Renal CD169 plus plus residente makrofager er afgørende for beskyttelse mod akut systemisk candidiasis

edmund.chen@wecistanche.com

IntroduktionSystemisk candidiasis er den fjerde almindelige nosokomiale infektion i blodbanen, som blev estimeret til at påvirke mere end 250000 intensivafdelingspatienter hvert år, på trods af administrationen af ​​hygiejnepraksis på hospitalerne (Delaloye & Calandra, 2014; Kullberg & Arendrup, 2015). Selvom den nuværende behandling af denne infektion hovedsageligt anvender svampedræbende lægemidler, forbliver dødeligheden blandt patienter alarmerende høj (40-60 procent) (Delaloye & Calandra, 2014; Bassetti et al, 2018; Lamoth et al, 2018). Alligevel er ingen vacciner klinisk tilgængelige til dato. Med den stigende befolkning af indlagte patienter, der lider af kroniske sygdomme og de nye tilfælde af resistens mod svampedræbende lægemidler, vil forståelsen af ​​værtens immunitet mod en sådan infektion være vigtig i udviklingen af ​​immunterapi for at forbedre eller komplementere de nuværende antifungale interventioner (Armstrong-James et al, 2017; Desai et al, 2017; Bassetti et al, 2018). Almindeligt kendt som de centrale aktører inden for invasiv antifungal immunitet, fagocytter, især polymorfonukleære fagocytter (neutrofiler) bruger forskellige mekanismer til at kontrollere svampeinfektioner, såsom fagocytose, frigivelse af reaktive oxygenarter (ROS) og mikrobicidproteiner og NETosis-dannelse ( Borregaard, 2010; Mantovani et al., 2011). Neutrofilers centrale rolle i Candida-immuniteten understreges yderligere af den kliniske sammenhæng mellem neutropeni og neutrofile defekter som de disponerende faktorer for systemisk candidiasis (Lehrer & Cline, 1969; Wisplinghoff et al, 2004; Pfaller & Diekema, 2007; Yapar, 2007; Yapar, 2007); . Der er imidlertid meget mindre kendt om forskellige mononukleære fagocytters roller i denne infektion in vivo, delvist på grund af manglen på tilgængelige værktøjer til at afgrænse de forskellige makrofager og dendritiske cellers undergrupper inyrer,som er de vigtigste målorganer for systemisk candidiasis (Schraml et al, 2013; Gottschalk & Kurts, 2015).

Nøgleord:nyre; nyreskade; nyrevæv; nyresvamp; nyreskade; nyrefunktion

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKTIONEN

Betydningen af ​​makrofager i invasiv Candida-immunitet er, så vidt vi ved, først blevet stærkt demonstreret af Lionakis et al (2013). Udnyttelse af CX3CR1gfp/gfp mus, hvori deres antal afnyremakrofagpopulationen er stærkt reduceret, Lionakis et al (2013) viste detnyreresidente makrofager er de afgørende førstelinjeforsvarere mod overfaldet af C. Albicans (Lionakis et al, 2013). Disse makrofager syntes også at være involveret i at regulere neutrofil rekruttering tilnyrerunder Candida-infektion (Kanayama et al, 2015). Udover at fremme svamperensning, blev makrofager rapporteret at spille en rolle inyrevævsreparation (Tran et al, 2015). CD169, også kendt som Sialoadhesin eller sialinsyrebindende immunoglobulin-lignende lektin 1 (Siglec-1), er tidligere blevet rapporteret at være en specifik markør, der identificerer vævsresidente makrofager (TRM'er) i forskellige perifere organer såsom lunger , milt, lever ognyrer(Purnama et al, 2014; Karasawa et al, 2015; Gupta et al, 2016; Svedova et al, 2017). Interessant nok,nyreCD169 plus makrofager er blevet forbundet med immunregulering, enten mod progression af immunopatologi eller immunopløsning, afhængigt af sygdoms-/skademodellerne (Chavez-Galan et al, 2015). Der er dog lidt kendt om den in vivo funktionelle rolle af CD169 plus makrofager i systemisk Candida-immunitet. Her viser vi detnyreCD169 plus plus makrofager er vigtige immunregulatorer ved akut systemisk Candida-infektion. Fraværet af CD169 plus plus makrofager mindsker IFN-respons og neutrofil ROS-produktion inyrer.Som et resultat bukker mus, der mangler CD169 plus plus makrofager under for en lavdosis Candida-infektion, der udviser overordentlig høj svampebelastning og alvorlignyreimmunopatologi.

Resultater

CD169 plus plus makrofager er en subpopulation af renale TRM'erFor at undersøge renale TRM'er udnyttede vi en CD169-DTR transgen musemodel, der specifikt fjerner TRM'er ved behandling med difteritoksin (DT) på grund af deres CD169-udtryk (Purnama et al, 2014; Gupta et al, 2016; Chen & Ruedl , 2020). Udover CD169 blev et højt ekspressionsniveau af F4/80 og et mellemniveau af CD11b brugt i vores med-cytometrianalyse til at skelne TRM'er fra andre makrofag-subpopulationer (Sheng et al, 2015) (Fig 1A). Interessant nok er det kun en delvis befolkning pånyreF4/80hi CD11bint makrofager blev fjernet i vores DT-behandlede CD169-DTR transgene mus (fig. 1A og B), hvilket tyder på heterogenitet af F4/80hi CD11bint makrofagpopulationen inyre.Parallelt med vores observation påpegede Karasawa et al (2015) også, at kun en delmængde afnyreTRM'er udtrykker CD169 (Karasawa et al, 2015). Især viste de, at CD169 plus plus TRM'er hovedsageligt lokaliseres inyremedullær region, hvilket bekræfter vores immunfluorescensfarvninger (fig. 1C).

Her bemærkede vi, at ablerede CD169 plus plus TRM'er udtrykker moderat lavere niveauer af F4/80 og CD11b (F4/80 plus plus CD11b plus), mens de uformindskede TRM'er udtrykker forholdsvis højere niveauer af F4/80 og CD11b (F4/80 plus plus). plus CD11b plus plus ). Imidlertid kan disse to TRM-populationer ikke skelnes i WT-mus (fig. 1A). Derfor, baseret på de ablerede og uformindskede TRM'er, underkategoriserede vi dem bredt i fraktion I (Fr I) (CD169 plus plus F4/80 plus plus CD11b plus ) og fraktion II (Fr II) (CD169 plus F4/80 plus plus plus plus CD11b plus plus) populationer (fig. 1A og B). Bemærkelsesværdigt, den mærkbare, men dog ubetydelige reduktion af Fr II-populationen i CD169-DTR-mus indikerer også, at nogle af Fr II-populationen udtrykker CD169. TRM-ablationsprofilen i CD169-DTR-mus er i overensstemmelse med CD169-transkriptekspressionen, hvor Fr I-populationen udtrykker et signifikant højere niveau af CD169 sammenlignet med Fr II-populationen (fig. 1D). Tilsvarende blev højere niveauer af human heparin-bindende EGF-lignende vækstfaktor (HB-EGF), receptoren for DT, observeret i Fr I sammenlignet med Fr II TRM'er, hvilket forklarer deres modtagelighed for DT-behandling (fig. 1E).

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESVIGT

Fraværet af nyre-CD169 plus plus makrofager kompromitterede i høj grad værtens modstand mod dissemineret candidiasisFor at vurdere vigtigheden af ​​CD169 plus plus makrofager blev CD169-DTR og WT mus iv udfordret med en lav dosis på 5 × 104 cfu C. Albicans, og deres overlevelse blev overvåget i 18 dage. I løbet af infektionen blev musene kontinuerligt behandlet med DT for at sikre kontinuerlig ablation af Fr I-populationen i CD169-DTR-mus (Fig S1). En delvis reduktion af Fr I-makrofager blev også observeret i inficerede WT-mus på dag 3 efter infektion (pi) (fig. 1F), hvilket kunne være et resultat af makrofag-nekroptose, en hændelse, der er blevet rapporteret at forekomme under patogene infektioner (Lai et al. , 2018; Cao et al, 2019). Omvendt skyldtes den fulde ablation af Fr I-makrofager i CD169-DTR-mus overvejende apoptose induceret af DT-behandling. Ikke desto mindre var antallet af Fr I-makrofager i CD169-DTR-mus konsekvent og væsentligt lavere end dem i WT-musene gennem hele infektionsforløbet. På den anden side var det samlede antal Fr II-makrofager sammenlignelige mellem inficerede WT- og CD169-DTR-mus (fig. 1F, højre panel). Følgelig var CD169-DTR-mus, som manglede Fr I TRM'er, markant mere sårbare end WT-mus, når de blev udfordret med systemisk Candida-infektion (fig. 1G).

CX3CR1gfp/gfp mus er tidligere blevet brugt til at udspørge funktionen afnyreTRM'er på grund af dets tab af totalnyreF4/80 plus CD11b plus population (Lionakis et al, 2013). Sammenligningen mellem CX3CR1gfp/gfp og CD169-DTR-mus giver os derfor mulighed for at forstå de funktionelle konsekvenser mellem det delvise og det totale tab af renal TRM-population. For at opnå dette inficerede vi CD169-DTR, CX3CR1gfp/gfp og WT mus med 5 × 104 cfu C. Albicans. I lighed med det, der tidligere blev rapporteret, udviste CX3CR1gfp/gfp-mus et fuldstændigt fravær af nyre-TRM'er (både Fr I- og II-populationer), hvorimod CD169-DTR-mus udviste et mere karakteristisk tab af Fr I-population (Fig. S2A og B ). Tilsvarende gjorde mangel på både Fr I- og II-makrofager CX3CR1gfp/gfp-mus til at være meget modtagelige over for systemisk candidiasis (Fig. S2C) med en overordentlig høj nyresvampebelastning allerede på dag 1 pi sammenlignet med inficeret WT og CD{{20 }}DTR-mus (Fig S2D). I modsætning hertil viste CD169-DTR-mus lavere dødelighed end CX3CR1gfp/gfp-mus (fig. 1G og S2C), og deresnyresvampebyrden var kun signifikant højere end de inficerede WT-mus på dag 10 (fig. 2A og B). Da DT-behandlede CD169-DTR- og CX3CR1gfp/gfp-mus mangler TRM'er i andre organer (Hochheiser et al, 2013; Gupta et al, 2016; Lee et al, 2018), vurderede vi svampebelastningen i flere perifere organer , det er,nyre,hjerne, hjerte, lunge, lever og milt i inficerede WT-, CD169-DTR- og CX3CR1gfp/gfp-mus på dag 1 pi Spændende, i både CD169-DTR- og CX3CR1gfp/gfp-mus, nyrer var de eneste organer, der viste tydeligt højere svampebelastning end resten af ​​de undersøgte organer (Fig S2D). Den forhøjede mængde Candida-byrde i CX3CR1gfp/gfp-nyrer på dag 1 bekræfter resultaterne rapporteret af Lionakis et al (2013), hvorinyreTRM'er er afgørende fornyreførstelinjeforsvar mod systemisk Candida-infektion (Lionakis et al, 2013).

På den anden sidenyresvampebyrden i CD169-DTR-mus var signifikant lavere end dem i CX3CR1gfp/gfp-mus, men ikke tydeligt højere end den inficerede WTnyrerpå dag 1 pi (Fig S2D). Fordi Fr II-populationen forbliver relativt intakt i CD169-DTR-mus (Fig. S2A og B), stillede vi spørgsmålstegn ved, om den øgede resistens observeret i CD169-DTR-mus, sammenlignet med CX3CR1gfp/gfp-mus, hovedsagelig var på grund af de resterende uformindskede renale Fr II-makrofager, der fungerer til at forhindre de fleste C. Albicans i at invadere ind i nyretubuli, et område hvor meget få immunceller blev påvist under steady-state. Til dette formål overvågede vi svampebyrden af ​​forskellige organer i WT- og CD169-DTR-mus på dag 1, 3, 6 og 10 pi (fig. 2). Her viste vores data den nyrebegrænsede afhængighed af CD169 plus plus makrofager i svampeclearance, da alle de undersøgte organer, undtagen nyrer, i CD169-DTR-mus blev renset for C. Albicans på dag 10 pi (fig. 2A) . Interessant nok, på trods af tabet af Fr I-undergruppe, opstod svampebyrden i CD169- DTR-mus på samme måde som de inficerede WT-mus (dag 0-6) (fig. 2A og B), hvilket tyder på minimale roller af nyre-CD169 plus plus makrofager til at fremkalde førstelinjeforsvar mod denne infektion. Forskellen i nyresvampebyrde mellem CD169-DTR og WT-mus blev først påvist på dag 10 pi, hvor svampebelastningen af ​​CD169-depleterede nyrer fortsatte med at eskalere, hvorimod dem i WT-mus syntes at være indeholdt eller ryddet (fig. 2B). Derfor viser vores data den uundværlige rolle af CD169 plus plus makrofager i renal Candida-immunitet, men sandsynligvis med ringe bidrag til nyrernes førstelinjeforsvar mod en sådan infektion. Påfaldende nok, da CX3CR1gfp/gfp-mus manglede både Fr I- og Fr II-makrofager og udviste øget modtagelighed så tidligt som dag 1 pi (Fig. S2), antog vi, at Fr II CD169 plus makrofager overvejende er ansvarlige for den kritiske medfødte mekanisme af tidlig nyresvamp. styring.

CD169-DTR-mus led af irreversibel, progressiv nyreskade under Candida-infektionFordi nyrerne var de eneste organer, hvor C. Albicans akkumulerede under infektionen (fig. 2A), udførte vi derefter en histopatologisk undersøgelse af periodic acid-Schiff (PAS) (fig. 2C)- og H&E (fig. 3A og S3)-farvede snit opnået fra inficerede WT- og CD169-DTR-nyrer på dag 3, 6 og 10 pi På dag 3 blev der observeret tegn på nyreskade og blødninger i CD169-DTR-nyrer (Fig. S3A). På dag 6 viste inficerede WT-nyrer mindre tegn på tubulær og endotelskade, hvorimod inficerede CD169-DTR-nyrer viste mere alvorlige blødninger og tubulær nekrose (fig. S3B). I både inficerede WT- og CD169-DTR-nyrer så de fleste C. Albicans ud til at samle sig i nyrebækkenet (fig. 2C). Bemærkelsesværdigt var der en ophobning af leukocytter in situ i både WT og

CD169-DTR-nyrer, hvilket tyder på, at den ukontrollerede C. Albicans-vækst i CD169-DTR-nyrer ikke skyldes manglen på rekruttering af leukocytter (fig. 2C og 4A). På dag 10 forværredes den strukturelle integritet af CD169-DTR-nyrer, ledsaget af forekomsten af ​​fibrotisk væv (fig. 3A og S3C). Specifikt var udvidelsen af ​​Bowmans rum og fremtrædende udskillelse af tubulære epitelceller og klynger af leukocytter i lumen af ​​nogle nyretubuli af CD169-DTR-nyrer tydeligt synlige (fig. 3A). I modsætning hertil syntes de fleste nyreregioner i WT-nyrerne på dag 10 at forblive intakte, hvilket indikerer genopretning fra tidlig infektion (fig. 3A og S3C). Parallelt med de nyrehistologiske analyser vurderede vi niveauet af nyreskademolekyle-1 (Kim-1) i inficeret WT- og CD169- DTR-nyre, en type-1 transmembranprotein hvor dets udtryk kun forstærkes ved skade i nyretubuli (Ichimura et al,

1998; Han et al., 2002; Bonventre, 2009). Vores data viste, at ekspressionen af ​​Kim-1 i nyrerne af inficerede CD169-DTR-mus var drastisk højere end i den inficerede WT på dag 10 pi (fig. 3B). Derudover var integriteten af ​​endotelbeklædningen i nyrerne hos CD169-DTR-mus signifikant svækket, hvilket fremgår af en højere mængde af Evan's Blue tilbageholdt i CD169-DTR-nyrerne (fig. 3C). CD169 plus makrofager har tidligere vist sig at være anti-inflammatoriske, hvor fraværet af disse makrofager førte til overinflammation i bakteriel infektion eller iskæmi-reperfusionsskade (Karasawa et al, 2015; Svedova et al, 2017). I overensstemmelse med disse modeller var nyrer fra CD169-DTR-mus forbundet med højere niveauer af inflammation (dvs. TNF- , G-CSF og M-CSF), og nyrefunktionen viste sig at være dramatisk kompromitteret, når

Fraværet af nyre-CD169 plus plus makrofager hæmmede ikke rekrutteringen af ​​effektorceller under Candida-infektionFordi den ineffektive clearance af Candida i CD{{0}}DTR-nyrer kunne skyldes manglen på rekruttering af effektorceller, overvågede vi neutrofil og monocytisk infiltration i nyrerne hos WT- og CD169-DTR-mus på dag 0, 1, 3, 6 og 10 pi I lighed med vores histologiske observationer (fig. 2C), påvirkede fraværet af nyre-CD169 plus plus Fr I-makrofager ikke rekrutteringen af ​​leukocytter under infektionen (fig. 4A). I stedet var CD169-DTR-nyrer forbundet med højere ekspression af neutrofil- og monocyt-tiltrækkende kemokiner (f.eks. CXCL1, CXCL2 og CCL2) og celleadhæsionsmolekyler (f.eks. ICAM-1) (fig. 4B og C). Det øgede niveau af kemokiner i CD169-DTR nyren, potentielt på grund af den uhæmmede vækst af C. Albicans, korrelerer med en forhøjet mængde af immuncelleinfiltration fra dag 6 til 10 pi. I modsætning hertil var der få tegn på C. Albicans i WT-nyrer og immunceller blev stort set fjernet på dag 10 pi (fig. 2B og 4A). Vores data tyder således på, at nyre-CD169 plus plus makrofager ikke var de vigtigste aktører i rekruttering af effektorceller, især neutrofiler, under Candida-infektion.

Neutrofiler i CD169-DTR-nyrer genererer lavere ROS-produktionDernæst fortsatte vi med at undersøge, om manglen på CD169 plus plus makrofager har en negativ indvirkning på værtens candidacidal respons i nyrerne. Til dette formål vurderede vi mængden af ​​ROS-producerende neutrofiler og monocytter i inficerede WT- og CD169-DTR-nyrer på dag 6 pi – dagen hvor både WT- og CD169-DTR-nyrer udviste lignende svampebyrde og cellulær infiltration (fig. 2B og 4A). Interessant nok observerede vi en lavere mængde af ROS-producerende neutrofiler, men ikke monocytter, i CD169-DTR-nyrer sammenlignet med WT (fig. 5A og B). Tilsvarende genererede disse neutrofiler i CD169-DTR-nyrer signifikant lavere niveauer af ROS end dem i WT, hvilket tyder på lavere neutrofildræbende evne (fig. 5C og D).

Vi forsøgte dernæst at bestemme, om den nedsatte candidacidale funktion i CD169-DTR-nyrer var bidraget af neutrofilers reducerede levedygtighed. Overraskende nok viste både inficerede WT- og CD169-DTR-nyrer en tilsvarende andel af PIneg annexin V plus apoptotisk og PI plus annexin V plus døde neutrofiler (fig. 5E og F). Dette indikerer, at neutrofilers levedygtighed ikke er en af ​​de faktorer, der bidrager til deres kompromitterede candidacidal funktion i CD169-DTR nyrer Renal IFN ekspression var signifikant lavere i fravær af CD169 plus plus makrofager. Sammenhængen af ​​ineffektiv Candida clearance og nedsat ROS niveauer i neutrofiler fra CD169-DTR nyrer fik os til at undersøge ekspressionsniveauet af IFN i inficerede WT og CD169- DTR nyrer på dag 6 pi. Dette cytokin har været kendt for at være beskyttende mod invasiv candidiasis ved at forstærke neutrofilers candidacidale evne (Diamond et al, 1991; Kullberg et al, 1993; Stevenhagen & van Furth, 1993; Nader-Djalal & Zadeii, 1998). Spændende observerede vi formindsket renal IFN-ekspression i inficerede CD169-DTR-nyrer ved qPCR (fig. 6A) såvel som ved anden cytometrianalyse (fig. 6B).

IFN-producerende celler er begrænset til en CD19int kappa-let kæde plus cellepopulationDernæst forsøgte vi at afgrænse typen af ​​immunceller, der producerer IFN på dag 6 pi (fig. 7A). Til vores overraskelse er disse IFN-producerende celler Ly6CintLy6Glo, F4/80loCD11blo, MHCII plus CD11clo, CD49bnegCD3neg og CD8negCD4neg, hvilket indikerer, at de ikke er T-lymfocytter, klassiske APC'er og granulocytter. I stedet udtrykker disse IFN-producerende celler, som er reduceret tydeligt i inficerede CD169-DTR-nyrer (Fig. 7B), MHCII, kappa-let kæde og CD19int, hvilket tyder på en B-celle-lignende population (Fig. 7A) . Fordi NK-celler er vigtige modulatorer til at forstærke fagocytters antifungale mekanismer ved IFN-sekretion i Candida-infektioner (Bhatnagar et al, 2010; Costantini et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al, 2014), søgte vi sidst at bekræfte, om NK-celler er nødvendige for at regulere produktionen af ​​IFN i denne infektion. Til dette formål immundepleterede vi NK-celler in vivo og vurderede ekspressionsniveauet af IFN i inficerede nyrer på dag 2 og 6 pi. Vores data viste, at udtømning af NK-celler ikke påvirkede produktionen af ​​IFN eller mængden af ​​IFN-producerende celler ( Fig. S4A-C).

Diskussion

TRM'er medierer vigtige medfødte reaktioner i forskellige infektionssygdomme og er generelt anerkendt som F4/80hi og CD11b plus populationer. Sialoadhesin, også kendt som CD169, blev fremhævet til kun at blive udtrykt af en undergruppe af TRM i nyren (Karasawa et al, 2015); der var dog ingen efterfølgende rapport om renal CD169 plus TRM. Vores data understøtter de seneste resultater om, at nyre-TRM'er ikke er homogene, og de kan bredt underkategoriseres i to undergrupper, nemlig F4/80 plus plus

CD11b plus (CD169 plus plus ) TRM'er og F4/80 plus plus plus CD11b plus plus (CD169 plus ) TRM'er. Ved at bruge CX3CR1gfp/gfp og CD169-DTR-mus konkluderede vi, at både CD169 plus plus TRM og CD169 plus TRM er uundværlige for systemisk Candida-immunitet, hvor hver undergruppe udviser forskellige funktioner i Candida-nyreimmunitet. Specifikt ser CD169 plus plus TRM ud til at være afgørende for at kontrollere renal C. albicans-udvækst på det senere stadium af infektionen, hvorimod CD169 plus TRM ser ud til at være afgørende i nyrernes førstelinjeforsvar ved at begrænse svampevækst i den indledende fase af infektionen. Tilsvarende resulterede mangel på CD169 plus plus TRM i en markant reduktion af ROS-produktion i neutrofiler og nyre-IFN. Yderligere undersøgelser er berettigede for at forstå mekanismerne i funktionen af ​​renal CD169 plus plus TRM til at kontrollere svampeudvækst og IFN-produktion.

Vores data viste, at nyren er det primære målorgan, hvor C. albicans fortsætter, og dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der indikerer vigtigheden af ​​renal immunitet i eksperimentel dissemineret candidiasis og efterfølgende musedødelighed (Spellberg)

et al., 2003; MacCallum & Odds, 2005; Lionakis et al, 2011; Navarathna et al, 2012, 2019; Hebecker et al., 2016). Især, på trods af ablationen af ​​TRM'er i alle perifere organer i CD169-DTR-mus, forblev nyrerne som det eneste organ med vedvarende C. Albicans, hvilket fremhæver den særlige rolle, som nyre-TRM'er spiller i systemisk Candida-immunitet. Selvom nyren er det primære målorgan måske ikke afspejles konsekvent i menneskelige modparter, menes nyreimmunitet stadig at være en integreret del af værtens modstand mod denne infektion, fordi alvorlig nyre-Candida-infektion er blevet observeret hos immunkompromitterede patienter (Lionakis, 2014; Xu & Shinohara, 2017). Den ukontrollerede C. albicans-vækst i nyrerne er tidligere blevet begrundet med den langsomme eller forsinkede rekruttering af medfødte myeloidceller (Lionakis et al, 2011). I vores infektionsmodel observerede vi imidlertid funktionel infiltration af immunceller i nyrerne hos WT-mus. Derudover blev CXCL1 og CCL2 i inficerede WT-nyrer beskrevet som værende påviselige så tidligt som 12 timer efter infektion, hvilket understøtter hurtig rekruttering af medfødte myeloidceller (MacCallum et al, 2009). Rekruttering af immunceller er også blevet rapporteret at være reguleret af makrofager, DC'er, epitel- og endotelceller (Netea et al, 2002; Tuite et al, 2004; Tran et al, 2015). Specifikt har makrofager vist sig at rekruttere neutrofiler i det tidlige stadium af infektion via CXCL2-ekspression (Kanayama et al, 2015; Xu & Shinohara, 2017). Ikke desto mindre udviste CD169-DTR-mus lignende cellulær rekruttering til nyrerne som WT-musene, hvilket tyder på, at orkestreringen af ​​cellulær infiltration ikke initieres eller assisteres af CD169 plus plus TRM'er.

For nylig rapporterede Karasawa et al (2015) en lille undergruppe af nyre-Ly6Clo-monocytter, der er bosat i vaskulaturen, der udtrykker CD169 (Karasawa et al, 2015), og sammen med CD169 plus makrofager fremkalder en kritisk rolle i forebyggelsen af ​​overdreven inflammation i nyreiskæmi- reperfusionsskade. Vaskulær-associerede TRM'er er også blevet beskrevet i andre organer såsom tarmen (Honda et al, 2020) og fedtvæv (Silva et al, 2019), hvor de understøtter vaskulær tonus og integritet (upublicerede data); derfor kan vaskulært associerede monocytter/TRM'er potentielt have en lignende rolle i nyrerne og bidrage til progressionen af ​​systemisk candidiasis. Forståelse af renale makrofager har været begrænset på grund af manglen på tilgængelige værktøjer og fænotypiske markører til at afgrænse disse mononukleære fagocytter (Gottschalk & Kurts, 2015; Kurts et al, 2020). På trods af forsøgene på at forstå nyremakrofager gennem afstamningssporing og transkriptionelle undersøgelser (Hochheiser et al, 2013; Cao et al, 2015; Munoz et al, 2019; Liu et al, 2020; Salei et al, 2020), er meget mindre blevet kendt for funktionerne af renal TRM undergrupper i infektionssygdomssammenhænge. Selvom nyremakrofager tidligere har vist sig at være i stand til direkte at begrænse C. albicans vækst og invasion i nyretubuli, tyder vores data på, at CD169 plus plus TRM-undergruppen ikke deltager i disse tidlige beskyttelsesmekanismer (Marcil et al, 2002; Lionakis et al, 2013; Munoz et al, 2019). I stedet tyder data fra CX3CR1gfp/gfp-mus på, at CD169 plus TRM-undergruppen er den vigtigste effektorpopulation til at give initialt nyreforsvar mod C. Albicans-angreb.

Neutrofiler er de integrerede medfødte effektorceller i Candida-immunitet (Fulurija et al, 1996; Aratani et al, 1999; Netea et al, 2015), og patienter, der lider af neutropeni og neutrofile defekter, har højere risiko for invasiv candidiasis (Lionakis & Netea, 2013). Betydningen af ​​den oxidative dræbende effektor-vej understreges af resultaterne af, at kronisk granulomatøs sygdom og myeloperoxidase-mangel, hvor ROS-produktion er defekt i neutrofiler, hæmmer C. albicans-drab hos både patienter og mus (Aratani et al, 1999, 2002, Lehrer & Cline, 1969). Tilsvarende tyder fraværet af CD169 plus plus TRM'er, der førte til en signifikant reduktion af ROS plus neutrofiler, og overraskende nok ikke monocytter, at den ukontrollerede vækst af renal C. Albicans sandsynligvis skyldtes reduceret neutrofils svampedræbende kapacitet

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESMERTER

Betydningen af ​​IFN i systemisk candidiasis er blevet godt afbildet i en eksperimentel murin model, hvor IFN-mangel hos knockout-mus øger deres modtagelighed for denne infektion (Balish et al, 1998; Cenci et al, 1998; Kaposzta et al, 1998). Endvidere er det blevet påvist, at administration af IFN øger neutrofilers og makrofagers fagocytiske og svampedræbende kapacitet, hvilket igen forbedrer patienters modstand mod invasiv candidiasis (Djeu et al, 1986; Malmvall & Follin, 1993; Marodi et al, 1993). ). I vores TRM-udtømmende musemodel observerede vi konsekvent nedregulering af nyre-IFN i fravær af CD169 plus plus TRM, hvilket tyder på involvering af CD169 plus plus TRM i enten initiering eller vedligeholdelse af IFN-ekspression. Mens den beskyttende rolle af IFN i dissemineret candidiasis er tydelig, har IL17-medieret beskyttende respons i denne model for det meste været kontroversiel (Balish et al, 1998; Lavigne et al, 1998; MacCallum, 2009; Kashem et al, 2015 ; Mengesha & Conti, 2017). Ikke desto mindre har IL17-medieret immunitet været kendt for at være afgørende for oral og dermal candidiasis (Conti & Gaffen, 2010; Netea et al, 2015; Mengesha & Conti, 2017). I vores model påvirkede ablationen af ​​CD169 plus plus TRM ikke IL17-ekspressionsniveauet. Faktisk observerede vi ikke meget IL17-ekspression i inficerede WT-nyrer (data ikke vist). I lighed med vores observationer rapporterede LeibundGut-Landmann et al (2007) en signifikant højere mængde IFN end IL17 i inficerede WT-mus (LeibundGut-Landmann et al, 2007), hvilket indikerer, at IFN-medieret immunitet er mere udtalt i systemisk candidiasis. En anden undersøgelse, der bekræftede den gavnlige rolle af IFN i Candida-immunitet var beskyttelsen fremkaldt af adoptiv overførsel af IFN-producerende Th1-celler, men ikke IL-17-producerende Th17-celler, mod systemisk candidiasis (Kashem et al, 2015).

Som et første skridt mod at afsløre den spændende sammenhæng mellem CD169 plus plus TRM, IFN og neutrofiler, forsøgte vores piloteksperiment at afsløre cellekilden til IFN i vores model. NK-celler, som er tidlige IFN-producenter, har vist sig at være i stand til at genkende C. Albicans og potentiere neutrofilers svampedræbning gennem sekretion af IFN og GM-CSF (Bhatnagar et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al. al, 2014; Whitney et al, 2014; Dom´ınguez-Andres et al, 2017 ´). Derudover er det vist, at 5-10 procent af NK-cellerne producerer IFN i Candida-inficerede nyrer (Whitney et al, 2014). Til vores overraskelse observerede vi ikke IFN plus NK-celler, og vi observerede heller ikke nedregulering af IFN i fravær af NK-celler i vores model. Denne observerede uoverensstemmelse kan skyldes vurderingen af ​​IFN-producerende celler på forskellige tidspunkter. Specifikt vurderede vi IFN-produktionen på dag 6 pi, et tidspunkt, der var meget senere sammenlignet med Whitneys gruppe, det vil sige 16 h pi. Derfor er NK-celler muligvis ikke involveret i opretholdelsen af ​​IFN-produktion for denne infektion. Interessant nok rapporterede Murciano et al., at dræbte C. Albicans-gær hæmmer IFN-frigivelse fra NK-celler (Murciano et al, 2006). En anden sandsynlig årsag til uoverensstemmelsen kunne være den eksperimentelle metode, der blev brugt til at undersøge IFN-sekretion. I denne artikel blev monesin, en proteinsekretionshæmmer, administreret direkte til musene, og den cellulære IFN-produktion blev efterfølgende vurderet uden ex vivo celleinkubation. På den anden side i undersøgelsen af ​​Whitney et al (2014), før IFN

analyser blev nyreceller først forberedt og inkuberet i kultur med en proteinsekretionshæmmer i 7 timer (Whitney et al, 2014). Overraskende nok ser andre lymfoide og myeloide undergrupper undersøgt i vores undersøgelse, især CD169 plus plus TRM, heller ikke ud til at udtrykke IFN, på trods af undersøgelser, der rapporterer direkte sekretion af IFN fra makrofager (Bogdan & Schleicher, 2006). I stedet tyder vores data på, at de store IFN-producenter er begrænset til en B-lignende cellepopulation. Spændende nok er en lignende underpopulation af medfødte B-celler, der producerer IFN, blevet rapporteret at være afgørende for regulering og initiering af tidlig medfødt immunrespons af intracellulære bakterielle infektioner (Bao et al, 2014; Krocova et al, 2020). Derudover afslørede andre tidligere værker, at modne B-celler, når de primes af T-celler og stimuleres af patogener eller TLR-ligander, kan udskille IFN (Gray et al, 2007; Lund & Randall, 2010). Selvom det ikke er ualmindeligt for B-celle-IFN-aksen i mikrobielle infektioner, er fremtidige undersøgelser påtrængende nødvendige for at profilere denne nyre-IFN plus B-celle-lignende population og identificere dens forhold til CD169 plus plus TRM i nyren. Sammenfattende konkluderer vi, at nyre-TRM'er kan underklassificeres i to hovedpopulationer baseret på CD169-ekspressionen. Endnu vigtigere er det, at disse to undergrupper rummer ikke-redundante beskyttende funktioner i dissemineret candidiasis, som giver indsigt i det cellulære grundlag for beskyttende værts medfødte immunitet mod C. Albicans. Disse åbenbaringer bør være nyttige i det fremtidige design af terapeutiske interventioner.

Materialer og metoder

MusCD169-DTR-transgene mus blev genereret i vores laboratorium i BALB/c genetisk baggrund som beskrevet tidligere (Purnama et al, 2014) og efterfølgende krydset med C57BL/6 i 10 generationer. CX3CR1gfp/gfp-mus blev købt fra The Jackson Laboratory. CD169-DTR C57BL/6 transgene mus, sammen med WT C57BL/6, blev opdrættet og vedligeholdt under specifikke patogenfrie forhold i Nanyang Technological University (NTU) dyrefacilitet. Hanmus (7-10 uger gamle) blev brugt til Candida-infektion. Alle forsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee under nummeret ARF-SBS/NIE A-0380AZ.

C. albicans infektionDet kliniske isolat C. Albicans-stamme SC5314 blev dyrket på en gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD)-plade i 24 timer ved 30 grader, efterfulgt af 16-18 timer i YPD-medier. C. albicans suspension blev centrifugeret, vasket og talt. Til infektion blev 5 × 104 cfu C. albicans injiceret iv i hver mus. Til rIFN-behandling blev inficerede mus behandlet med 10,000 U rekombinant IFN (R&D Systems) dagligt. Mus blev overvåget og vejet dagligt under infektionsforløbet. Difteritoksin-medieret og antistof-medieret ablations-DT (10 ng/g kropsvægt) blev fremstillet i PBS suppleret med 1 procent museserum. CD169-DTR- og WT-mus blev administreret ip med DT i henhold til infektionsskemaet (Fig S1)

Til udtømning af NK-celler blev mus administreret ip med 100 ug antimuse NK1.1 (PK136; Invivomab) antistof dagligt.

SvampebelastningsanalyserHjerne, hjerte, lunger, lever, nyrer og milt blev høstet på angivne tidspunkter for infektion, vejet og hakket før inkubering med 1 mg/ml collagenase D i fordøjelsesmedium i 1 time ved 37 grader. Prøver blev resuspenderet gentagne gange indtil ingen synlige aggregater. Seriefortynding blev udført og udpladet på YPD-plader. Pladerne blev inkuberet i 48 timer ved 30 grader. CFU blev bestemt ved manuel optælling af kolonierne. Svampebelastningen blev udtrykt som CFU pr. gram organ.

Vævsindsamling, behandling og isolering af enkeltcellesuspensionNyrerne blev høstet, hakket og inkuberet med 1 mg/ml collagenase D i fordøjelsesmedium i 1 time ved 37 grader. De hakkede nyrer blev pipetteret op og ned gentagne gange, indtil der ikke var nogen synlige aggregater. Efter centrifugering ved 330 g i 5 minutter blev cellepelleterne resuspenderet med 5 ml 35 procent Percoll (GE Healthcare Life Science) og centrifugeret ved 600 g i 15 minutter. Supernatanter blev kasseret, og cellepelleter blev resuspenderet med 5-ml RBC-lysebuffere. Efter lysis blev cellesuspensioner centrifugeret og resuspenderet med IMDM 2 procent. Enkeltcellesuspensionerne blev opbevaret ved 4 grader indtil videre anvendelse. Til celletælling blev små portioner af cellesuspensioner, forblandet med trypanblåt, talt ved anvendelse af et hæmocytometer. Til cellesortering blev nyre-enkeltcellesuspensioner inkuberet med rotte-anti-muse-CD16/32 (2,4G2, 1 mg/ml), efterfulgt af FL-fluorescerende antistoffer mod overfladeantigener muse-CD45 (30F11), F4/80 (BM8), og CDllb (M1/70). Farvede celler blev vasket én gang og passeret gennem et 40-μm filter, før de blev sorteret på en 4-laser BD FACSAria II cellesorter (BD Bioscience).

Flowcytometrianalyser Enkeltcellesuspensioner blev inkuberet med rotte-anti-muse CD16/32 (2,4G2, 1 mg/ml) ved 4 grader i 15 minutter (1:100) i FACS-buffer (PBS suppleret med 2 procent FCS) for at blokere Fc-receptorer. Til farvning af overfladeantigener blev cellerne inkuberet med fluorochrom-konjugerede antistoffer mod muse CD45 (30F11), F4/80 (BM8), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) og Ly6C (HK1.4) ved 4 grad i 20 min. Farvede celler blev vasket én gang og resuspenderet i FACS-buffer til erhvervelse på en fem-laser BD LSRFortesssa X-20 (BD Biosciences). Til påvisning af intracellulær cytokin IFN blev nyre-enkeltcellesuspensioner fremstillet fra mus behandlet med proteinsekretionsblokker monensin i henhold til protokollen (Sun et al, 2009). Kort fortalt blev hver mus injiceret iv med 250 µl PBS indeholdende 100 µg monensin (M5273; Sigma-Aldrich), 5 timer før organisolering og efterfølgende fremstilling af nyre-enkeltcellesuspensioner. Cellerne blev inkuberet med rotte anti-mus CD16/32 antistof efterfulgt af farvning med fluorescerende antistoffer mod overfladeantigen mus CD45 (30F11), CD11b (M1/70), F4/80 (BM8), Ly6G (1A8), Ly6C (HK1) .4), CD3ε (145-2C11), CD49b (HMa2), CD19 (1D3), CD4 (GK1.5), CD8 (53.6-7), CD11c (N418), MHCII (M5/114.15.2) ), og lg κ let kæde (RMK-45). Farvede celler blev vasket én gang med FACS-buffer efterfulgt af fiksering (2 procent PFA) og permeabilisering (0,05 procent saponin) før inkubering med anti-IFN-antistof (1:500; BioLegend) i 0,05 procent saponinopløsning. Farvede celler blev vasket én gang og resuspenderet i FACS-buffer til erhvervelse på en fem-laser BD LSRFortesssa X-20 (BD Bioscience). Til påvisning af celledød og apoptose blev nyre-enkeltcellesuspensioner initialt inkuberet med rotte-anti-muse CD16/32-antistof efterfulgt af farvning med fluorescerende antistoffer mod overfladeantigen mus CD45 (30F11), CD49b (HMa2), CD3ε ({{101 }}C11), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) og Ly6C (HK1.4). Farvede celler blev vasket én gang med FACS-buffer og 1x annexin V-bindingsbuffer (BioLegend) før inkubering med FITC-konjugeret annexin V ifølge producentens instruktioner (BioLegend). Farvede celler blev vasket én gang og resuspenderet i 1 x annexin V-buffer indeholdende propidiumiodid (PI, 1 ug/ml) før erhvervelse på en fem-laser BD LSRFortessa X-20 (BD Bioscience).

ROS-detektionsassayEnkeltcellesuspensioner blev vasket og inkuberet med 2,5 ug/ml H2DFFDA med eller uden 100 ug/ml zymosan i 60 minutter ved 4 grader eller 37 grader. Cellerne blev derefter vasket to gange med IMDM 2 procent og farvet med fluorochrom-mærkede antistoffer ved 4 grader i 20 minutter. Farvede celler blev vasket og resuspenderet i FACS-buffer indeholdende PI til erhvervelse på en fem-laser BD LSRFortessa X-20 (BD Bioscience). Data blev normaliseret baseret på de tilsvarende celler inkuberet i 4 grader.

Serum kreatininBlodsera blev opsamlet fra mus på dag 10 pi. Serumkreatininniveauer blev kvantificeret ved hjælp af muse Cr (Creatinine) ELISA Kit (Elabscience) i henhold til producentens instruktioner

Evans blå assayBlodkarpermeabilitet blev vurderet i overensstemmelse med Radu og Chernoff (2013). Kort fortalt blev uinficerede og inficerede WT- og CD169-DTR-mus injiceret iv med 200 ul 0,5 procent Evans blue/PBS. 30 minutter senere blev musene aflivet, og deres organer blev opsamlet, vejet og inkuberet i 100 procent formamid i mikrofugerør i 48 timer. Evans blå-infunderet formamid (0,5 ml) blev overført til engangspolystyrenkuvetter uden at overføre nogen vævsstykker. Absorbanser ved 610 nm blev registreret, og disse værdier blev normaliseret efter vægten af ​​organerne.

Histologiske analyserTil immunfluorescensfarvning blev høstede nyrer indlejret i Optimal Cutting Temperature-forbindelse (OCT Tissue Tek) og opbevaret ved -80 grader. 6-µm sektioner blev skåret og fikseret i acetone i 10-15 min. Sektioner blev inkuberet med Fc-blok i 20 minutter, vasket og inkuberet med FL-fluorescerende antistoffer i 1 time. Vaskede sektioner blev derefter monteret med DAKO FL fluorescerende monteringsmedium. Billeder blev taget ved hjælp af et Nikon Eclipse 80i mikroskop ved 20× objektiv forstørrelse. Til H&E- og PAS-farvning blev udslettede mus perfunderet med 4 procent PFA (Sigma-Aldrich). Høstede nyrer blev inkuberet i 4 procent PFA i 24 timer ved stuetemperatur, dehydreret og indlejret i paraffin (Paraplast Plus; Leica). Paraffin-indlejrede blokke blev derefter opdelt i 6-μm sektioner. Sektioner blev afparaffiniseret i xylen i 20 minutter og rehydreret. Til hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning blev sektionerne farvet med modificeret Mayers opløsning hæmatoxylin (Abcam) og modfarvet med eosin (Sigma-Aldrich). Efter rensning med xylen blev sektionerne monteret med DPX Mountant (SigmaAldrich). Til PAS-farvning blev sektionerne inkuberet med en periodisk syreopløsning (Abcam), vasket og farvet med Schiffs opløsning (Abcam). Herefter blev sektionerne modfarvet med modificeret Mayers opløsning hæmatoxylin (Abcam). Efter rensning med xylen blev sektionerne monteret med DPX monteringsmiddel (Sigma-Aldrich). Billederne blev taget ved hjælp af Eclipse 80i mikroskop (Nikon) med Digital Sight DS-U3 (Nikon) og NIS-Elements D software (Nikon) ved 4× 10×, 20× og 100× forstørrelser.

Kvantitativ realtids-PCRHøstede nyrer blev straks homogeniseret i TRIzol (Thermo Fisher Scientific) under anvendelse af en homogenisator (CAT X360). RNA'er blev ekstraheret i henhold til producentens instruktioner (RNAsimple Total RNA kit; Tiangen Biotech Ltd). Enkeltstrenget cDNA-syntese fra det oprensede RNA blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner (Promega M-MLV revers transkriptase). Real-time PCR blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner ved brug af Primerdesign Precision FAST-protokollen (Primerdesign Ltd). Primersekvenser var som følger: CXCL1; Fwd: ACTGCACCCAAACCGAAGTC, Rev: TGGGGACACCTTTTAGCATCTT. CXCL2; Fwd: ACAGAAGTCATAGCCACTCTC, Rev: CCTTGCCTTTGTTCAGTATC. CCL2; Fwd: CATCCACGTGTTGGCTCA, Rev: GATCATCTTGCTGGTGAATGAGT. TNF-; Frem: TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG, Rev: GGTCTGGGCCATA GAACTGA. G-CSF; Fwd: GTGCTGCTGGAGCAGTTGT, Rev: TCGGGATCCCCAGAGAGT. GM-CSF; Fwd: GCATGTAGAGGCCATCAAAGA, Rev: CGGGTCTGCACACATGTTA. M-CSF; Fwd: GGTGGAACTGCCAGTA TAGAAAG, Rev: TCCCATATGTCTCCTTCCATAAA. IL10; Fwd: CAGAGCCACATGCTCCTAGA, Rev: TGTCCAGCTGGTCCTTTGTT. ICAM-1; Fremad: AGTCCGCTGTGCTTTGAG, Rev: AGTCTCAGCTCCACACT. VCAM-1; Fremad: TCTTACCTGTGCGCTGTGAC, Rev: ACTGGATCTTCAGGGAAT GAGT. KIM-1; Fwd: AGATACCTGGAGTAATCACACTGAAG, Rev: TGA TAGCCACGGTGCTCA. CD169; Fwd: GCTGATACTGGCTTCTACTTCT, Rev: AGGTGGTCAGGTCTGGAGTAA. IFN-; Fwd: CACGGCACAGTCATTGAAAG, Rev: CCAGTTCCTCCAGATATCCAAG. -actin; Fwd: AAGGCCAACCGTGAAAAGAT, Rev: CTGTGGTACGACCAGAGGCATACA. hHB-EGF; Fwd: ATGACCACACAACCATCCTG, rev.: CCAGCAGACAGACAG ATGACA