Forskningsfremskridt og anvendelser af fluorescerende proteinantistoffer: En gennemgang med fokus på nanostoffer

Abstrakt: Siden opdagelsen af ​​fluorescerende proteiner (FP'er) har deres rige fluorescensspektre og fotokemiske egenskaber fremmet udbredte biologiske forskningsapplikationer. FP'er kan klassificeres i grønt fluorescerende protein (GFP) og dets derivater, rødt fluorescerende protein (RFP) og dets derivater og nær-infrarøde FP'er. Med den kontinuerlige udvikling af FP'er er antistoffer rettet mod FP'er opstået. Antistoffet, en klasse af immunoglobuliner, er hovedkomponenten i humoral immunitet, der eksplicit genkender og binder antigener. Monoklonalt antistof, der stammer fra en enkelt B-celle, er blevet anvendt i vid udstrækning i immunoassay, in vitro-diagnostik og lægemiddeludvikling. Nanobody er en ny type antistof, der udelukkende består af det variable domæne af et tungkædet antistof. Sammenlignet med konventionelle antistoffer kan disse små og stabile nanostoffer udtrykkes og fungere i levende celler. Derudover kan de nemt få adgang til riller, sømme eller skjulte antigene epitoper på overfladen af ​​målet. Denne gennemgang giver et overblik over forskellige FP'er, forskningsfremskridtene for deres antistoffer, især nanobodies, og avancerede anvendelser af nanobodies rettet mod FP'er. Denne anmeldelse vil være nyttig for yderligere forskning i nanobodies rettet mod FP'er, hvilket gør FP'er mere værdifulde i biologisk forskning.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Nøgleord: fluorescerende protein; monoklonalt antistof; nanobody; forskningsfremskridt; Ansøgning

1. Introduktion

Fluorescerende protein (FP) er det mest almindeligt anvendte værktøjsprotein i biomedicinsk forskning. Efter den øgede brug af FP er der også udviklet FP-antistoffer. Sammenlignet med det traditionelle antistof (Figur 1A), mangler tungkædede antistoffer (HCAb) fra camelid (Figur 1B) og immunoglobulin nye antigenreceptorer (IgNAR) fra hajer (Figur 1C) naturligt lette kæder. Single-domæne antistof (sdAb) er et antistof, der udelukkende består af variable domæner af HCAb eller IgNAR. Dens molekylvægt er 12-15 kDa, hvilket er omkring 1/10 af størrelsen af ​​et monoklonalt antistof; derfor omtales det også som en nanobody. Nanokroppen, med en mindre størrelse, høj stabilitet mod syre og varme, stærk penetrationsevne, let genteknologi og ekspression og høj affinitet, er blevet anvendt på forskellige områder af videnskabelige forskere. Det kan nemt få adgang til riller, sømme eller skjulte antigene epitoper på overfladen af ​​målet, og genkender mange antigener, som konventionelle antistoffer ikke kan genkende [1]. Derfor er nanostoffer blevet brugt som biomolekyler i organismer og cellekultursystemer i udviklingsbiologi, krystallinske chaperoner til konformationstilstanden i stabil biologi, regulatorer eller inhibitorer af enzymaktivitet, immunhistokemiske reagenser til biokemisk analyse og sekundære antistoffer i immunblotting og immunfluorescens [2] –6]. Nanobodies, der specifikt binder FP, bruges i vid udstrækning i subcellulær lokalisering, intracellulære signalvejsundersøgelser, levende cellebilleddannelse og målrettede nanomaterialer [7-9]. Især nanobodies har unikke fordele i forhold til traditionelle IgG-antistoffer i super høj opløsning billeddannelse.

Figur 1. Strukturdiagrammer af IgG (A), camelid HCAb (B) og haj IgNAR (C). VH, den variable region af tung kæde; VL, den variable region af let kæde; CH/C, den konstante region af tung kæde; CL, den konstante region af let kæde; VHH, det variable domæne af HCAb; VNAR, det variable domæne af IgNAR.

2. Oversigt over fluorescerende proteiner

2.1. Opdagelsen af ​​fluorescerende proteiner

Luminescens er et almindeligt fænomen i marine hvirvelløse dyr. Coelenterater, herunder vandmænd, hydra og koraller, udsender grøn fluorescens under ultraviolet (UV) eller blåt lys, mens ctenophorer udsender blå fluorescens. Grønt fluorescerende protein (GFP) blev først identificeret i Aequorea victoria af Shimomura et al. i 1962 [10], og derefter klonet og udtrykt i 1985 [11]. De unikke egenskaber og stabile struktur af vildtype GFP (wtGFP) har derfor tiltrukket mange forskere til at studere det. Siden da, baseret på den eksisterende viden og dens krystalstruktur, genererede Tisen og hans kolleger forskellige GFP-proteiner med forskellige fluorescerende egenskaber ved mutation og udviklede luminescensmekanismen for GFP [12]. Med hensyn til GFP-relateret forskning vandt tre videnskabsmænd (Shimomura, Chalfie og Tsien) Nobelprisen i kemi i 2008 for at opdage GFP og deres fremragende bidrag til dets anvendelse.

Ancestralt rødt fluorescerende protein (RFP), nemlig DsRed, blev klonet fra ikke-bioluminescerende revkoraller i 1999 [13]. RFP kan bruges sammen med GFP til at løse videnskabelige problemer, som GFP ikke alene kan løse. Vigtigst af alt, på grund af den lave baggrund af RFP i intracellulær billeddannelse, er det mere velegnet til anvendelser inden for biovidenskabelig forskning [14,15]. Med mange forskeres indsats er fluorescensspektrene for FP'er blevet rapporteret at dække hele den synlige region og endda den nær-infrarøde region, hvilket giver et væld af værktøjer til at visualisere og kvantificere proteiner i levende celler [16]. Figur 2 opsummerer udviklingen af ​​FP'er.

Figur 2. Udviklingen af ​​fluorescerende proteiner. GFP, grønt fluorescerende protein; BFP, blåt fluorescerende protein; EGFP, forstærket grønt fluorescerende protein; YFP, gult fluorescerende protein; RFP, rødt fluorescerende protein; VHH, variabelt domæne af tung kæde; VNAR, variabel ny antigenreceptor. Den lysegrønne markør angiver fremskridt for forskningen i GFP-anvendelse, og den gulgrønne markør angiver fremskridtene i forskningen på GFP-antistof.

2.2. Struktur og funktionelle egenskaber af GFP

GFP er en naturligt forekommende, kugleformet og opløselig sur FP. Den primære struktur af GFP består af en monomer sammensat af 238 aminosyrerester med en molekylvægt på 27-30 kDa. Dens krystalstruktur viser et center dannet af 11 anti-parallelle kæder, der danner en cylindrisk, tætpakket tøndestruktur. -tønde-centret er beskyttet af en lysemitterende gruppe af 4-(p-hydroxybenzyliden)-5-imidazolinon forbundet til dets -helix, med begge ender forseglet af korte -helix-segmenter [17,18]. Modningen af ​​kromoforen kræver ingen anden cofaktor end O2 [19]. GFP absorberer blåt lys eller UV-lys og udsender grøn fluorescens, med den primære excitationsspids ved 395 nm, den laveste excitationstop ved 475 nm og emissionstoppen ved 509 nm. GFP er ekstremt stabilt og kan nemt modstå højtemperaturbehandling. Formaldehydfiksering eller paraffinindlejring påvirker ikke dets fluorescensegenskaber. Gennem den dybtgående undersøgelse af FP'ers struktur og modningsprocessen redesigner flere og flere forskere strukturen af ​​FP'er for at give dem nye funktioner og egenskaber, hvilket yderligere fremmer deres udvikling og anvendelse.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

2.3. GFP-derivater

De begrænsende faktorer i GFP-applikationer er pH, chloridionfølsomhed og dårlig fotostabilitet. Målrettede modifikationer af GFP korrigerer disse fejl, hvilket øger dets kvanteudbytte, lysstyrke, molære ekstinktionskoefficient og fotostabilitet. Derudover er der etableret adskillige GFP-derivater for at udvide rækken af ​​udsendte farver, herunder blå, ultramarin, cyan og gul.

Som reaktion på den lave fluorescensintensitet af wtGFP under blålys-excitation og dets ustabile ekspression i pattedyrsceller, Zhang et al. konstrueret en aminosyresubstitution af GFP (F64L og S65T), nemlig forstærket GFP (EGFP), hvis fluorescensintensitet øges med 35-fold [20]. EGFP forbliver den mest almindeligt anvendte FP-mutant i området med grønt lys på grund af dens gode fotostabilitet og høje lysstyrke. Derudover er foldeegenskaberne for GFP blevet optimeret, hvilket giver en superfolder GFP (sfGFP) med superfoldningsevne. sfGFP har seks nye mutationer, herunder S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V og A206V. sfGFP kan effektivt folde, selv når det udtrykkes i fusion med uopløselige proteiner, hvilket sikrer lysstyrken af ​​dets fluorescens [21]. GFPuv, en anden modificeret form for GFP, er optimeret til fluorescens under UV-lys. Det genererer lysere grøn fluorescens i nærvær af UV-lys med en excitationstop ved 395 nm og en emissionstop ved 509 nm og kan bruges til at udpege placeringen af ​​forskellige intracellulære proteiner [22,23]. Tre aminosyresubstitutioner forekommer i GFPuv, herunder F99S, M153T og V163A. Disse mutationer inducerer en 18-fold stærkere ekspression af GFPuv end wtGFP i E. coli. GFPuv-genet er et syntetisk gen, hvor de fem lavfrekvente Arg-kodoner er erstattet af kodoner, der er egnede til E. coli for at sikre effektiv ekspression af GFPuv.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Den stedsrettede mutation af Y66H konstruerer det blå fluorescerende protein (BFP) med en excitationstop ved 384 nm og en emissionstop ved ~445 nm. Dets excitationsspektrum er tæt på UV-lys, som beskadiger celler under drift, og dets korte emissionsbølgelængde inducerer autofluorescens i celler. Enhanced BFP (EBFP) er svagt selvlysende og dårligt modstandsdygtig over for fotoblegning og syre, med et højt baggrundssignal til cellulær billeddannelse. Tre lysere EBFP-mutanter er blevet udviklet, inklusive Azurite [24], EBFP2 [25] og mTagBFP [26], som er 1.6-, 2.0- og 3.{{13} }fold lysere end EBFP, henholdsvis. mTagBFP, den lyseste BFP, er afledt af en mutant af det røde fluorescerende protein (RFP) TagRFP [27], med en ekstinktionskoefficient på 52,000 M−1 cm−1 og et kvanteudbytte på {{19 }}.63, hvilket væsentligt forbedrer dens modstandsdygtighed over for fotoblegning. Mutation af Y66F i wtGFP resulterer i et ultramarint fluorescerende protein med en emissionsbølgelængde på 442 nm [28]. Imidlertid begrænser det lave fluorescenskvanteudbytte af GFP-Y66F-varianten alvorligt dets anvendelighed i billeddannelse. Yderligere mutation af GFP-Y66F med aminosyresubstitutioner af T65Q, Y145G, H148S og T203V resulterer i det ultramarine fluorescerende protein Sirius, som er 25 gange lysere end GFP-Y66F [29].

Cyan fluorescerende protein (CFP) har en excitationstop ved 449 nm og en emissionstop ved ~482 nm, med spektrale egenskaber, der spænder mellem BFP og EGFP. På samme måde som BFP bruges en stedstyret mutation af Y66W til at konstruere CFP. CFP har brede anvendelsesmuligheder inden for flerfarvet billeddannelse og lokaliseringsforskning på grund af dets enestående fotostabilitet. For eksempel er genet, der koder for CFP, blevet optimeret til human kodonpræference og er nu kommercielt tilgængeligt under handelsnavnet AmCyan1 (Clontech). Derudover er der flere mutanter, der er lysere end forbedret CFP (ECFP), såsom Cerulean, mTFP (dobbelt så lys som Cerulean) og turkis (omkring dobbelt så lys som ECFP) [21,30].

Mutationer i det gule fluorescerende protein (YFP) er ikke begrænset i kernemotivet af kromoforen Y66, men i rester, der strukturelt støder op til Y66. Excitationstoppen for YFP er ~518 nm, med en emissionstop på ~531 nm. Sammenlignet med GFP skifter fluorescensen af ​​YFP mod det røde spektrum, hvilket hovedsageligt skyldes substitutionen af ​​Thr med Tyr i position 203. Enhanced YFP (EYFP) er en af ​​de mest fluorescerende og udstrakt anvendte FP-biosensorer til at detektere intracellulær pH ​​og chloridionkoncentrationer. Det er dog meget modtageligt for syre- og chloridioner og er mindre fotostabilt end mange vandmænd-afledte FP'er [31]. mCitrine og mVenus, forbedrede versioner af EYFP, er i øjeblikket de mest brugte YFP [32,33]. De fotofysiske egenskaber af GFP og dets derivater er opsummeret i tabel 1.

Tabel 1. Fotofysiske egenskaber af GFP, RFP og deres derivater.

Tabel 1. Forts.

2.4. RFP-derivater

RFP er en anden meget brugt FP. DsRed er en tetramer, der har tendens til at danne multimerer, når de udfører proteinfusioner og kan være giftig, når den udtrykkes intracellulært, så den er blevet konstrueret til at opnå monomerer. Den mest bemærkelsesværdige RFP er "mFruit"-familien, herunder mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine og mStrawberry (tabel 1), hvoraf mCherry, med mutationer af K163Q og K83L, er den mest foretrukne. mCherry har hurtig modning, gode monomere egenskaber og bedre fotostabilitet, selvom det er mindre lyst [34]. TagRFP i sin monomerform er dog omkring tre til fire gange lysere end mCherry, hvilket gør det til en relativt lysstærk monomer RFP, der i øjeblikket er tilgængelig [27]. mKate er et hidtil ukendt monomert langt rødt fluorescerende protein afledt af en fire-site mutation af TagRFP med en excitationstop ved 588 nm og en emissionstop ved 635 nm, hvilket kun er 45 % så lysende som EGFP; dets dimeriseringsprotein, Katushka, er 67 % så lyst som EGFP [35]. mKate2, en mutant af mKate med aminosyresubstitutioner af V38A, S165A og K238R, har omtrent dobbelt så stor lysstyrke som mKate [36]. Sammenlignet med GFP og RFP udviser mKate og Katushka bedre billeddybde og rigere optiske signaler til intra-objekt fluorescensbilleddannelse [35]. Derfor er udvikling af langt røde fluorescerende proteiner mere værdifuldt til in vivo bioimaging.

2.5. Nær-infrarøde FP'er

Nær-infrarøde (NIR) FP'er er meget ønskede som proteinmærker i billedbehandlingsapplikationer. De fleste NIR FP'er er designet ud fra bakterielle phytochrome fotoreceptorer (BphP'er) [37]. Den første NIR FP, der bruges til billeddannelse af levende dyr, er IFP1.4, et fluorescerende protein afledt af BphP, der fluorescerer ved at binde til en biliverdin (BV) kromofor [38]. Ved DNA-shuffling og tilfældig mutagenese udvikles derefter en lysere IFP2.0 [39]. Selvom monomer IFP1.4 og IFP2.0 kan opnås ved at bryde dimeriseringsgrænsefladen for BphP, har de stadig en tendens til at dimerisere ved høje koncentrationer. Et naturligt monomert infrarødt fluorescerende protein (IFP), mIFP, blev designet i 2015 [40]. mIFP har vist sig at have lydbilleddannelseseffekter i Drosophila-larver og neuroner. Shcherbakova et al. designet tre lyse monomere NIR FP'er med forskellige spektre, nemlig miRFP670, miRFP703 og miRFP709 [41]. De BphP-afledte NIR FP'er kræver minimalt to domæner, PAS (Per-ARNT-Sim) og GAF (cGMP phosphodiesterase-adenylate cyclase-FhlA), for kovalent at vedhæfte en BV-kromofor og har også en kompleks "8-knudes" struktur topologisk forbinder GAF- og PAS-domænerne, hvilket påvirker deres foldning. Derfor bruges en anden klasse af bakterielle fotoreceptorer, allophycocyaniner (APC'er), til at konstruere NIR FP'er, såsom smURFP [42]. Selvom APC-baserede NIR FP'er er mindre, binder de BV mindre effektivt, hvilket fører til signifikant lavere lysstyrke i pattedyrceller end BphP-afledte NIR FP'er. For at overvinde defekterne af BphP- og APC-baserede NIR FP'er blev en enkelt-domæne NIR FP ved navn miRFP670nano udviklet fra cyanobakteriochrome (CBCR), der repræsenterer den første CBCR-afledte NIR FP, der effektivt kan binde endogen BV kromofor og udsende i lys fluorescens pattedyrsceller [43]. En væsentlig fordel ved miRFP670nano i forhold til BphP-afledte NIR FP'er er høj fotostabilitet. Den forbedrede miRFP670nano3, med 14 mutationer i forhold til den forældrelige miRFP670nano, udviser lignende fotostabilitet som miRFP670nano [44]. Tabel 2 opsummerer de fotofysiske egenskaber af NIR FP'er.

Tabel 2. Fotofysiske egenskaber af NIR FP'er.

Opdagelsen og anvendelsen af ​​FP'er har givet et stærkt forskningsværktøj til moderne biologi. I dag er FP'er blevet et af de almindelige værktøjer, videnskabsmænd bruger til at udvide deres anvendelser til mange forskningsområder, såsom genekspressionsregulering, organelmærkning, signaltransmission, lægemiddelscreening og biomolekylære interaktioner. De fleste kloningsvektorer, der udtrykker FP'er, er blevet kommercialiseret og er tilgængelige gennem kommercielle virksomheder.

3. Forskningsfremskridt om fluorescerende proteinantistof

3.1. Monoklonalt antistof rettet mod fluorescerende proteiner

Antistof er en slags immunglobulin udskilt af B-lymfocytter. Monoklonale antistoffer består af to tunge kæder og to lette kæder, hvor den tunge kæde består af én variabel region (VH) og tre konstante regioner (CH), og den lette kæde består af én variabel region (VL) og én konstant region (CL) ). De tunge kæder er kovalent bundet af disulfidbindinger, og CL-regionen af ​​den lette kæde er ikke-kovalent bundet til CH1-domænet af den tunge kæde for at danne et stabilt antistofmolekyle [45]. På grund af deres specifikke receptorbindingskapacitet producerer monoklonale antistoffer en række biologiske aktiviteter, såsom klassisk blokering, neutralisering, komplementaktivering, drab af målceller gennem Fc-receptoren og regulering af immunaktivitet. De er kritiske biologiske makromolekyler, der i vid udstrækning anvendes i immunassay, in vitro-diagnostik og lægemiddeludvikling. Polyklonale antistoffer er en blanding af heterotypiske antistoffer afledt af immunresponsprocessen fra flere B-celler, og hvert antistof genkender en anden epitop af det samme antigen [45]. Sammenlignet med polyklonale antistoffer detekterer monoklonale antistoffer specifikt en epitop på antigenet og er mindre tilbøjelige til at krydsreagere med andre proteiner og producerer således lave baggrundsfarvningssignaler. Desuden er reproducerbarheden af ​​resultater vedrørende monoklonale antistoffer højere end for polyklonale antistoffer under de samme eksperimentelle betingelser.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90 %) oprenses ved hjælp af en ligetil 2-trinsteknik ved anvendelse af mAb FMU-GFP.5-koblet Sepharose 4B-harpiks. Derudover kan alle de funktionelle rekombinante målproteiner koblet til GFP nemt og direkte isoleres fra celler på grund af GFP-epitopen. Disse data tyder på, at denne metode er mere effektiv til at rense GFP end nogen tilgængelig metode og løser det lave udbytte og renhedsudfordringen i de fleste GFP-oprensningsmetoder.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

3.2. Nanobody rettet mod fluorescerende proteiner

3.2.1. Introduktion af Nanobody

Monoklonale antistoffers iboende egenskaber, såsom deres store molekylvægt, komplekse struktur og begrænsede biologiske aktivitet, har i stigende grad begrænset deres videre anvendelse. Derfor haster det med at udvikle alternativer til monoklonale antistoffer. I 1989, Ward et al. fremstillede et variabelt domæne af kun tungkædet antistof med svag bindingsevne mod lysozym, hvilket øgede interessen for sdAb-forskning [48]. I 1993, Hamers Casterman et al. opdagede for første gang en ny type antistof i kamelserum, som er helt anderledes end det traditionelle pattedyrsantistof [49]. Denne type antistof kaldes HCAb på grund af dens naturlige mangel på lette kæder. HCAb består af CH2, CH3, hængselregionen og det variable domæne af HCAb (VHH), men det har stadig fuld antigenbindingskapacitet. I 1995, Greenberg et al. opdagede kun tung-kæde antistoffer, kendt som IgNAR, i nurse shark [50]. Det findes i både sekretoriske og membranbundne former og består af en variabel region, kaldet variabel ny antigenreceptor (VNAR), og flere konstante regioner. Efterfølgende er IgNAR blevet fundet i wobbegonghaj, piggehaj, hornhaj og hvidplettet bambushaj, hvilket supplerer sdAbs-repertoiret. En nanobody besidder egenskaberne med lille molekylvægt, høj affinitet, stærk stabilitet, god opløselighed, stærk vævsgennemtrængning og genkendelse af skjulte antigenepitoper. Det har tiltrukket sig øget opmærksomhed i sygdomsdiagnostik, immunreagenser, patogendetektion og lægemiddeludvikling [51]. Med udviklingen af ​​molekylærbiologiske teknikker og forbedringen af ​​genetisk manipuleret antistofpræparatteknologi er nanobody blevet et populært forskningsfelt inden for immunoassay. Figur 3 opsummerer udviklingen af ​​nanobody til dato.

Figur 3. Udviklingen af ​​nanobody. Den lyseblå markør indikerer fremskridtene i forskningen om nanobody-lægemidler. FDA, Food and Drug Administration; EMA, Det Europæiske Lægemiddelagentur; NMPA, National Medical Products Administration; HCAb, tung-kæde antistof; IgNAR, Ig nye antigenreceptorer; sdAb, enkelt domæne antistof; VHH, variabelt domæne af HCAb; VNAR, variabelt domæne af IgNAR; PD-L1, programmeret celledød 1 ligand 1.

3.2.2. Nanobody rettet mod fluorescerende proteiner

Fluorescerende proteiner har ændret cellebiologi og biokemi ved at tilbyde enkle at bruge genkodede fluorescerende proteinmarkører. Adskillige tætte bindemidler til forskning og lægemiddelmål er blevet udviklet gennem syntese og udvælgelse af proteinstilladsbiblioteker under parallel udvikling [52]. Et eksempel er udviklingen af ​​nanobody, som er lettere at vælge med forbedret stabilitet, opløselighed og udbytte [53]. I modsætning til traditionelle antistoffer er disse små og stabile nanostoffer funktionelle i levende celler. Derfor er nanobody med specifik bindingsaktivitet til FP et potent værktøj til FP-fusion, separation og cellulær konstruktion inden for forskellige områder af biologisk forskning.

• Camelidae-afledte nanobodies rettet mod GFP

Forskellige proteiner med fremragende subcellulære lokaliseringskarakteristika er blevet fusioneret til GFP, hvilket skaber visuelle antigener til at detektere proteiner direkte i forskellige subcellulære rum. I 2006, Rothbauer et al. screenede et GFP-specifikt antistoffragment (cAbGFP4) ved at immunisere alpaca med GFP [54]. Overfladeplasmonresonansassayet (SPR) af interaktionen mellem cAbGFP4 og GFP-antigenet viste en høj affinitet (KD=0.23 nM). Derudover blev anti-GFP-nanostoffet kombineret med en monomer RFP, hvilket producerede det synlige GFP-bindende antistof, der blev anvendt til at undersøge fordelingen af ​​anti-GFP-nanostoffet i levende celler. Ved gelfiltrering, immunoblotting og konfokale mikroskopi-assays blev GFP-specifikt nanobody påvist at være stabilt fordelt i pattedyrsceller uden påviselig proteinnedbrydning eller aggregering, der almindeligvis findes med enkeltkædede variable fragmenter. Endvidere har Kubala et al. karakteriseret GFP:cAbGFP4-komplekset (figur 4A) ved røntgenkrystallografi og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) [55], hvilket afslører grundlaget for høj affinitet og specificitet af nanostoffer i proteinbinding. I 2020 blev fire forskellige anti-GFP nanobodies, betegnet A12, B9, D5 og E6, identificeret ved hjælp af fagdisplay [56]. Native PAGE og immunpræcipitationsassays afslørede, at disse nanobodies kunne binde GFP in vitro og in vivo.

Figur 4. Diagram af GFP-nanobody-kompleks. (A) cAbGFP4 (PDB:3OGO, orange); (B) GBP1 (PDB: 3K1K, lyseblå); (C) GBP4 (PDB: 3G9A, pink); (D) LaG16 (PDB: 6LR7, gul); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53, magenta). (F) Strukturel superposition af ovennævnte nanobodies med GFP-kompleks. GFP er vist i grøn farve.

Proteinkonformation er tæt forbundet med funktion og styres normalt af regulatoriske faktorer. Axel et al. identificerede syv GFP-specifikke bindere, nemlig GFP-bindende proteiner (GBP'er) 1-7 [57]. Blandt dem øgede GBP1 GFP-fluorescensen med 10-fold, mens GBP4 inducerede et 5-fold fald i GFP-fluorescensen; derfor blev disse omtalt som henholdsvis "forstærkere" og "minimeringsmidler". Strukturelle analyser af GFP-nanobody-komplekset (figur 4B, C) viste, at de to nanobodies forårsagede beskedne modsatrettede ændringer i kromoformiljøet, hvilket ændrede dets absorptionsegenskaber [58]. Endvidere blev 25 GFP-specifikke nanobodies (LaG'er) identificeret med KD-værdier fra 0.5 nM til over 20 µM [59]. Et bivalent nanolegeme (LaG-16-LaG-2) viste den højeste affinitet med en KD-værdi på 36 pM. Desuden steg den maksimale fluorescensintensitet af GFP med ~60%, når den blev inkuberet med overskydende LaG-protein. Zhang et al. rapporterede krystalstrukturen af ​​GFPuv kompleksdannet med LaG16 (figur 4D) ved 1,67 Å opløsning [60]. Bindingsstedet for LaG16 på GFP-tønden var placeret på den anden side af GFP-enhanceren. Derfor blev LaG16 og GFP-enhancer fusioneret med en (GS)4-linker. Det bivalente nanolegeme havde en affinitet på 0,5 nM, hvilket demonstrerer muligheden for at designe målproteinbindere med ultrahøj affinitet ved dimerisering af 2 nanobodies, der binder med forskellige epitoper.

I 2014, Twair et al. forberedte sfGFP og immuniserede en voksen enpuklet kamel. Syv anti-sfGFP nanobodies rettet mod tre epitoper (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 og 08) blev isoleret [61]. Baseret på ELISA og immunblotting-assays genkendte disse nanobodies sfGFP mærket som frit eller fusioneret til væksthormon. Derudover blev krystalstrukturen af ​​nanobody NbsfGFP02 kompleksdannet med sfGFP (figur 4E) etableret med en opløsning på 2,2 Å. Affiniteten mellem NbsfGFP02 og sfGFP blev bestemt til at være 15,8 nM ved biolagsinterferometri (BLI). Smeltetemperaturen var 75,6 grader for NbsfGFP02 [62]; derfor er det en potentiel GFP nanobody-kandidat i applikationer, der kræver hårde testbetingelser. De fleste nanostoffer kan udtrykkes funktionelt in vivo via plasmidtransfektion ind i eukaryote celler. Derfor er nanobodies et glimrende værktøj til at identificere strukturelle eller dynamiske træk i levende celler. I 2020, Zhou et al. foreslået en ny metode til at udtrykke de konstruerede GFP-bindende nanobodies (cAbGFP4) som in vitro transkription (IVT) mRNA, omtalt som nanobody-mCherry [63]. mRNA'et med utranslaterede områder og omvendte cap-analoger dækket med kemisk modificerede nukleotider og poly(A)-hale blev fremstillet in vitro og anvendt til transfektion. I modsætning til nanostoffet udtrykt ved hjælp af plasmid-DNA'et, blev anti-GFP-nanostoffet udtrykt ved hjælp af IVT-mRNA identificeret inden for 3 timer efter transfektion og nedbrudt inden for 48 timer. Derfor tillader udtrykkelse af det kodede mRNA af nanobody i levende celler effektiv levering af nanobody.

• Haj-afledte nanobodies rettet mod GFP.

Wei et al. viste, at bambushajer producerede et effektivt immunrespons mod GFP-immunisering, karakteriseret ved forhøjede lymfocyttal og antigenspecifikke IgNAR'er [64]. I alt blev 7 anti-GFP nanobodies, inklusive BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 og 105, med en affinitet på op til 0,3 nM, isoleret fra immuniserede bambushajer, hvilket antyder, at bambushajer fremstille IgNAR'er med høj affinitet. Derudover blev de bi-paratopiske VNAR'er med den højeste affinitet til GFP (20,7 pM) konstrueret, og karakteren af ​​anti-GFP nanobodies som intrabodies blev valideret i pattedyrsceller. Disse resultater vil fremskynde forskningen og fremskridtene for bambushaj sdAbs for at levere billige og letanvendelige nanobodies til den biomedicinske industri.

• Nanobodies målrettet mod andre fluorescerende proteiner.

Masabi er et lyst monomert grønt fluorescerende protein. Li et al. konstruerede med succes et antistofbibliotek af 4 × 107 transformanter ved at immunisere kameler med mWasabi som antigen og screenede 3 højaffinitets mWasabi-specifikke nanostoffer, kaldet Nb4, Nb6 og Nb27 [65]. Disse nanobodies genkendte wasabi alene eller i kombination med programmeret død 1 (PD-1). I alt blev 6 nanobodies (LaMs) målrettet mCherry med høj specificitet identificeret med KD-værdier fra 0,18 nM til 63 nM [59]. Derudover blev tre iRFP713-specifikke nanobodies (BSR1, BSR3 og BSR4) med nanomolære bindingsaffiniteter isoleret [64]. Disse data tyder på, at immunisering af bambushajer kan producere nanokroppe med høj affinitet. Samlet set muliggør nanobodies evne til at binde cellulære proteiner og tiltrække FP-fusionsproteiner præcis kontrol af cellulære processer og strukturer i levende celler. Denne multifunktionelle FP-nanofælde muliggør mikroskopiske, biokemiske og funktionelle analyser med en unik kombination af det samme protein. Nanobodies rettet mod FP'er er opsummeret i tabel 3.

Tabel 3. Sammenfatning af nanobodies rettet mod FP'er.

4. Anvendelser af fluorescerende protein nanobody

4.1. Anvendelser i proteindetektion

4.1.1. Påvisning af intracellulære proteiner

Forståelse af proteinfunktion kræver pålidelig og kvantificerbar proteinlokalisering i høj opløsning. Selvom brugen af ​​antistoffer til at mærke målproteiner er veletableret inden for molekylærbiologi, er denne teknik begrænset af størrelsen og multivalensen af ​​konventionelle antistoffer. I betragtning af den lille størrelse af nanobodies kan de bruges som sporstoffer til intracellulær billeddannelse efter ligering med fluorescerende molekyler, enzymer, peptider, receptorer, biotin og andre lægemidler. For eksempel blev nanobodies mod FP brugt til mikroskopi med superopløsning, når de blev mærket med organiske farvestoffer [66,67]. Ptk2-celler, der kontinuerligt udtrykker tubulin YFP, blev afbildet ved hjælp af denne fremgangsmåde, og opløsningen blev forbedret til 269 ± 37 Å i modsætning til ca. 450 Å med konventionelle antistoffer.

Nanobody-medieret mærkning tilbyder en hurtig og alsidig metode til at mærke næsten enhver almindeligt tilgængelig FP-afledt fusionsstruktur til sofistikeret enkelt-molekyle lokaliseringsmikroskopi (SMLM) billeddannelse. Specifikt kan tofarvet SMLM undersøge den subcellulære lokalisering af enhver funktionel GFP- og RFP-fusionskonstruktion, når nanobodies mod GFP og RFP bruges samtidigt [68]. Således kan adskillige biologiske problemer omgående løses ved hjælp af to-farve SMLM-billeddannelse. Ariotti et al. foreslået en modulær tilgang til enzymbaseret proteinmærkning, der muliggør forbedret hastighed og prøveudtagning til analyse af subcellulære proteinfordelinger til EM-opløsning [7]. Ved at designe GBP4 direkte til det modificerede sojabønne-ascorbatperoxidase (APEX) tag, blev det vist, at APEX kunne rettes til ethvert GFP-mærket protein af interesse. APEX-GBP4-fusion giver bemærkelsesværdig højopløsningsproteinlokalisering til organel-subdomænerne og forkorter signifikant tiden til karakterisering af subcellulære proteinfordelinger. Desuden tillader det EM-opløsning af GFP-mærkede proteiner udtrykt på endogene niveauer.

En værktøjskasse af FP-specifikke nanobody-kodende plasmider blev genereret og fusioneret til funktionelle moduler. Denne værktøjskasse muliggør visualisering og manipulation af intracellulære signalveje i levende celler, hvilket betydeligt udvider dens anvendelser in vivo [9]. Disse omfatter fluorescerende sensorer til dynamisk visualisering af Ca2+, H+ og ATP/ADP og oligomere eller heterodimere moduler, der tillader proteinrekruttering eller isolering og genkendelse af membrankontaktsteder mellem organeller. I 2017, Herce et al. brugte cellepenetrerende peptid (CPP) til at transportere antistoffer direkte ind i celler til immunmærkning og antigenmanipulation [69]. Et system, der udnyttede den høje affinitet af cyklisk arginin-rig CPP til RNA i nukleolus, blev konstrueret. Ved at forbinde den cykliske argininrige CPP til GFP-nanokroppen kan re-lokaliseringen af ​​GFP i nukleolus observeres direkte i celler (figur 5A). Derfor kan dette visualiserede system bruges til at spore proteinets placering og til at sammenligne effektiviteten af ​​forskellige CPP'er kvantitativt.

Fluorescensresonansenergioverførselsteknikken (FRET) er meget udbredt i biovidenskabelig forskning, fordi den muliggør dynamisk realtidsdetektion af signalmolekyler under fysiologiske forhold i levende celler. På grund af dens exceptionelle følsomhed og specificitet bliver tidsopløst Förster resonansenergioverførsel (TR-FRET)-baseret analyse mere og mere populær i biomedicinsk forskning. Den nanobody-baserede TR-FRET-metode tillader nem kvantificering af fluorescerende (fusions)proteiner i lysater med meget højere følsomhed end konventionelle fluorescensintensitetsudlæsninger [70].

Figur 5. Anvendelser af fluorescerende protein nanobody. (A) Visualisering af protein-protein-interaktioner. Anti-GFP nanobody (Nb) bundet til cellepenetrerende peptider (CPP'er) kan trænge ind i cellekernen. Hvis det GFP-mærkede protein ikke interagerer med det RFP-mærkede protein, er det kun det GFP-mærkede protein, der re-lokaliseres til nukleolus via Nb-CPP og viser en grøn farve. Men hvis de to proteiner interagerer, re-lokaliseres begge proteiner til nukleolus og viser gul farve. (B) GFP nanobody muliggør selektiv mærkning af nyligt eksocyterede vesikelproteiner. Trin 1: Vesikelproteinet kobles til GFP og inkuberes med en ikke-fluorescerende nanobody (NbGFP), hvilket resulterer i utilgængeligheden af ​​GFP med den fluorescensbindende nanobody (NbGFP*). Trin 2 og 3: Efter stimulering af cellulær exocytose udsættes det nye vesikelprotein for plasmamembranen og kan mærkes med NbGFP*. (C) Skematisk illustration af nedbrudt. Proteinselektiv nedbrydning opnås gennem ubiquitin-vejen, som udføres af en kompleks række enzymer. F-box-proteinet (FBP) i SKP1-CUL1-F-box-proteinligasekomplekserne (SCF'er) er fusioneret til anti-GFP-nanostoffet (Nb) for at genkende GFP-fusionsproteinet, og det ubiquitin-konjugerende enzym (E2) kobler kovalent flere ubiquitin-molekyler til målproteinet. Efterfølgende nedbrydes det polyubiquitinerede protein af proteasomet. (D) Skematisk beskrivelse af BiCAP. HER-protein er fusioneret til N-terminale (GFP1) eller C-terminale (GFP2) fragmenter af GFP. Når de to fusioner danner en dimer, foldes GFP igen og fluorescerer. HER-dimeren og dens interagerende proteiner beriges derefter ved hjælp af en GFP-nanobody, som ikke har nogen bindingsevne mod GFP-fragmenterne og dermed muliggør isolering af dimeren. (E) GFP-afhængigt transkriptionssystem. Det DNA-bindende domæne (DBD) og aktiveringsdomænet (AD) er fusioneret med henholdsvis GFP nanobody 1 (Nb1) og GFP nanobody 2 (Nb2). I nærvær af GFP kan DBD-Nb1 og AD-Nb2 aktivere det opstrøms aktiverende sekvens (UAS) reportergen, hvilket fører til opregulering af målgener. (F) Genkendelse af GFP-mærkede proteiner på DNA-nanostrukturer. DNA-nanostrukturerne med to bindingssteder ligeres på den magnetiske harpiks, bundet med GFP nanobody (Nb) ved komplementær baseparring og inkuberes derefter med GFP-mærkede proteiner. Derfor kan GFP-mærkede proteiner bindes nøjagtigt til nanostrukturerne.

Figur 5. Forts.

4.1.2. Påvisning af proteiner på celleoverfladen

Bakterieoverfladedisplayet er en lovende teknologi til fremstilling af celleforankrede proteiner og design af helcellekatalysatorer. Selvom der bruges forskellige ydre membranproteiner til overfladevisning, er der ingen enkle, universelle og high-throughput-kompatible metoder tilgængelige til at evaluere og udvikle overfladedisplaysystemer. Derudover er det udfordrende at skelne mellem intracellulære og overfladevise proteiner. Wendel et al. konstruerede et fluorescensbaseret overfladedisplaydetektionssystem ved at fusionere GFP-nanobody til ydre membranankre [71]. To almindeligt anvendte ydre membranproteiner blev valgt som ankre: ydre membranprotein A (OmpA) og autotransporter (C-IgAP). Derfor er to forskellige displaymoduler konstrueret ved at fusionere OmpA eller C-IgAP med GFP-specifikke nanobodies, visualiseret ved at tilføje renset GFP eksternt. Selvom GFP i sig selv kan vises på celleoverfladen, undgår denne nye metode problemet med falske positiver, da kun hvis GFP binder til nanokroppen præsenteret på celleoverfladen, kan cellerne producere et fluorescerende signal. Assayet er kompatibelt med mange fluorescensdetektionsmetoder, herunder helcellefluorescensdetektion i plade, in-gel fluorescens, mikroskopi og flowcytometri. Denne billige og letlæselige overfladevisningsmetode vil hjælpe med at demonstrere transportmekanismen af ​​proteiner på overfladen af ​​levende celler, hvilket muliggør den rationelle udvikling af bakterielle overfladedisplaysystemer og robuste helcellebiokatalysatorer i fremtiden.

Frigivelsen af ​​neurotransmittere kræver exocytose, endocytose og dannelse af nye fusionsvesikler. Hvad der sker med vesikelproteiner efter eksocytose, når det efterlades på plasmamembranen, er dårligt forstået. Disse proteiner er ofte konjugeret til pH-følsomme GFP-dele (fluor). Da pHluorin-billeddannelse normalt er begrænset af diffraktionen af ​​pletter flere gange større end vesikler, er det værdifuldt at bruge anti-GFP nanobodies til selektivt at mærke exocytoserede vesikler [72]. Ved at forbinde anti-GFP nanobodies til kemiske fluoroforer, der er egnede til billeddannelse i superopløsning, kan størrelsen og intensiteten af ​​pHluorin-mærkede proteiner under forskellige forhold påvises på måder, der ikke er mulige med pHluorin alene. Ved stimulering af exocytose udsættes nye vesikelproteiner for plasmamembranen, og derefter vil de fluorescerende mærkede nanobodies binde med pHluorin (figur 5B). Således er nanobody-baseret pHluorin-detektion et lovende værktøj til at studere post-exocytose-hændelser i neuroner.

4.2. Anvendelser i målrettet nedbrydning af proteinmolekyler

Sammenlignet med genredigering og RNA-interferens er direkte manipulation af biomolekyler på proteinniveau en mere effektiv vej til proteinfunktionsundersøgelser, der overvinder begrænsninger såsom potentielle off-target-effekter, geninaktivering og tab af essentiel gen-fænotypisk funktion. Målrettet proteinnedbrydning er i øjeblikket en vigtig forskningsstrategi for at opnå tab af funktion og proteolyse af proteiner af interesse. En nanobody-baseret proteinnedbryder kan hjælpe med at opnå hurtig nedbrydning og reversibel regulering af proteiner af interesse. Caussinus et al. udviklet en proteinnedbrydningsmetode til direkte og hurtig udtømning af mål-GFP-fusionsproteiner i ethvert eukaryotisk system [73]. Kort fortalt, for at slå GFP-fusionsproteinet ned, fusioneres et anti-GFP-nanostof til F-box-proteinet (FBP) i SKP1-CUL1-F-box-protein (SCF) E3-ligasekomplekserne at genkende GFP-fusionsproteinet. Det ubiquitin-konjugerende enzym (E2) kobler kovalent flere ubiquitin-molekyler til mål-GFP-fusionsproteinet. Efterfølgende nedbryder SCF-komplekset det polyubiquitinerede protein; fjernelse af målproteinet er således let at overvåge (figur 5C). Denne teknik, kaldet nedbryde grønt fluorescerende protein (deGradFP), er blevet brugt til nedbrydning af GFP og dets fusioner i pattedyrsceller, zebrafiskembryoner [74] og planter [75].

4.3. Anvendelser i bimolecular Complementation Affinity Purification System

I 2016, Croucher et al. udviklet et bimolecular complementation affinity cleaning system (BiCAP), som effektivt kan skelne human epidermal vækstfaktor receptor (HER) dimer (homolog og heterolog) fra monomer [76]. I dette system er to komplementære fragmenter af et FP-molekyle fusioneret med to HER-proteiner (HER1, HER2 eller HER3). Disse to fragmenter kan ikke spontant samles til aktive fluorescerende proteiner. Antag dog, at de to HER-proteiner interagerer med hinanden. I så fald vil de to fragmenter være rumligt tæt på hinanden og komplementære og rekonstruere dem til et komplet og aktivt fluorescerende protein (figur 5D). HER-dimeren og dens interagerende proteiner kan beriges ved hjælp af en GFP-nanobody, som ikke havde nogen affinitet til GFP-fragmenterne, hvilket muliggør isolering og berigelse af dimeren. Ved at analysere de identificerede proteiner blev det afsløret, at de tre dimerer (HER2:HER2, HER2:HER3 og HER1:HER2) har fælles interagerende proteiner og deres specifikke interaktom. FAM59A, et protein, der specifikt interagerede med HER1:HER3 dimer, medierede aktiveringen af ​​den ekstracellulære signalregulerede kinasevej, hvilket gav et nyt mål for brystkræftbehandling.

cistanche planteforøgende immunsystem

4.4. Ansøgninger på andre områder

Tidlig in vitro-diagnostik af sygdom og overvågning af terapeutiske virkninger er et stort problem i sygdomsdiagnostik. Et ideelt kontrastmiddel bør have god vævsgennemtrængning, høj antigenaffinitet og hurtig clearance-evne med minimal skade på normalt væv. Nanobodies har potentialet som ideelle billeddannende midler, der kan krydse blodkar og trænge ind i væv for bedre billeddannelse og terapeutiske anvendelser.

FP'er belyser ikke kun celler og biologiske processer, men laver også fremragende stilladser på grund af deres tilsyneladende mangel på kobling til adskillige værtsproteinnetværk. Ved at bruge GBP'er og GFP som et stillads til at drive biologisk aktiv kompleksdannelse, Tang et al. skabt et bibliotek af hybride transkriptionsfaktorer, der udelukkende kontrollerer genekspression i nærvær af GFP og dets derivater [77]. Produktionen af ​​GFP kontrollerer ekspressionen af ​​cellespecifikke gener (figur 5E) og fremmer dysfunktionen af ​​musens nethinde og hjerne. Derudover modificeres de GFP-transgene mus- og zebrafiskstammer for at opnå GFP-afhængig transkription til fotogenetisk overvågning af neurale kredsløb. Dette arbejde etablerer positionen af ​​GFP som et alsidigt stillads og åbner døren til selektivt at manipulere forskellige GFP-mærkede celler i transgene stammer. På baggrund af dette kan andre intracellulære produkter også udvikles som cellespecifikke stilladser i flercellede organismer.

DNA nanostrukturer er blevet et væsentligt og effektivt værktøj til at studere enzymaktivitet og proteinfunktion. Det er imidlertid vanskeligt at udvikle universelle strategier til dannelse af proteinkomplekser på DNA-nanostrukturer. En af vanskelighederne er bindingen af ​​proteiner af interesse til DNA-nanostrukturer. Sommese et al. foreslået en ny tilgang til mærkning af DNA-nanostrukturer [78]. Ved at funktionalisere dem med en GFP-nanobody kan evnen til proteinbinding kontrolleres præcist (figur 5F). Sammenlignet med GFP-specifikke DNA-aptamerer udviser nanobodies højere specificitet, stabilitet og affinitet over for GFP. Derfor er anvendelsen af ​​DNA-nanostrukturer som et programmerbart stillads i biologisk forskning blevet dramatisk forenklet ved at forbinde DNA-nanostrukturerne med FP'er, der almindeligvis findes i celler, udviklingsbiologi og proteinbiokemi.

5. Diskussion om fremtidsudsigter

Sammenlignet med traditionelle antistoffer har nanostoffer bedre fysiske og kemiske egenskaber og er lettere at udtrykke og screene. Nanobodies er meget enklere i struktur end konventionelle antistoffer. De er kodet af et enkelt gen og kan nemt produceres af mikroorganismer, hvilket reducerer produktionsomkostningerne betydeligt. Selvom nanobodies giver et gennembrud for antistofforskning, mangler nogle problemer stadig at blive løst. På den ene side har de ulempen ved ubekvem drift og høje omkostninger ved dyreimmunisering. Da HCAb og IgNAR er rigelige i perifere blodmonocytter, screenes nanobodies, der målretter mod FP-antigener, normalt fra specifikke Camelidae- eller haj-immunbiblioteker. Med modningen af ​​bibliotekskonstruktion og nanobody-udviklingsteknologier er screening af FP-specifikke nanobodies fra syntetiske biblioteker en ny retning, der vil overvinde ulejligheden ved at immunisere dyr, forkorte forsøgsperioden og reducere omkostningerne betydeligt. På den anden side, selvom screening og ekspression af nanobodies er relativt enkel, er opnåelse af FP-nanobodies med potentielle anvendelsesværdier en meget kompliceret proces. Screeningen af ​​fag nanobody-biblioteker kan ikke undgå de falske positiver forårsaget af bindingen af ​​filamentøs fagoverflade med antigen, mens den lille kapacitet af gær- og bakterielle nanobody-biblioteker er et andet vanskeligt problem i nanobody-screening.

Anvendelsen af ​​nanobodies mod FP vil fortsætte med at stige i fremtiden. (1) Med udviklingen af ​​intracellulær antistofteknologi er det blevet tilgængeligt at påvise intracellulære molekyler i levende celler. Nanobodies har unikke fordele i denne henseende, idet (i) nanostoffet er lille, og effektiviteten af ​​celleindtrængning er meget højere end traditionelle antistoffers; og (ii) nanokroppen kan udtrykkes og fungere i levende celler. (2) Bispecifikt nanostof er en slags kunstigt modificeret antistof, der specifikt kan binde to forskellige antigener samtidigt. Det kan let konstrueres ud fra monovalente nanostoffer og udtrykkes i mikroorganismer. Derfor giver nanobodies mod FP et bredt anvendelsesperspektiv for bispecifik nanobody-udvikling.

6. Konklusioner

Dette papir gennemgår oprindelsen, strukturen og egenskaberne af FP'er. Monoklonale antistoffer og nanostoffer rettet mod FP'er og deres anvendelser er også opsummeret. Selvom antistoffer er værdifulde værktøjer til at vise biologiske komponenter i immobiliserede celler, er brugen af ​​traditionelle antistoffer i levende celler begrænset af den ineffektive foldning og samling af deres variable tunge og lette kæder. Direkte mikroinjektion af antistoffer er den primære metode, der anvendes i antistof intracellulære applikationer, hvilket er teknisk udfordrende og stressende for celler. Kamel- eller haj-afledte enkeltdomæne-antistoffer genkender antigener gennem deres variable domæner af tunge kæder. Disse små og stabile nanokroppe kan udtrykkes og fungere i levende celler. Derfor vil generering af nanobodies rettet mod FP'er gøre dem mere værdifulde i biologisk forskning.

Referencer

1. Muyldermans, S. Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies. Annu. Rev. Biochem. 2013, 82, 775-797. [CrossRef] [PubMed]

2. Helma, J.; Cardoso, MC; Muyldermans, S.; Leonhardt, H. Nanobodies og rekombinante bindere i cellebiologi. J. Cell Biol. 2015, 209, 633-644. [CrossRef] [PubMed]

3. Ashour, J.; Schmidt, FI; Hanke, L.; Cragnolini, J.; Cavallari, M.; Altenburg, A.; Brewer, R.; Ingram, J.; Skomager, C.; Ploegh, HL Intracellulær ekspression af kamelide-enkeltdomæne-antistoffer, der er specifikke for influenzavirus-nukleoprotein, afslører distinkte træk ved dets nukleare lokalisering. J. Virol. 2015, 89, 2792-2800. [CrossRef] [PubMed]

4. Manglik, A.; Kobilka, BK; Steyaert, J. Nanobodies til at studere G-proteinkoblet receptorstruktur og funktion. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2017, 57, 19-37. [CrossRef]

5. Harmansa, S.; Hamaratoglu, F.; Affolter, M.; Caussinus, E. Dpp-spredning er nødvendig for medial, men ikke for lateral vingeskivevækst. Nature 2015, 527, 317–322. [CrossRef]

6. Yamagata, M.; Sanes, JR Reporter-nanobody-fusioner (RANbodies) som alsidige, små, følsomme immunhistokemiske reagenser. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2018, 115, 2126-2131. [CrossRef]

7. Ariotti, N.; Hall, TE; Rae, J.; Ferguson, C.; McMahon, K.-A.; Martel, N.; Webb, RE; Webb, RI; Teasdale, RD; Parton, RG Modulær detektion af GFP-mærkede proteiner til hurtig screening ved elektronmikroskopi i celler og organismer. Dev. Celle 2015, 35, 513-525. [CrossRef]

8. Früholz, S.; Fäßler, F.; Kolukisaoglu, Ü.; Pimpl, P. Nanobody-udløst lockdown af VSR'er afslører ligandgenindlæsning i Golgi. Nat. Commun. 2018, 9, 643. [CrossRef]

9. Prole, DL; Taylor, CW Et genetisk kodet værktøjssæt af funktionaliserede nanobodies mod fluorescerende proteiner til visualisering og manipulation af intracellulær signalering. BMC Biol. 2019, 17, 41. [CrossRef]

10. Shimomura, O.; Johnson, FH; Saiga, Y. Ekstraktion, oprensning og egenskaber af Aequorin, et bioluminescerende protein fra Luminous Hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 1962, 59, 223-239. [CrossRef]

11. Prasher, D.; McCann, RO; Cormier, MJ Kloning og ekspression af cDNA'et, der koder for aequorin, et bioluminescerende calciumbindende protein. Biochem. Biofys. Res. Commun. 1985, 126, 1259-1268. [CrossRef]

12. Heim, R.; Prasher, DC; Tsien, RY Bølgelængdemutationer og posttranslationel autooxidation af grønt fluorescerende protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12501-12504. [CrossRef]

13. Matz, M.; Fradkov, AF; Labas, YA; Savitsky, A.; Zaraisky, AG; Markelov, ML; Lukyanov, SA Fluorescerende proteiner fra ikke-bioluminescerende Anthozoa-arter. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 969-973. [CrossRef]

14. Park, N.; Sang, J.; Jeong, S.; Tran, TT; Ko, HW; Kim, EY Vaccinia-relateret kinase 3 (VRK3) sætter den cirkadiske periode og amplitude ved at påvirke den subcellulære lokalisering af urproteiner i pattedyrsceller. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2017, 487, 320-326. [CrossRef]

15. Zhao, D.; Xue, C.; Lin, S.; Shi, S.; Li, Q.; Liu, M.; Cai, X.; Lin, Y. Notch Signaling Pathway Regulerer angiogenese via endotelcelle i 3D Co-Culture Model. J. Cell. Physiol. 2016, 232, 1548-1558. [CrossRef]

16. Rodriguez, EA; Campbell, RE; Lin, JY; Lin, MZ; Miyawaki, A.; Palmer, AE; Shu, X.; Zhang, J.; Tsien, RY Den voksende og glødende værktøjskasse af fluorescerende og fotoaktive proteiner. Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 111-129. [CrossRef]

17. Yang, F.; Moss, LG; Phillips, GN, Jr. Den molekylære struktur af grønt fluorescerende protein. Nat. Biotechnol. 1996, 14, 1246-1251. [CrossRef]

18. Ormö, M.; Cubitt, AB; Kallio, K.; Gross, LA; Tsien, RY; Remington, SJ Krystalstruktur af Aequorea victoria grønt fluorescerende protein. Science 1996, 273, 1392-1395. [CrossRef]

19. Reid, BG; Flynn, GC Kromofordannelse i grønt fluorescerende protein. Biochemistry 1997, 36, 6786-6791. [CrossRef]

20. Zhang, G.; Gurtu, V.; Kain, SR Et forbedret grønt fluorescerende protein tillader følsom påvisning af genoverførsel i pattedyrceller. Biochem. Biofys. Res. Commun. 1996, 227, 707-711. [CrossRef]

21. Pédelacq, J.-D.; Cabantous, S.; Tran, T.; Terwilliger, T.; Waldo, GS Engineering og karakterisering af et superfolder grønt fluorescerende protein. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 79-88. [CrossRef] [PubMed]

22. Crameri, A.; Whitehorn, EA; Tate, E.; Stemmer, WP Forbedret grønt fluorescerende protein ved molekylær evolution ved hjælp af DNA-blanding. Nat. Biotechnol. 1996, 14, 315-319. [CrossRef] [PubMed]

23. Miura, H.; Inoko, H.; Inoue, I.; Tanaka, M.; Sato, M.; Ohtsuka, M. Simpel kloningsstrategi ved hjælp af GFPuv-gen som positiv/negativ indikator. Anal. Biochem. 2011, 416, 237-239. [CrossRef] [PubMed]

24. Mena, MA; Treynor, TP; Mayo, SL; Daugherty, PS Blå fluorescerende proteiner med forbedret lysstyrke og fotostabilitet fra et strukturelt målrettet bibliotek. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 1569-1571. [CrossRef] [PubMed]

25. Ai, H.; Shaner, N.; Cheng, Z.; Tsien, RY; Campbell, RE Udforskning af nye kromoforstrukturer fører til identifikation af forbedrede blå fluorescerende proteiner. Biochemistry 2007, 46, 5904-5910. [CrossRef]

26. Subach, OM; Gundorov, IS; Yoshimura, M.; Subach, FV; Zhang, J.; Grüenwald, D.; Souslova, EA; Chudakov, DM; Verkhusha, VV Konvertering af rødt fluorescerende protein til en lys blå sonde. Chem. Biol. 2008, 15, 1116-1124. [CrossRef]

27. Merzlyak, E.; Goedhart, J.; Shcherbo, D.; Bulina, ME; Shcheglov, AS; Fradkov, AF; Gaintzeva, A.; Lukyanov, K.; Lukyanov, S.; Gadella, T.; et al. Lyst monomert rødt fluorescerende protein med en forlænget fluorescenslevetid. Nat. Metoder 2007, 4, 555-557. [CrossRef]

28. Cubitt, AB; Heim, R.; Adams, SR; Boyd, AE; Gross, LA; Tsien, RY Forståelse, forbedring og brug af grønne fluorescerende proteiner. Trends Biochem. Sci. 1995, 20, 448-455. [CrossRef]

29. Tomosugi, W.; Matsuda, T.; Tani, T.; Nemoto, T.; Kotera, I.; Saito, K.; Horikawa, K.; Nagai, T. Et ultramarint fluorescerende protein med øget fotostabilitet og pH-ufølsomhed. Nat. Metoder 2009, 6, 351-353. [CrossRef]

30. Goedhart, J.; van Weeren, L.; Hink, MA; Vischer, NOE; Jalink, K.; Gadella, TWJ Lyse cyan fluorescerende proteinvarianter identificeret ved fluorescens livstidsscreening. Nat. Metoder 2010, 7, 137-139. [CrossRef]

31. Day, RN; Davidson, MW Den fluorescerende proteinpalet: Værktøjer til cellulær billeddannelse. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 2887-2921. [CrossRef]

32. Griesbeck, O.; Baird, GS; Campbell, RE; Zacharias, DA; Tsien, RY Reduktion af den miljømæssige følsomhed af gult fluorescerende protein. J. Biol. Chem. 2001, 276, 29188-29194. [CrossRef]

33. Nagai, T.; Ibata, K.; Park, ES; Kubota, M.; Mikoshiba, K.; Miyawaki, A. En variant af gult fluorescerende protein med hurtig og effektiv modning til cellebiologiske anvendelser. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 87-90. [CrossRef]

34. Shaner, NC; Campbell, RE; Steinbach, PA; Giepmans, BN; Palmer, AE; Tsien, RY Forbedrede monomere røde, orange og gule fluorescerende proteiner afledt af Discosoma sp. rødt fluorescerende protein. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 1567-1572. [CrossRef]

35. Shcherbo, D.; Merzlyak, EM; Chepurnykh, TV; Fradkov, AF; Ermakova, GV; Solovieva, EA; Lukyanov, KA; Bogdanova, EA; Zaraisky, AG; Lukyanov, S.; et al. Lyst langt rødt fluorescerende protein til billeddannelse af hele kroppen. Nat. Methods 2007, 4, 741-746. [CrossRef]

36. Shcherbo, D.; Murphy, CS; Ermakova, GV; Solovieva, EA; Chepurnykh, TV; Shcheglov, AS; Verkhusha, V.; Pletnev, VZ; Hazelwood, KL; Roche, PM; et al. Far-røde fluorescerende tags til protein billeddannelse i levende væv. Biochem. J. 2009, 418, 567-574. [CrossRef]

37. Oliinyk, OS; Chernov, KG; Verkhusha, VV bakterielle phytochromer, cyanobakteriochromer og allophycocyaniner som en kilde til nær-infrarøde fluorescerende prober. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1691. [CrossRef]

38. Shu, X.; Royant, A.; Lin, MZ; Aguilera, TA; Lev-Ram, V.; Steinbach, PA; Tsien, RY Pattedyrsekspression af infrarøde fluorescerende proteiner konstrueret ud fra en bakteriel phytochrome. Science 2009, 324, 804-807. [CrossRef]

39. Yu, D.; Gustafson, WC; Han, C.; Lafaye, C.; Noirclerc-Savoye, M.; Ge, W.-P.; Thayer, DA; Huang, H.; Kornberg, TB; Royant, A.; et al. Et forbedret monomert infrarødt fluorescerende protein til neuronal og tumorhjerneafbildning. Nat. Commun. 2014, 5, 3626. [CrossRef]

40. Yu, D.; Baird, MA; Allen, JR; Howe, ES; Klassen, MP; Reade, A.; Makhijani, K.; Sang, Y.; Liu, S.; Murthy, Z.; et al. Et naturligt monomert infrarødt fluorescerende protein til proteinmærkning in vivo. Nat. Metoder 2015, 12, 763-765. [CrossRef]

41. Shcherbakova, DM; Balaban, M.; Emelyanov, AV; Brenowitz, M.; Guo, P.; Verkhusha, VV Lyse monomere nær-infrarøde fluorescerende proteiner som tags og biosensorer til multiskala billeddannelse. Nat. Commun. 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. Rodriguez, EA; Tran, GN; Gross, LA; Crisp, JL; Shu, X.; Lin, JY; Tsien, RY Et langt rødt fluorescerende protein udviklet sig fra et cyanobakterielt phycobiliprotein. Nat. Metoder 2016, 13, 763-769. [CrossRef] [PubMed]

43. Oliinyk, OS; Shemetov, AA; Pletnev, S.; Shcherbakova, DM; Verkhusha, VV Det mindste nær-infrarøde fluorescerende protein udviklede sig fra cyanobakteriochrom som et alsidigt mærke til spektral multipleksing. Nat. Commun. 2019, 10, 279. [CrossRef]

44. Oliinyk, OS; Balaban, M.; Clark, CL; Carey, E.; Pletnev, S.; Nimmerjahn, A.; Verkhusha, VV Enkeltdomæne nær-infrarødt protein giver et stillads for antigenafhængige fluorescerende nanobodies. Nat. Metoder 2022, 19, 740-750. [CrossRef] [PubMed]

45. Tiller, KE; Tessier, PM Fremskridt i antistofdesign. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2015, 17, 191-216. [CrossRef]

46. ​​Gengyo-Ando, ​​K.; Mitani, S. 1020 Produktion og karakterisering af et monoklonalt antistof mod det grønne fluorescerende protein (GFP). Neurosci. Res. 1997, 28, S122. [CrossRef]

47. Zhuang, R.; Zhang, Y.; Zhang, R.; Sang, C.; Yang, K.; Yang, A.; Jin, B. Oprensning af GFP-fusionsproteiner med høj renhed og udbytte ved monoklonalt antistof-koblet affinitetssøjlekromatografi. Protein Expr. Purif. 2008, 59, 138-143. [CrossRef]

48. Ward, ES; Güssow, D.; Griffiths, AD; Jones, PT; Winter, G. Bindingsaktiviteter af et repertoire af enkelte immunoglobulinvariable domæner udskilt fra Escherichia coli. Nature 1989, 341, 544-546. [CrossRef]

49. Hamers-Casterman, C.; Atarhouch, T.; Muyldermans, S.; Robinson, G.; Hammers, C.; Songa, EB; Bendahman, N.; Hammers, R. Naturligt forekommende antistoffer uden lette kæder. Nature 1993, 363, 446-448. [CrossRef]

50. Greenberg, AS; Avila, D.; Hughes, M.; Hughes, A.; McKinney, EC; Flajnik, MF En ny antigenreceptor-genfamilie, der gennemgår omlejring og omfattende somatisk diversificering i hajer. Nat. Cell Biol. 1995, 374, 168-173. [CrossRef]

51. De Meyer, T.; Muyldermans, S.; Depicker, A. Nanobody-baserede produkter som forsknings- og diagnostiske værktøjer. Trends Biotechnol. 2014, 32, 263-270. [CrossRef]

52. Skerra, A. Alternative ikke-antistof stilladser til molekylær genkendelse. Curr. Opin. Biotechnol. 2007, 18, 295-304. [CrossRef]

53. Muyldermans, S.; Baral, T.; Retamozzo, VC; De Baetselier, P.; De Genst, E.; Kinne, J.; Leonhardt, H.; Magez, S.; Nguyen, V.; Revets, H.; et al. Camelid immunoglobuliner og nanobody-teknologi. Veter. Immunol. Immunopathol. 2009, 128, 178-183. [CrossRef]

54. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Tillib, S.; Nowak, D.; Schermelleh, L.; Gahl, A.; Backmann, N.; Conrath, K.; Muyldermans, S.; Cardoso, MC; et al. Målretning og sporing af antigener i levende celler med fluorescerende nanobodies. Nat. Methods 2006, 3, 887-889. [CrossRef]

55. Kubala, MH; Kovtun, O.; Alexandrov, K.; Collins, BM Strukturel og termodynamisk analyse af GFP: GFP-nanobody-kompleks. Protein Sci. 2010, 19, 2389-2401. [CrossRef]

56. Fang, Z.; Cao, D.; Qiu, J. Udvikling og produktion af nanobodies specifikt mod grønt fluorescensprotein. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020, 104, 4837-4848. [CrossRef]

57. Kirchhofer, A.; Helma, J.; Schmidthals, K.; Frauer, C.; Cui, S.; Karcher, A.; Pellis, M.; Muyldermans, S.; Casas-Delucchi, CS; Cardoso, MC; et al. Modulation af proteinegenskaber i levende celler ved hjælp af nanobodies. Nat. Struktur. Mol. Biol. 2009, 17, 133-138. [CrossRef]

58. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Muyldermans, S.; Schepers, A.; Cardoso, MC; Leonhardt, H. En alsidig nanotfælde til biokemiske og funktionelle undersøgelser med fluorescerende fusionsproteiner. Mol. Celle. Proteom. 2008, 7, 282-289. [CrossRef]

59. Fridy, P.; Li, Y.; Keegan, S.; Thompson, MK; Nudelman, I.; Scheid, JF; Oeffinger, M.; Nussenzweig, MC; Fenyö, D.; Chait, BT; et al. En robust pipeline til hurtig produktion af alsidige nanobody-repertoirer. Nat. Metoder 2014, 11, 1253-1260. [CrossRef]

60. Zhang, Z.; Wang, Y.; Ding, Y.; Hattori, M. Struktur-baseret konstruktion af anti-GFP nanobody tandems som ultra-høj-affinitet reagenser til oprensning. Sci. Rep. 2020, 10, 6239. [CrossRef]

61. Twair, A.; Al-Okla, S.; Zarkawi, M.; Abbady, AQ Karakterisering af kamel nanobodies specifikke for superfolder GFP fusionsproteiner. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 6887-6898. [CrossRef] [PubMed]

62. Zhong, P.; Wang, Z.; Cheng, S.; Zhang, Y.; Jiang, H.; Liu, R.; Ding, Y. Strukturel indsigt i to forskellige nanobodies, der genkender den samme epitop af grønt fluorescerende protein. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2021, 565, 57-63. [CrossRef] [PubMed]

63. Zhou, X.; Hao, R.; Chen, C.; Su, Z.; Zhao, L.; Luo, Z.; Xie, W. Hurtig levering af nanobodies/VHH'er til levende celler via ekspression af in vitro-transskriberet mRNA. Mol. Ther.-Methods Clin. Dev. 2020, 17, 401-408. [CrossRef] [PubMed]

64. Wei, L.; Wang, M.; Xiang, H.; Jiang, Y.; Gong, J.; Su, D.; Al Azad, MAR; Dong, H.; Feng, L.; Wu, J.; et al. Bambushaj som en lille dyremodel til produktion af antistof med enkelt domæne. Foran. Bioeng. Biotechnol. 2021, 9, 792111. [CrossRef]

65. Li, S.; Shan, H.; Wang, T.; Zheng, X.; Shi, M.; Chen, B.; Lu, H.; Zhang, Y.; Zhao, S.; Hua, Z. Generering af mWasabi fluorescerende protein-bindende nanobodies. Anal. Biochem. 2020, 608, 113875. [CrossRef]

66. Ries, J.; Kaplan, C.; Platonova, E.; Eglidi, HM; Ewers, H. En simpel, alsidig metode til GFP-baseret super-opløsningsmikroskopi via nanobodies. Nat. Metoder 2012, 9, 582-584. [CrossRef]

67. Beghein, E.; Gettemans, J. Nanobody Technology: Et alsidigt værktøjssæt til mikroskopisk billeddannelse, protein-protein-interaktionsanalyse og proteinfunktionsudforskning. Foran. Immunol. 2017, 8, 771. [CrossRef]

68. Platonova, E.; Winterflood, CM; Junemann, A.; Albrecht, D.; Faix, J.; Ewers, H. Enkeltmolekylemikroskopi af molekyler mærket med GFP- eller RFP-derivater i pattedyrsceller ved hjælp af nanobody-bindere. Metoder 2015, 88, 89–97. [CrossRef]

69. Herce, HD; Schumacher, D.; Schneider, AF; Ludwig, AK; Mann, FA; Fillies, M.; Kasper, M.-A.; Reinke, S.; Krause, E.; Leonhardt, H.; et al. Cellegennemtrængelige nanobodies til målrettet immunmærkning og antigenmanipulation i levende celler. Nat. Chem. 2017, 9, 762-771. [CrossRef]

70. Payne, NC; Mazitschek, R. Tiny Titans: Nanobodies as Powerful Tools for TR-FRET Assay Development. Anal. Sens. 2022, 2, e202200020. [CrossRef]

71. Wendel, S.; Fischer, EC; Martínez, V.; Seppälä, S.; Nørholm, MHH En nanobody: GFP-bakteriel platform, der muliggør funktionel enzymvisning og nem kvantificering af displaykapacitet. Microb. Cellefabrikker 2016, 15, 71. [CrossRef]

72. Seitz, KJ; Rizzoli, SO GFP nanobodies afslører nyligt eksocyterede pHluorin-molekyler. Sci. Rep. 2019, 9, 7773. [CrossRef]

73. Caussinus, E.; Kanca, O.; Affolter, M. Fluorescerende fusionsprotein knockout medieret af anti-GFP nanobody. Nat. Struktur. Mol. Biol. 2011, 19, 117-121. [CrossRef]

74. Shin, YJ; Park, SK; Jung, YJ; Na Kim, Y.; Kim, KS; Park, OK; Kwon, S.-H.; Jeon, SH; Trinh, LA; Fraser, S.; et al. Nanobody-målrettet E3-ubiquitin-ligasekompleks nedbryder nukleare proteiner. Sci. Rep. 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. Baudisch, B.; Pfort, I.; Sorge, E.; Conrad, U. Nanobody-dirigeret specifik nedbrydning af proteiner af 26S-proteasomet i planter. Foran. Plant Sci. 2018, 9, 130. [CrossRef]

76. Croucher, DR; Iconomou, M.; Hastings, JF; Kennedy, SP; Han, JZR; Shearer, RF; McKenna, J.; Wan, A.; Lau, J.; Aparicio, S.; et al. Bimolekylær komplementeringsaffinitetsoprensning (BiCAP) afslører dimer-specifikke proteininteraktioner for ERBB2-dimerer. Sci. Signal. 2016, 9, 436. [CrossRef]

77. Tang, JC; Szikra, T.; Kozorovitskiy, Y.; Teixeira, M.; Sabatini, BL; Roska, B.; Cepko, CL Et nanobody-baseret system, der bruger fluorescerende proteiner som stilladser til cellespecifik genmanipulation. Cell 2013, 154, 928-939. [CrossRef]

78. Sommese, RF; Hariadi, RF; Kim, K.; Liu, M.; Tyska, MJ; Sivaramakrishnan, S. Mønstring af proteinkomplekser på DNA-nanostrukturer ved hjælp af en GFP-nanobody. Protein Sci. 2016, 25, 2089-2094. [CrossRef]