundspixelintensitet målt uden for cellen. Total cellulær ekspression blev bestemt ved at integrere nettopixelintensitet over hele cellen. Cellehøjden blev bestemt som afstanden i pixels mellem de apikale og basolaterale kanter af cellerne og konverteret til absolut længde under anvendelse af kalibreret bestemmelse af individuelle pixelstørrelser. Et minimum af 15 individuelle celler fra mindst fire mikrofotografier fra hver nyre blev analyseret. Data fra alle undersøgte celler af en given proksimal tubulussegmenttype blev gennemsnittet for at give et enkelt datapunkt pr. dyr til statistisk analyse.

Vi besluttede at type A interkaleret cellestørrelse og cellespecifik proteinekspression som tidligere beskrevet (20, 22). Kort fortalt opnåede vi højeffekt digitale mikrofotografier af den indre stribe af den ydre medulla af vævssnit, der havde gennemgået immunhistokemi for den interkalerede cellespecifikke markør Rhbg eller Rhcg. Individuelle interkalerede celler blev omskrevet ved hjælp af ImageJ-software (v. 1.34j, National Institutes of Health). Cellestørrelsen blev bestemt som antallet af pixels inden for de skitserede områder og konverteret til området ved hjælp af kalibreret måling af pixels pr. mikrometer. Immunmærkningsintensiteten ved hver pixel blev bestemt som forskellen mellem absolut pixelintensitet og gennemsnitlig baggrundsintensitet, og encellet immunmærkningsintensitet blev bestemt ved at integrere nettopixelintensitet i cellen ved hjælp af specialskrevet software udført i Microsoft Excel 2016.

cistanche behandle nyresygdom for at øge den seksuelle evne

RESULTATER

Verifikation af nyrespecifik AR-sletning

AR farmakologisk blokering eller global deletion inducerer en lang række fænotypiske ændringer (43), som indirekte kunne ændre nyrernes strukturelle og ammoniakresponser. For at undgå disse problemer genererede vi KS-AR-KO-mus ved hjælp af Cre loxP-teknikker. Vi bekræftede effektiviteten af ​​renal AR-deletion ved hjælp af immunhistokemi (fig. 1). I WT-mus viste immunhistokemi nuklear AR-immunolabel begrænset til den proksimale tubuli; dette svarede til vores fund i den normale musenyre (22). I KO-nyren var der ingen påviselig AR-immunmærke til stede i begge køn (fig. 1). Disse resultater viser dannelsen af ​​mus med renal AR deletion.

statistisk analyse ved hjælp af SPSS-software (26.2) og Microsoft Excel 2016.

Fordi testosteron har adskillige ekstrarenale virkninger, som muligvis indirekte kan ændre renale syre-base mekanismer, overvejede vi muligheden for, at KS-AR-KO kunne ændre plasma testosteron eller østradiol niveauer. Plasmatestosteron- og østradiolkoncentrationerne afveg imidlertid ikke signifikant mellem WT- og KO-mus i begge køn (tabel 2).

Fysiologisk karakterisering af nyrespecifik AR-deletion Kropsvægten var større i WT-hanmus end i WT-hunmus på trods af ingen kønsforskel i fødeindtagelse, som tidligere rapporteret (22), i overensstemmelse med kendte ekstrarenale effekter af sex på kropsvægt. KS-AR-KO ændrede dog ikke dagligt fødeindtag eller kropsvægt hos begge køn (tabel 2).

Nyrevægten var signifikant større hos WT-hanmus end hos WT-hunmus (fig. 2), svarende til, hvad vi tidligere har rapporteret hos normale mus (22). KS-AR-KO nedsatte nyrevægten signifikant hos KS-AR-KO-hanmus, i det omfang, at KS-AR-KO-han-nyrevægten ikke afveg signifikant fra hun WT eller KS-AR-KO nyrevægt (fig. 2). . Hos hunmus ændrede KS-AR-KO ikke nyrevægten signifikant. Effekten af ​​sex på nyrernes vægt kræver således AR-ekspression i den mandlige nyre.

Hverken plasma Naþ, K þ, eller bicarbonatkoncentrationer afveg signifikant mellem WT og KS-AR-KO mus for begge køn (tabel 2). Urinstofclearance, brugt som en markør for glomerulær filtrationshastighed, afveg ikke signifikant mellem WT- og KS-AR-KO-mus i begge køn (tabel 2).

Netto syreudskillelse

Netto syreudskillelse involverer to processer: ammonium (NH4þ ) udskillelse og titrerbar syreudskillelse. Hos hanmus øgede KS-AR-KO ammoniakudskillelsen signifikant, hvilket eliminerede kønsforskellen i ammoniakudskillelsen (fig. 2). Ammoniakudskillelse blev ikke signifikant ændret hos hunmus af KS-AR-KO. Titrerbar syreudskillelse blev ikke signifikant ændret af KS-AR-KO hos begge køn (tabel 2). Urin-pH blev signifikant reduceret med KS-AR-KO i hanmus, men ikke i hunmus (tabel 2); virkningen af ​​KS-AR-KO på ammoniakudskillelse vedblev imidlertid efter statistisk vurdering af urinens pH (P < 0.001="" ved="" anova).="" således="" medierer="" proximal="" tubulus="" ar="" kønsforskelle="" i="" ammoniakudskillelse="" hos="" hanmus,="" men="" dens="" deletion="" havde="" ingen="" signifikant="" effekt="" på="" ammoniakudskillelse="" hos="">

Effekt af nyrespecifik AR-deletion på proksimal tubulistruktur

Proksimale tubuli tegner sig for en større andel af kortikalt volumen i den mandlige nyre end i den kvindelige nyre, og dette er testosteronafhængig (20, 22). Således bestemte vi virkningerne af KS-AR-deletion i han- og hunmus på proksimal tubulistruktur. Ved at bruge PEPCK-immunolabel som en proksimal tubuli-specifik markør viste immunhistokemi kvalitativt, at KS-AR-KO reducerede andelen af ​​cortex, der var proksimal tubuli (fig. 3A). Kvantitativ analyse ved brug af formelle punkttællingsteknikker (41) viste, at KS-AR-KO signifikant nedsatte proksimale tubulivolumendensitet i cortex hos mænd, hvilket er parallelt med ændringen i nyrevægt (fig. 3B). I modsætning hertil ændrede KS-AR-KO i den ydre stribe af den ydre medulla ikke den proksimale tubulivolumendensitet hos hanmus signifikant (fig. 3B). Hos hunmus ændrede KS-AR-KO ikke kvalitativt andelen af ​​cortex, der var proksimal tubuli (fig. 3A) og ændrede kvantitativt ikke proksimal tubulivolumendensitet i hverken cortex eller ydre medulla (fig. 3B). Kønsforskellen i kortikal proksimal tubuli-volumendensitet til stede i WT-mus var ikke til stede i KS-AR-KO-mus. I den mandlige nyre medierer AR således kønsforskellene i proksimale tubuli volumen tæthed i cortex. I den ydre medulla ser AR-ekspression ikke ud til at påvirke proksimal tubulusvolumentæthed hos begge køn.

Disse ændringer i proksimal tubulistruktur hos KS AR-KO-hanmus ser ud til at involvere ændringer i cellestørrelse. Hos hanmus reducerede KS-AR-KO den proksimale tubulicellehøjde signifikant i både PCT og kortikal PST, dvs. i hele cortex (fig. 3C). Cellehøjden i PST i den ydre medulla blev ikke ændret signifikant (fig. 3C). Disse resultater er parallelle med resultaterne af volumentæthed. Nyrespecifik AR-deletion hos hunmus ændrede ikke proksimal tubuluscellehøjde i hverken PCT, kortikal PST eller PST i den ydre medulla, hvilket er parallelt med manglen på effekt på volumendensitet og total nyrestørrelse i hunnyren (fig. 2B).

Nyrevægt, kortikal proksimal tubulusvolumentæthed og cellehøjde i PCT og kortikal PST var alle større i WT mandlig nyre end i WT kvindelig nyre, hvilket er parallelt med vores tidligere observationer (20, 22). Hos KS-AR-KO-hanmus eksisterede denne kønsforskel ikke længere, og hver af disse parametre afveg ikke signifikant fra den, der blev observeret i hverken WT- eller KS-AR-KO-hunmus. Kønsforskelle i nyrevægt, kortikal proksimal tubulivolumendensitet og cellehøjde i PCT og kortikal PST er således afhængige af AR-ekspression.

Effekt af nyrespecifik AR-sletning på opsamlingskanalstruktur

Der er vigtige kønsforskelle i opsamlingskanalen, idet opsamlingskanalens volumentæthed er større i andelen af ​​cortex eller ydre medulla, der samler kanal hos enten han- eller hunmus (fig. 4A). Kvantitativ morfometrisk analyse viste, at KS-AR-KO ikke ændrede opsamlingskanalvolumendensiteten signifikant i hverken cortex eller ydre medulla hos begge køn (fig. 4B). Renal AR medierer således ikke den seksuelle dimorfi ved opsamling af kanalvolumendensitet.

Ammoniagende enzymekspression Resultaterne i nettosyreudskillelse viser, at nyrespecifik AR-deletion øger ammoniakudskillelsen hos hanmus, selvom det reducerer proksimal tubulivolumentæthed og cellehøjde i cortex. Dette indikerer, at virkningerne på ammoniakudskillelse ikke blot kan tilskrives proksimal tubulushypertrofi, der fører til øget ammoniakgenese og i stedet er resultatet af separate og specifikke effekter på ammoniakgenese og/eller ammoniaktransport. Derfor undersøgte vi derefter nøgleproteiner involveret i ammoniak-genese og i ammoniaktransport.

PEPCK er et centralt proksimalt tubulusenzym, der kræves til ammoniakgenese og findes udelukkende i den proksimale tubuli i nyren (16, 44). Hos hanmus øgede KS-AR-KO kortikal PEPCK-ekspression signifikant; der var ingen effekt af KS-AR-KO i hunmus (fig. 5A). Stigningen i PEPCK-ekspression i KS-AR-KO-hanmus eliminerede kønsforskellen i WT-mus (fig. 5A). Undersøgelse af PEPCK-immunolabel-ekspression viste, at KS-AR-KO-hanmus havde større PEPCK-immunalabelintensitet i PCT og kortikal PST end WT-mus (fig. 5B). I den ydre stribe af den ydre medulla var der ingen påviselig forskel i PEPCK-immunmærkningsintensitet (fig. 5B). Kvantitativ immunhistokemi af hanmus viste, at KS-AR-KO øgede PEPCK-immunmærkningsintensiteten signifikant i både PCT og kortikal PST, men ikke i den ydre stribe af den ydre medulla (fig. 5C). I hanmus, men ikke i hunmus, reducerer proksimal tubulus AR-ekspression således PEPCK-ekspression i kortikale proksimale tubuli-segmenter, men ikke i PST i den ydre medulla.

Den proksimale tubuli har en ammoniakgenanvendelsesevne, der involverer GS (37, 42, 45, 46). I hverken han- eller hunmus ændrede KS-AR-KO signifikant GS-ekspression (fig. 5D). Renal AR ser således ikke ud til at modulere GS-ekspression.

Effekt af nyrespecifik AR-deletion på NBCe1-ekspression

NBCe1 er et proksimalt tubulus integreret membranprotein med en stor rolle i filtreret bicarbonat reabsorption, der også regulerer ammoniakmetabolisme (47-49). To splejsningsvarianter af NBCe1, NBCe1-A og NBCe1-B, er til stede i musens nyre (50, 51). Ved at bruge et pan-NBCe1-antistof, som genkender begge NBCe1-varianter, fandt vi, at KS-AR-KO reducerede kortikal NCBe1-ekspression signifikant i den mandlige, men ikke kvindelige nyre (fig. 6A).

Effekt af nyrespecifik AR-deletion på ammoniaktransportører Renal ammoniakudskillelse involverer koordineret NH3/NH4þ-transport af specifikke membranproteiner (10, 16, 52). Dette involverer transportører i den proksimale tubuli (NHE3), TAL af loopen af ​​Henle (NKCC2), og opsamlingskanalimmunolabel var ikke påviselig i ydre medullære proksimale tubulisegmenter (fig. 6C), som tidligere rapporteret (48). Vi brugte derefter kvantitativ immunhistokemi-analyse til at kvantificere segmentspecifikke ændringer i NBCe1-A-ekspression. Dette viste, at KS-AR KO i hanmus reducerede NBCe1-A-ekspression i PCT og cortical PST, dvs. i hele cortex (fig. 6D). Således regulerer AR-ekspression cortical proximal tubuli NBCe1-Et udtryk i den mandlige nyre, men ikke i den kvindelige nyre.

(Rhbg og Rhcg). Kønsforskelle i ammoniakudskillelse korrelerer med forskelle i ekspressionen af ​​hver af disse (6, 20), og testosteron regulerer ekspressionen af ​​både NHE3 og NKCC2 (22). NKCC2 medierer TAL ammoniak reabsorption (10, 16, 52). Hos hanmus øgede KS-AR-KO NKCC2-proteinekspression ved hjælp af immunblotanalyse signifikant; i hunmus var der ingen signifikant ændring (fig. 8). Denne ændring i ekspression i hanmus bidrager sandsynligvis til ændret medullær ammoniak-shunting og letter derved effekten af ​​KS-AR-KO til at øge ammoniakudskillelsen hos hanmus.

Rh-glykoproteiner Rhbg og Rhcg er de primære proteiner, der medierer opsamling af ammoniakudskillelse i kanalen, og deres ekspression svarer generelt til ændringer i ammoniakudskillelse (10, 16, 52). Imidlertid ændrede KS-AR-KO ikke signifikant Rhbg-proteinekspression i hverken han- eller hun-KS-AR-KO-mus i hverken cortex eller indre stribe af den ydre medulla (fig. 9). Virkningerne på Rhcg-ekspression var ens. Rhcg-immunhistokemi, evalueret kvalitativt og under anvendelse af kvantitativ immunhistokemi, viste ingen signifikante ændringer i Rhcg-immunomærkningsintensitet i interkalerede celler i den ydre stribe af den ydre medulla hos begge køn (fig. 10). Renal AR ser således ikke ud til at modulere hverken Rhbg- eller Rhcg-ekspression.

DISKUSSION

Denne undersøgelse giver vigtig ny information om mekanismen for, hvordan AR modulerer seksuelle dimorfismer i nyrerne. Fordi AR har adskillige ekstra-renale roller, hvilket kunne komplicere forståelsen af ​​dets rolle i nyren, skabte vi den første KS-AR-KO mus. KS-AR-KO hos hanmus øgede ammoniakudskillelsen, men reducerede dog total nyrestørrelse, proksimal tubulivolumendensitet og proksimal tubulicellehøjde, hvilket eliminerede tidligere identificerede kønsforskelle. Ekspressionen af ​​flere nøgleproteiner (PEPCK og NKCC2) involveret i ammoniakhåndtering blev øget af KS-AR-KO, hvilket sandsynligvis bidrager til den øgede ammoniakudskillelse. Samtidig blev ekspressionen af ​​andre proteiner (NHE3 og NBCe1-A) reduceret, hvilket vil have tendens til at sløve ændringer i ammoniakudskillelse. KS-AR-KO havde ingen påviselig effekt i hunmus eller i samlekanalen af ​​begge køn. Tabel 3 viser disse effekter. Disse resultater tyder på, at renal ammoniakhåndtering og proksimal tubulistruktur involverer nyre-AR-afhængige signalveje i cortex af den mandlige nyre, men ikke den kvindelige nyre og ikke i den ydre medulla af begge køn.

Det første store fund i denne undersøgelse er, at AR-ekspression medierer kønsforskelle i nyrestørrelse. Tidligere undersøgelser på mennesker, rotter og mus har vist, at hannyren er større end hunnyren (3, 56, 57). Det første bevis på, at dette involverede en testosteronafhængig signalvej var observationen, at overskydende androgenadministration kvalitativt øgede rotteproksimale tubulistørrelse (57). Yderligere beviser hos voksne mænd tyder på, at der er en dosisafhængig stigning i nyrevolumen, med en estimeret stigning på 4.04-cm3 pr. 100 mg ugentligt testosterontilskud (58). Vi har for nylig vist, at hanmus har større nyre- og proksimal tubulistørrelse end hunmus (20, 22), og at disse forskelle var testosteronafhængige (22). I overensstemmelse med disse tidligere resultater viser den nuværende undersøgelse, at hos hanmus regulerer renal AR-ekspression både hele nyre- og proksimale tubulistørrelse. Desuden resulterer KS-AR-KO i, at mandlig nyrestørrelse er den samme som hos kvinder med intakt AR-ekspression. Hos hanmus kan testosteron, der virker gennem nyre-AR-afhængige signalveje, helt forklare den seksuelle dimorfi i nyrerne og den proksimale tubulistørrelse.

Det andet store fund er, at kønsbaserede forskelle i ammoniakudskillelse medieres gennem AR-afhængige veje hos hanmus. Vores tidligere undersøgelser viste, at hunmus udskiller cirka dobbelt så meget urinammoniak som hanmus (20-22), bruger forskellige reaktionsveje til at reagere på syrebelastning (21), og at forskellen i basal ammoniakudskillelse involverer en testosteronafhængig mekanisme (22). Den nuværende undersøgelse udvider disse resultater ved at vise, at KS-AR-KO eliminerer den seksuelle dimorfi i ammoniakudskillelse. Ændringer i diætens faste syremængder kan ændre ammoniakudskillelsen, men ændringer i ammoniakudskillelsen hos mus med AR-deletion kan ikke tilskrives denne mekanisme, da KS-AR-KO ikke ændrede fødeindtagelsen. De fleste ændringer, der forekommer i ammoniakmetabolismen, såsom forekommer ved metabolisk acidose eller hypokaliæmi, resulterer i ændringer i nyre- og proksimale tubulistørrelse, som parallelt udskiller ammoniak (59-61). Hanmus med renal AR-deletion har dog øget ammoniakudskillelse, men nedsat total nyre- og proksimale tubulistørrelse, hvilket indikerer, at virkningen på ammoniakudskillelse ikke er et uspecifikt respons på ændringer i nyremasse. Denne inkongruente nyrestørrelse og ammoniakrespons som reaktion på renal AR-deletion svarer til resultaterne i vores tidligere undersøgelser ved hjælp af en gonadektomimodel, der evaluerede effekten af ​​testosteron (22). Hos hanmus regulerer testosteron, der virker gennem renal AR hos hanner, ammoniakudskillelse gennem veje, der ikke er relateret til virkninger på nyrestørrelse, proksimal tubulistørrelse og endogene syrebelastninger relateret til fødeindtagelse.

Størstedelen af ​​ammoniakdannelsen sker i den proksimale tubuli. Vores tidligere arbejde har identificeret seksuelle dimorfismer i proksimal tubuli ammoniakgenerering, der er afhængige af testis-afledt testosteron (22). Resultaterne af denne undersøgelse udvider disse resultater yderligere ved at vise, at nyre-AR hos hanmus regulerer ekspressionen af ​​det ammoniak-dannende enzym PEPCK, men ikke ammoniakgenanvendelsesenzymet GS. Denne effekt på PEPCK-ekspression er ikke en uspecifik effekt relateret til ændringer i proksimal tubulistørrelse, da virkningerne af renal AR-deletion på proksimal tubulistørrelse er den modsatte af dens virkninger på PEPCK-ekspression. Desuden indikerer opdagelsen af, at renal AR-deletion ikke ændrer GS-ekspression, at GS er reguleret gennem mekanismer, der er forskellige fra dem, der anvendes til PEPCK.

Ammoniak produceret i den proksimale tubuli udskilles fortrinsvis i luminalvæsken gennem en apikal NHE3-afhængig mekanisme (54, 55). Tidligere undersøgelser har vist, at tab af testosteron nedsætter NHE3-ekspression (22, 62). Resultaterne af denne undersøgelse udvider disse resultater yderligere ved at vise, at renal AR-deletion hos hanmus nedsætter ekspressionen af ​​NHE3. Testosteron, der virker gennem AR-aktivering, ser således ud til at øge NHE3-ekspression af kortikalt proksimalt tubulus. Det er dog vigtigt at erkende, at disse virkninger ikke er parallelle med ammoniakudskillelse og i stedet forventes at minimere de observerede ændringer i ammoniakudskillelse. I stedet, fordi NHE3 også er kritisk for filtreret NaCl og vand-reabsorption, kan disse effekter bidrage til den større proksimale tubuli-NaCl-reabsorption hos mænd (6, 7).

Ammoniakreabsorption i TAL etablerer den interstitielle ammoniakgradient, der er nødvendig for at opsamle ammoniaksekretion i kanalen (63, 64). Tidligere undersøgelser fra vores gruppe har vist, at NKCC2-ekspression er større hos hunmus end hos hanmus (20-22), at der er seksuel dimorfi i responsen af ​​NKCC2 på syrebelastning (21), og at forskellen i basal NKCC2-ekspression involverer en testosteronafhængig mekanisme (22). Den nuværende undersøgelse viser, at tab af renal AR hos hanmus øgede NKCC2-ekspression. Størrelsen af ​​denne effekt var næsten identisk med den forskel, vi har identificeret mellem han- og hunmus (20, 21), og i den aktuelle undersøgelse eliminerede den seksuelle dimorfi af NKCC2-ekspression. Desuden er den identificerede forskel mellem hanmus med intakt nyre-AR og AR-deletion parallel med vores tidligere identificerede forskelle mellem hanmus med orkiektomi sammenlignet med intakte og sham-opererede kontroller (24). Testosteron, der virker gennem AR, ser således ud til at mediere den seksuelle dimorfi i NKCC2-ekspression. Denne regulering ser dog ud til at være indirekte, da der ikke var nogen påviselig AR-udtryk i TAL i hverken vores tidligere rapport (22) eller i denne undersøgelse. En mulig indirekte mekanisme, der forklarer denne observation, er, at hos mænd fører AR-deletion til nedsat proksimal tubulistørrelse, der i kombination med nedsat proksimal tubulus-NHE3-ekspression øger øget opløst stof-levering til TAL, hvilket stimulerer NKCC2-ekspression.

Opsamling af ammoniakudskillelse i kanalen er den væsentligste determinant for udskillelse af ammoniak i urinen, og Rh-glykoproteinerne Rhbg og Rhcg er de primære transportører af ammoniak i kanalen (16, 65-68). Vi har tidligere vist seksuelle dimorfismer i opsamlingskanalvolumenetæthed og ekspression af Rh-glykoproteinerne, hvor hunmus har større opsamlingskanalvolumentæthed, interkaleret cellestørrelse og Rhbg- og Rhcg-ekspression (20). Den nuværende undersøgelse fandt ingen påviselige ændringer i opsamlingsrørvolumendensitet eller Rhbg- og Rhcg-ekspression som respons på KS-AR-KO hos hverken han- eller hunmus. Dette er parallelt med den manglende effekt af testosteronmangel, induceret af orkiektomi, på opsamling af kanalvolumenetæthed, interkaleret cellestørrelse og Rhbg- og Rhcg-ekspression (22). Vi konkluderer, at den seksuelle dimorfisme i opsamlingskanalen opstår gennem mekanismer, der ikke involverer testosteron og AR-afhængige signalveje.

Den ydre medulla ser ud til at reagere anderledes på køn, testosteron og AR end cortex. I modsætning til nyrebarken er der i den ydre medulla ingen seksuel dimorfi i proksimal tubuli volumen tæthed eller proksimal tubuli højde (20), ingen effekt af orkiektomi-induceret testosteron mangel på disse parametre (22), og ingen effekt af renal. AR deletion (nuværende undersøgelse). Denne manglende effekt af sex-, testosteron- og AR-ekspression skyldes ikke fraværet af AR-ekspression, da vi har vist AR-ekspression gennem hele den proksimale tubuli, inklusive i den ydre medulla (22). At forstå de mekanismer, der ligger til grund for denne aksiale forskel i den proksimale tubuli-respons på sex, testosteron og AR vil være en vigtig vej for fremtidig undersøgelse.

En sidste observation er, at AR-deletion ikke havde påviselige virkninger på den kvindelige nyre. AR er til stede i hele den proksimale tubuli hos begge køn, og selvom den udtrykkes ved lavere niveauer hos kvinder, var den absolutte forskel i udtryk kun - 50 procent (22). Dels kunne manglen på effekt af AR-deletion indikere nedsat AR-aktivering ved cirkulerende testosteron, hvilket, som vist i denne undersøgelse, er væsentligt mindre hos kvinder end hos mænd. Immunhistokemi indikerer imidlertid væsentlig nuklear AR-lokalisering i den kvindelige nyre (Ref. 22 og nærværende undersøgelse), hvilket typisk indikerer aktivering af AR-afhængige signaleringsprocesser. Disse observationer antyder muligheden for, at andre kønsafhængige forskelle forringer AR-afhængige signalmekanismer i den kvindelige proksimale tubuli.

Perspektiver og betydning

En bedre forståelse af mekanismen og de biologiske implikationer af køns effekt på nyrestrukturen og ammoniakmetabolisme er afgørende for at optimere vores evne til at tage sig af både mænd og kvinder med syre-base-forstyrrelser. På trods af de seneste fremskridt i vores forståelse af virkningen af ​​sex på ammoniakmetabolisme og rollen af ​​renal AR, er der behov for yderligere undersøgelser. Der er helt sikkert testosteron-uafhængige virkninger af sex, hvis mekanisme er ufuldstændigt forstået på nuværende tidspunkt. Hvorvidt dette involverer direkte effekter af andre kønssteroidhormoner, såsom østrogener eller progesteron, indirekte effekter af proksimal tubulus AR-aktivering eller virkninger af kønskromosomer, der er uafhængige af gonadale hormoner, vil være vigtige spørgsmål for fremtidige undersøgelser at tage fat på.

cistanche lindrer nyreproblemer og forbedrer knyrefunktion

ANKENDELSER

Vi takker Dr. Sharon W. Matthews og Chao Chen (University of Florida, College of Medicine Electron Microscopy Core Laboratory) for fremragende vævsbehandling til vores immunhistokemiske eksperimenter. Vi takker University of Virginia School of Medicine Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core for måling af serumtestosteronniveauer. Vi takker Dr. Gail Prins for at levere anti-AR-antistoffer og for deres ekspertise i AR.

OPLYSNINGER

Ingen interessekonflikter, økonomiske eller andet, erklæres af forfatterne.

FORFATTERS BIDRAG

ANH og IDW udtænkte og designede forskning; ANH, RAC, H.-WL og JWV udførte eksperimenter; ANH, RAC, H.-WL, JWV og IDW analyserede data; ANH, RAC, JWV og IDW fortolkede resultater af eksperimenter; ANH udarbejdede tal; ANH udarbejdede manuskriptet; ANH, RAC, H.-WL, JWV og IDW redigerede og reviderede manuskriptet; ANH, RAC, H.-WL, JWV og IDW godkendte den endelige version af manuskriptet.

REFERENCER

1. Institut for Medicin Udvalg for forståelse af kønsbiologi og køn D; Wizemann TM, Pardue ML (Redaktører). Udforskning af de biologiske bidrag til menneskers sundhed: Betyder sex noget? Washington, DC: National Academies Press, 2001. doi:10.17226/ 10028.

2. Karp NA, Mason J, Beaudet AL, Benjamini Y, Bower L, Braun RE, et al. Forekomst af seksuel dimorfi i pattedyrs fænotypiske træk. Nat Commun 8: 15475, 2017. doi:10.1038/ncomms15475.

3. Sabolić I, Asif AR, Budach WE, Wanke C, Bahn A, Burckhardt G. Kønsforskelle i nyrefunktion. Pflugers Arch 455: 397-429,b2007. doi:10.1007/s00424-007-0308-1.

4. Ramirez LA, Sullivan JC. Kønsforskelle i hypertension: hvor vi har været, og hvor vi skal hen. Am J Hypertens 31: 1247-1254,2018. doi:10.1093/ajh/hpy148.

5. Layton AT, Sullivan JC. Nylige fremskridt i kønsforskelle i nyrefunktion. Am J Physiol Renal Physiol 316: F328–F331, 2019. doi:10.1152/ajprenal.00584.2018.

6. Veritas LC, Girardi ACC, Curry J, Pei L, Ralph DL, Tran A, Castelo-Branco RC, Pastor-Soler N, Arranz CT, Yu ASL, McDonough AA. Det seksuelle dimorfe mønster af nyretransportører og elektrolythomeostase. J Am Soc Nephrol 28: 3504–3517, 2017. doi:10.1681/ASN.

7. Li Q, McDonough AA, Layton HE, Layton AT. Funktionelle implikationer af seksuel dimorfi af transportørmønstre sammen med rottens proksimale tubuli: modellering og analyse. Am J Physiol Renal Physiol 315: F692–F700, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00171.2018.

8. Mitch WE. Metaboliske og kliniske konsekvenser af metabolisk acidose. J Nephrol 19 Suppl 9: S70–S75, 2006.

9. Hamm LL, Nakhoul N, Hering-Smith KS. Syre-base homeostase. Clin J Am Soc Nephrol 10: 2232–2242, 2015. doi:10.2215/ CJN.07400715.

10. Weiner ID, Mitch WE, Sands JM. Urea- og ammoniakmetabolisme og kontrol af renal nitrogenudskillelse. Clin J Am Soc Nephrol 10: 1444–1458, 2015. doi:10.2215/CJN.10311013.

11. Forkert O, Davies HE. Udskillelse af syre ved nyresygdom. QJ Med 28: 259-313, 1959.

12. Baertl JM, Sancetta SM, Gabuzda GJ. Relation mellem akut kaliumdepletering og renal ammoniummetabolisme hos patienter med cirrhose. J Clin Invest 42: 696–706, 1963. doi:10.1172/JCI104761.

13. Maher T, Schambelan M, Kurtz I, Hunter HN, Jones JW, Sebastian A. Forbedring af metabolisk acidose ved diætkaliumrestriktion hos hyperkalæmiske patienter med kronisk nyreinsufficiens. J Lab Clin Med 103: 432-445, 1984.

14. Shear L, Gabuzda GJ. Kaliummangel og endogen ammoniumoverbelastning fra nyrerne. Am J Clin Nutr 23: 614–618, 1970. doi:10.1093/acne/23.5.614. F642 AJP-Renal Physiol doi:10.1152/ajprenal.00260.2021 www.ajprenal.org

15. Tannen RL, McGill J. Indflydelse af kalium på renal ammoniakproduktion. Am J Physiol 231: 1178-1184, 1976. doi:10.1152/ajplegacy. 1976.231.4.1178.

16. Weiner ID, Verlander JW. Ammoniaktransportører og deres rolle i syre-base balance. Physiol Rev 97: 465–494, 2017. doi:10.1152/ physrev.00011.2016.

17. Kovesdy CP, Anderson JE, Kalantar-Zadeh K. Sammenslutning af serumbicarbonatniveauer med dødelighed hos patienter med ikke-dialyseafhængig CKD. Nephrol Dial Transplant 24: 1232–1237, 2009. doi:10.1093/ndt/gfn633.

18. Navaneethan SD, Schold JD, Arrigain S, Jolly SE, Wehbe E, Raina R, Simon JF, Srinivas TR, Jain A, Schreiber MJ Jr, Nally JV Jr. Serumbicarbonat og dødelighed i trin 3 og trin 4 kronisk nyresygdom . Clin J Am Soc Nephrol 6: 2395-2402, 2011.

19. Raphael KL, Murphy RA, Shlipak MG, Satterfield S, Huston HK, Sebastian A, Sellmeyer DE, Patel KV, Newman AB, Sarnak MJ, Ix JH, Fried LF; Sundhed ABC undersøgelse. Bicarbonatkoncentration, syre-basestatus og dødelighed i undersøgelsen om sundhed, aldring og kropssammensætning. Clin J Am Soc Nephrol 11: 308-316, 2016.

20. Harris AN, Lee HW, Osis G, Fang L, Webster KL, Verlander JW, Weiner ID. Forskelle i renal ammoniakmetabolisme i mandlige og kvindelige nyrer. Am J Physiol Renal Physiol 315: F211–F222, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00084.2018.