Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche har en anti-aging effekt

Abstrakt

Baggrund: Det tidsrelaterede fald i regenerativ kapacitet og organhomeostase er et væsentligt træk vedaldring. Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus er blevet brugt som traditionelle kinesiske urtemedicin for øget immunitet og forlænget liv. Imidlertid er mekanismen, hvorved denne urtemedicin bremser aldring, ukendt. I denne undersøgelse undersøgte vi urtemidlets mekanismeanti-aging effekt.

Metoder: Mus blev fodret med diæter suppleret med R. glutinosa eller A. membranaceus i 10 måneder; kontrolgruppen blev fodret med en standarddiæt. Fænotyperne blev evalueret ved hjælp af et karaktersystem og overlevelsesanalyse. Procentdelene af senescensfænotyperne af hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) blev bestemt ved fluorescensaktiveret cellesorteringsanalyse. Funktionen og mekanismen af ​​HSC'er blev analyseret ved klonogen assay og real-time polymerase kædereaktion.

Resultater: Denanti-aging effektaf R. glutinosa skyldes den forbedrede funktion af HSC'er. Mus fodret med R. glutinosa udviste karakteristika af en langsomaldringproces, herunder nedsat senescens og øget overlevelsesrate. Flowcytometrianalyse viste et fald i antallet af Lin-Sca1 plus c-kit- (LSK)-celler, langtids-HSC'er (LT-HSC'er) og kortvarige HSC'er (ST-HSC'er) i R. glutinosa-gruppen. In vitro viste klonogene assays øget selvfornyelsesevne af LT-HSC'er fra R. glutinosa-gruppen samt opretholdelse af LSK-ro gennem opreguleret p18-ekspression. R. glutinosa-gruppen viste også nedsatte niveauer af reaktive oxygenarter og procentdelen af ​​-gal plus-celler gennem nedregulering af det cellulære senescens-associerede protein p53 og p16.

Konklusion: Rehmannia glutinosa udøveranti aldringeffekter ved at bibeholde roen og reducere ældning af HSC'er.

NØGLEORD: anti-aging, hæmatopoietiske stamceller, hvile, Rehmannia glutinosa

1|INTRODUKTION

Aldring er defineret som det tidsafhængige funktionelle fald, der påvirker de fleste levende organismer.1 Levetiden af ​​organismer opretholdes hovedsageligt af stamceller.2 Vævsspecifikke stamceller har kapacitet til selvfornyelse og differentieres til en række effektorceller. 3 Men under ældningsprocessen falder denne selvfornyelseskapacitet, hvilket i sidste ende fører til akkumulering af ikke-reparerede, beskadigede væv i ældede organismer.4 Tab af evnen til at opretholde en balance mellem hvile og differentiering i stam-/stamcellerne. kompartment kan resultere i død eller aldersrelaterede sygdomme.2 Endvidere tyder nyere undersøgelser på, at stamcelleforyngelse kan vende den aldrende fænotype.5,6 I det hæmatopoietiske system er hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) ansvarlige for blodcelleproduktion. Hos gamle mus viser det hæmatopoietiske system T- og B- lymfoide celleforringelser, og antallet af myeloide celler er øget. Ældre HSC'er viste reduceret selvfornyelsesaktivitet og reduceret hæmatopoiesis rekonstruktionsevne. Især er aldersrelaterede ændringer i HSC-afdelingen manifesteret i den aldrende vært som anæmi, øget tilbøjelighed til myeloproliferative neoplasmer, nedsat immunfunktion og øget kræftforekomst.7-9 Imidlertid er mekanismen bag HSC-aldring og virkningerne af naturlægemidler på HSC aldring er ukendt.10

Folk har været optaget af at forsinke aldringsprocessen og forblive ung fra oldtiden oganti aldringer et aktuelt forskningsfokus. Traditionel kinesisk medicin har fået stigende opmærksomhed til behandling af forskellige aldringsrelaterede sygdomme. Mange urter, der bruges i traditionel kinesisk medicin, er kendt for at give positive virkninger mod aldring gennem forskellige mekanismer. Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus har været meget brugt på denne måde i tusinder af år.

Rehmannia glutinosa bruges til at behandle forskellige diabetiske lidelser, øge knoglemetabolismen ved osteoporose og hæmme leverbetændelse og fibrose. Derudover har denne urt andre effekter, herundermod træthed, antidepressive og neurobeskyttende egenskaber. I de sidste par år har farmakologiske undersøgelser af R. glutinosa og dets aktive komponenter hovedsageligt fokuseret på dets brede virkninger på blodet, endokrine, kardiovaskulære og nervesystemer.11-14 R. glutinosa har således vist sig at have et stærkt immunforsvar. ‐enhancement aktivitet, som har givet det teoretiske grundlag for videre studier.

Astragalus membranaceus besidder toniske, leverbeskyttende, diuretiske og slimløsende egenskaber15 og har vist sig at udvise immunmodulerende,16anti-inflammatorisk,ogantioxidantEffekter.17 Belysningen af ​​de molekylære mekanismer, der ligger til grund for virkningerne af traditionelle kinesiske lægemidler i klinisk praksis, er et vigtigt skridt hen imod deres verdensomspændende anvendelse, og dette emne er i øjeblikket et emne af intens forskningsinteresse.

I denne undersøgelse fodrede vi mus diæter suppleret med R. glutinosa og A. membranaceus i 10 måneder for at udforske den mekanisme, der ligger til grund for R. glutinosas evne til at øge levetiden.

2|MATERIALER OG METODER

2.1|Dyregruppering og behandling

C57BL/6J hunmus blev holdt i et patogenfrit miljø og fodret med en standarddiæt. Brugen af ​​dyr i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care and Use Committees fra Institute of Laboratory Animal Science ved Peking Union Medical College. Musene (i alderen 10 måneder) blev tilfældigt opdelt i tre grupper (n=20/gruppe). Kontrolgruppen blev fodret med en standarddiæt (Beijing HFK Biosicence, Beijing, Kina). Diæterne for de to andre grupper blev suppleret med henholdsvis malet R. glutinosa og A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang kinesisk medicin, Beijing, Kina), i en dosis på 200 mg/d i 10 måneder. Denne dosis blev valgt ved hjælp af normaliseringsmetoden for kropsoverfladeareal for at bekræfte lægemiddeldoserne fra humane undersøgelser til museundersøgelser. Kropsvægten blev bestemt hver anden måned, og overlevelse blev registreret dagligt.

2.2|Evaluering af graden af ​​alderdom

Et karakterscoresystem blev vedtaget for at evaluere graden af ​​ældning i henhold til kriterier defineret af Takeda et al.18 Hver kategori, der er anført i protokollen, blev udvalgt fra de kliniske tegn, der er forbundet med ældningsprocessen. Hver mus blev scoret ved 18 måneders alder, og scoren i hver kategori blev summeret for at bestemme den samlede karakterscore.

2.3|Flowcytometri

Celler blev høstet fra thymus, milt, perifert blod (PB) og knoglemarv (BM). Milten og thymus blev skåret ud med det samme, vasket med saltvand og vejet. Milte og thymus blev forsigtigt homogeniseret i en glashomogenisator, og cellerne blev suspenderet i sterilt fosfatpufret saltvand (PBS). Cellerne fra PB blev anvendt til lysering af røde blodlegemer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Cellerne fra BM blev isoleret ved at skylle både skinneben og lårben med steril PBS. Alle cellerne blev isoleret ved filtrering over et sterilt nylonnet og farvet i 30 minutter ved 4 grader med følgende fluorophor-konjugerede antistoffer: phycoerythrin (PE)-konjugeret anti-CD3 (G4.18), allophycocyanin (APC)-konjugeret antistoffer - CD4 (OX35) og PE-Cy7-konjugeret anti-CD8a (OX8). For BM-cellerne blev afstamningsmarkører farvet ved hjælp af biotin-konjugeret anti-mus CD4 (RM4-5), CD5 (53-7.3) CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER-119) og Gr1 (RB6-8C5), efterfulgt af farvning med antistoffet APC-eFluor 780-konjugeret streptavidin blev også opnået fra eBioscience (San Diego, CA, USA). Følgende antistoffer blev brugt til overfladefarvning: APC immunoglobulin (Ig)M (II/41), fluorescein isothiocyanat (FITC) IgD (11-26), PE-Cy7 Sca- 1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3-6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) og PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11). Alle antistoffer blev opnået fra eBiosciences (San Diego, CA, USA). Data blev indsamlet af en FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) og analyseret ved hjælp af FlowJo-software (Three Star, Ashland, OR, USA).

2.4|Cellecyklusanalyse

Til cellecyklusanalyse blev totale BM-celler farvet for stamcelleoverflademarkører (Lin-Sca-1 plus c-KitHigh; LSTK'er), derefter fikseret og permeabiliseret (00-5123-43; Becton Dickinson ) før farvning med FITC Ki‐

67 antistof og 7-aminoactinomycin D (7-AAD). Dataindsamling blev udført på FACS Aria II (Becton Dickinson). Data blev analyseret ved hjælp af FlowJo software.

2,5|Ældre-associeret gal-farvning

Ældringsassocieret (SA) -gal aktivitet blev også analyseret ved flowcytometri ved anvendelse af C12FDG som beskrevet af producenten (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kort fortalt blev stamceller først farvet for celleoverflademarkører og derefter inkuberet med 100 nmol L-1 bafilomycin A1 i 1 time ved 37 grader for at inducere lysosomal alkalinisering. Efter vask med PBS blev celler inkuberet med en 2 mmol L-1 C12FDG i 1-2 timer ved 37 grader og derefter analyseret ved hjælp af en FACS Aria I (Becton Dickinson).

2,6|Bestemmelse af produktion af reaktive oxygenarter (ROS).

Celler blev inkuberet med dichlor-dihydro-fluoresceindiacetat (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, Kina) ved 37 grader i 20 minutter. DCFH-DA diffunderer passivt ind i celler, hvor det deacetyleres af esteraser til dannelse af ikke-fluorescerende 2',7'-dichlorfluorescein (DCFH). Mængden af ​​udsendt fluorescens korrelerer med mængden af ​​ROS i cellen. Data blev indsamlet på en FACS Aria I (Becton Dickinson) og analyseret ved hjælp af FlowJo-software.

2,7|Real-time polymerase kædereaktion (PCR) analyse

Total RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Gener af interesse blev amplificeret fra DNase I-behandlede totale RNA'er ved hjælp af M- MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA)

og poly-dT primere. De anvendte primere til PCR var som følger: p21 (5'-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3' og 5'-CGAAGAGACAACGG-CACACT-3', Tm=60 grad, 30 cyklusser), p53 (5'-CATGATAACCGTC-GACC-GACC 3′ og 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 grad , 35 cyklusser), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ og 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC-3′1, T3,3} ′1 grader cyklusser), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ og 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 grad , 30 cyklusser), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 53′‐ TTCTCTTGGT‐ 53′‐GTTTCTGGT‐ 53‰ ′, Tm=61 grad , 35 cyklusser), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ og 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 grad , 30 cyklusser), glyceraldehyd 3‐ dehydrogenase (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ og 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm=60 grad, 25 cyklusser). Real-time (RT)- PCR blev udført ved hjælp af SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japan) på ABI StepOne™ detektionssystemet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

2,8|Klonogene assays

Langtids (LT)-HSC'er blev sorteret ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og derefter dyrket i 96-brønds celleplader ved hjælp af et methylcellulosebaseret medium (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) . Ti replikatbrønde blev forberedt for hver prøve. Vi brugte 96-brønds cellekulturplade, tre celler pr. brønd. To uger efter udpladningen blev antallet og størrelsen af ​​kolonier talt under et mikroskop.

2,9|Statistisk analyse

Data blev analyseret ved envejs ANOVA ved hjælp af Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) og GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) software. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD. P < 0.05="" blev="" anset="" for="" at="" angive="" statistisk="">

3|RESULTATER

3.1|R. glutinosa og A. membranaceus udøvede anti-aldringseffekter

For at bekræfteanti-aging virkningeraf R. glutinosa og A. membranaceus undersøgte vi virkningerne af administration som et kosttilskud (200 mg/d). Efterfølgende registrerede vi kropsvægten, graden af ​​alderdom og overlevelsesraten for mus. Kropsvægten af ​​mus, der fodrede med R. glutinosa eller A. membranaceus, var normal sammenlignet med dem i kontrolgruppen, selvom der var et fald i kropsvægten af ​​R. glutinosa- og A. membranaceus-gruppen efter 20 måneder (figur 1A). Analyse af graden af ​​ældning afslørede en stabil og irreversibel stigning i graderingsscoren med stigende alder i grupperne R. glutinosa og A. membranaceus sammenlignet med kontrolgruppen, selvom stigningen var mere markant i A. membranaceus. gruppe (figur 1B). Den høje bedømmelsesscore skyldtes en tidligere indtræden af ​​tab af passivitet og reaktivitet, tab af hudglans og øget grovhed, hårtab, periophthalmiske læsioner, øget lordokyphose af rygsøjlen og en mere markant stigning i deres sværhedsgrad.18 Mus i A membranaceus musegruppen viste mere markante alderdomsfænotypekarakteristika, herunder tab af hudglans og hårtab. Overlevelseskurverne viste, at levetiden for mus i grupperne R. glutinosa og A. membranaceus var lidt længere end i kontrolgruppen (figur 1C). Disse data bekræftedeanti-aging virkningeraf både R. glutinosa og A. membranaceus, selvom R. glutinosa viste sig at være mere effektiv til at bremse aldringsprocessen.

FIGUR 1 Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus havdeanti-aging virkninger. Mus blev fodret med diæter suppleret med malet R. glutinosa eller A. membranaceus (200 mg/d); kontrolgruppen blev fodret med en standarddiæt. A, Ændringer i kropsvægt for mus målt hver 2. måned. B, Ændringer i aldersklassificeringsscore for mus med alderen. C, Overlevelseskurver. Data repræsenterer middelværdien ± SD; n=20 mus/gruppe. Data repræsenterer middelværdien ± SD; n=5 mus/gruppe.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa reducerede antallet af hæmatopoietiske stamceller

Stamcelleudmattelse menes at være den integrerende konsekvens af flere typer aldringsrelaterede skader og en af ​​hovedårsagerne til ældning af væv og organismer.1 Nylige undersøgelser tyder på, at stamcelleforyngelse kan vende aldringsfænotypen på organismeniveau.5 Vi hypotese, atanti-aging virkningeraf R. glutinosa medieres ved at forbedre stamcellefunktionen. Derfor udførte vi flowcytometrisk analyse af antallet af hæmatopoietiske stam-/progenitorceller isoleret fra mus (i alderen 20 måneder) fodret med diæter suppleret med R. glutinosa eller A. membranaceus (200 mg/d) i 10 måneder (Figur 2A) . Procentdelen af ​​LSK'er blev reduceret i grupperne R. glutinosa og A. membranaceus (figur 2B). Antallet af LT- og kortvarige (ST)- HSC'er blev reduceret med omtrent det dobbelte i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med antallet i kontrolgruppen (Figur 2C-D). Større antal almindelige lymfoide progenitorer (CLP'er) blev påvist i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med antallet i kontrolgruppen (figur 2I). Der var ingen forskelle i antallet af multipotente progenitorer (MPP'er), almindelige myeloide progenitorer (CMP'er), granulocyt-makrofage progenitorer (GMP'er) og megakaryocyt-erythroide progenitorer (MEP'er) i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med antallet i kontrolgruppe. I A. membranaceus-gruppen var der ingen signifikant forskel i antallet af LT- og ST-HSC'er sammenlignet med tallene i kontrolgruppen (figur 2C-D). Endvidere var der ingen forskel i antallet af MPP-, CMP-, MEP- og CLP-celler sammenlignet med antallet i kontrolgruppen (figur 2E, 2F, 2H og 2I); antallet af GMP'er blev imidlertid reduceret i A. membranaceus-gruppen. Mus fodret med diæter suppleret med R. glutinosa udviste således nedsat antal hæmatopoietiske stam- og stamceller.

3.3|R. glutinosa forbedrede funktionen og opretholdt HSC'ernes hvile

For at evaluere funktionen af ​​HSC'er blev det klonogene potentiale af LT-HSC'er undersøgt in vitro. Vi sorterede LT-HSCs-celler i et methylcellulose-baseret medium ved hjælp af FACS og talte antallet og størrelsen af ​​kolonier efter 14 dage. Sammenlignet med antallet og størrelsen af ​​kolonier produceret af celler fra mus i kontrolgruppen, viste celler fra mus i R. glutinosa-gruppen en stigning i antallet af kolonier, især for den lille størrelse (P=0.0241 ) og stor størrelse klon (P=0.0418), mens der ikke var nogen forskel i antallet fra mus i A. membranaceus-gruppen (figur 3). Den øgede kolonistørrelse og antallet i R. glutinosa-gruppen antydede, at denne urt øger LT-HSC's selvfornyelsespotentiale.

De fleste HSC'er i voksne mus forbliver i ro;19 derfor er opretholdelsen af ​​cellulær hviletilstand en væsentlig mekanisme for stamcelle-selvfornyelse.20,21 De observerede fald i HSC'er tyder på nedsat celleproliferation i R. glutinosa og A. membranaceus-grupper; derfor undersøgte vi cellecyklusstatus for HSC'er gennem analyse af den proliferative cellemarkør Ki-67 kombineret med bestemmelse af DNA-indholdet 7-AAD i LSK-populationen. Vi observerede et øget antal LSK-celler i G0-fasen i grupperne R. glutinosa og A. membranaceus sammenlignet med det i kontrolgruppen (figur 4A). Disse resultater indikerede, at R. glutinosa og A. membranaceus bibeholdt HSC'ernes hvile.

Real-time PCR-analyse af cellecyklusregulatorer i LSK-celler afslørede, at p18, p19 og p57 spillede kritiske roller i opretholdelsen af ​​HSC-hvilen.22-24 Der var ingen åbenlyse ændringer observeret for p57 og p19 (Figur 4C- D), og p18 blev opreguleret i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med den i kontrolgruppen og let opreguleret i A. membranaceus-gruppen (figur 4B).

FIGUR 2 Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus påvirkede antallet af hæmatopoietiske stamceller/progenitorceller. Mus (ældre

20 måneder) blev fodret med diæter suppleret med R. glutinosa eller A. membranaceus (200 mg/d) i 10 måneder (n=5/gruppe); kontrolgruppen blev fodret med en standarddiæt. Frisk isolerede knoglemarvsceller (BM) blev farvet med de angivne antistoffer og analyseret ved flowcytometri. A, Repræsentative farvningsprofiler af BM hæmatopoietiske stamcelle- og progenitorcellepopulationer. B, Procentdelen af ​​Lin-Sca1 plus c-kit-celler (LSK'er) i BM-celler. C-I, Celletal af (C) langsigtet (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus – , Flt3–); D, kortvarig (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus plus, Flt3–); E, multipotent progenitor (MPP; Lin– ​​, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, almindelig myeloid progenitor (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32–); G, granulocyt-makrofage-stamfader (GMP; Lin- , Sca- 1- , c- Kit-, CD34 plus , CD16/CD32 plus ); H, megakaryocyt-erythroid progenitor (MEP; Lin-, Sca- 1-, c- Kit-, CD34-, CD16/CD32-); og I, almindelig lymfoid progenitor (CLP; Lin–, Sca‐1low, c‐Kitlow, CD127 plus). Data repræsenterer middelværdien ± SD; n=5 mus/gruppe. *P < 0,05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa forsinkede HSCs senescens

Langsigtet kosttilskud med R. glutinosa kan forlænge levetiden for mus. Cellulær alderdom stiger med alderen; derfor undersøgte vi HSC-ældning i de aldrende mus ved flowcytometrisk analyse af SA- ‐gal-farvede HSC'er ved brug af et fluorescerende ‐gal-substrat (C12FDG).25 Procentdelen af ​​SA‐ ‐gal‐positive celler blev reduceret i R. glutinosa-gruppen, hvilket indikerer, at R. glutinosa forsinker LSK-celleældning (figur 5A).

Reaktive oxygenarter spiller en stor rolle i HSC-aldring, og tab af HSC-hvile er ofte korreleret med øget cellulær ROS.26 Analyse af den intracellulære ROS i LSK'er viste, at niveauerne var faldet i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med dem i kontrollen gruppe (figur 5B). Disse data indikerede, at R. glutinosa kan opretholde HSC-hvile og forbedre HSC-funktionen ved at reducere ROS-niveauer.

Vi undersøgte derefter ekspressionen af ​​flere gener involveret i cellulær senescens ved RT-PCR-analyse af LSK-celler. Sammenlignet

FIGUR 3 Funktion af hæmatopoietiske stamceller forstærket af kosttilskud af Rehmannia glutinosa. In vitro klonogent potentiale af langsigtede hepatiske stellatceller fra mus (n=3)

med kontrolgruppen blev ekspressionen af ​​cellulære senescens-associerede proteiner p53 og p16 nedreguleret i R. glutinosa-gruppen (figur 5D-E). Men ekspressionen af ​​p53 og p16 var ikke signifikant nedreguleret mellem A. membranaceus-gruppen og kontrolgruppen (figur 5D-E). Tilsammen viser disse data, at flere nøglecellecyklus- og celleældningsrelaterede gener regulerer funktionen af ​​HSC'er i mus fodret med diæter suppleret med R. glutinosa.

3,5|R. glutinosa forbedret B-celle immunitet

B- og T-lymfocytter er begge vigtige for immunologiske responser. T-lymfocytter spiller en kritisk rolle i den cellulære immunitet og dens regulering, mens B-lymfocytter hovedsageligt deltager i humoral immunitet. Lymfocytproliferation er det mest umiddelbare indeks, der afspejler organisk immunitet. For at undersøge rollen i immunologisk forbedring blev virkningerne af R. glutinosa og A. membranaceus på lymfocytproliferation undersøgt.

Mus i R. glutinosa-gruppen udviste nedsat antal af HSC'er og øget antal CLP'er. Flowcytometrisk analyse viste øget antal af modne B-celler (B220 plus ) i PB, BM og milt fra mus i R. glutinosa-gruppen sammenlignet med antallet påvist i kontrolgruppen (figur 6A); dog var der ingen signifikante forskelle i antallet af T-celler (CD4 plus og CD8 plus), monocytter og granulocytter (CD11b plus) mellem de to grupper (figur 6B-D). Disse resultater indikerer således, at kosten R. glutinosa øger B-celle immunitet.

FIGUR 4 Kosttilskud af Rehmannia glutinosa og Astragalus membranaceus bibeholdt hæmatopoietiske stamcellers hvile. A, Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen. Flowcytometrisk analyse af 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og Ki-67 farvning af Lin-Sca1 plus c-kit-celler (LSK'er). B, Real-time polymerase kædereaktion analyse af sorteret LSK celle genekspression; GAPDH blev brugt til normalisering. Data repræsenterer middelværdien ± SD af tre eksperimenter. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

FIGUR 5 Kosttilskud af Rehmannia glutinosa reducerede senescensen af ​​leverstjerneceller (HSC). Mus (i alderen 20 måneder) blev fodret med diæter suppleret med Rehmannia glutinosa eller Astragalus membranaceus (200 mg/d) i 10 måneder (n {{4 }}/gruppe); kontrolgruppen blev fodret med en standarddiæt. A, Flowcytometrisk analyse af SA- -gal-positive celler Lin-Sca1 plus c-kit- (LSK) under anvendelse af et fluorescerende -galactosidase-substrat (C12FDG). B, Procentdelen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) -positive celler i LSK'er. Flowcytometrisk analyse af ROS-positive LSK'er. Data repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse (SD). *P < 0,05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" ekspressionsmønsteret="" af="" cellulære="" senescens-associerede="" gener="" i="" lsk'er;="" gapdh="" blev="" brugt="" til="" normalisering.="" data="" repræsenterer="" middelværdien="" ±="" sd="" af="" tre="" eksperimenter.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|DISKUSSION

I denne undersøgelse undersøgte vi mekanismen foranti-aging virkningeraf R. glutinosa eller A. membranaceus ved at supplere foderet til mus med urterne i en dosis på 200 mg/d i 10 måneder. R. glutinosa viste sig at udvise anti-aldringseffekter, herunder nedsat alderdom og øget overlevelse af HSC'er samt

øget B-celle immunitet. Med hensyn til mekanismen afanti-aging effekter, fandt vi, at R. glutinosa reducerede antallet af HSC'er, mens spredningskapaciteten blev øget. Ydermere opretholdt R. glutinosa HSC-hvile og reducerede antallet af SA- -gal-positive celler og ROS-niveauer gennem regulering af p18, p53 og p16. I kombination bekræftede vores resultater, atanti-aging virkningeraf R. glutinosa i mus medicineres ved at opretholde roen og forbedre funktionen af ​​HSC'er.

Rehmannia glutinosa, som har været brugt som traditionel kinesisk urtemedicin i tusinder af år, kan bruges til at behandle hypoglykæmi ved forskellige diabetiske lidelser.27,28 Det er også blevet rapporteret, at R. glutinosa-ekstrakt øger knoglemetabolismen.29 Ydermere. R. glutinosa hæmmer inflammatoriske responser og syndromer30,31 og beskytter mod celleskade ved at opfange frie radikaler.14,32 I denne undersøgelse fandt vi ud af, at mus kosttilskud med R. glutinosa udøvedeanti-aging virkningerog forbedret B-celle-immunitet ved at øge den proliferative kapacitet af LT-HSC'er og reducere antallet af SA- -gal-positive celler og ROS-niveauer.

Graden af ​​oxidativ skade har vist sig at stige med alderen i en række forskellige celler og væv. Oxidativ stress er en kritisk determinant for HSC-selvfornyelse. Tab af LT-HSC-hvile korrelerer ofte med øget cellulær ROS, som er negativt forbundet med HSCs selvfornyelse.26 Catalpol er et iridoid glucosid, som er fundet i roden af ​​R. glutinosa. Catalpol viste hæmning af oxidativ stress, DNA-skader og telomerforkortning gennem PGC-1/TERT-vejen i en tidligere undersøgelse.33 I vores undersøgelse var niveauet af ROS faldet i LSK-cellerne fra R. glutinosa-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. R. glutinosa forlænger således overlevelsen af ​​mus ved at hæmme oxidativ stress i HSC'erne.

FIGUR 6 Flowcytometrisk analyse af procentdelen af ​​modne immunceller i perifert blod (PB), knoglemarv (BM), milt og thymus. Mus (i alderen 20 måneder) blev fodret med diæter suppleret med Rehmannia glutinosa eller Astragalus membranaceus (200 mg/d) i 10 måneder (n=5/gruppe); kontrolgruppen blev fodret med en standarddiæt. A, Flowcytometrisk analyse af procentdelen af ​​B-celler (B220 plus ) i PB, BM og milt. B, Flowcytometrisk analyse af procentdelen af ​​monocyt- og granulocytceller (CD11b plus ) i PB og BM. C og D, Flowcytometrisk analyse af procentdelen af ​​CD4 plus og CD8 plus celler i PB, milt og thymus. Data repræsenterer middelværdien ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus bruges også i traditionel kinesisk medicin til at fremme immunitet, reducere blodsukker og fremme tumorcelleapoptose, og har ogsåantioxidationoganti aldringejendomme. I denne undersøgelse fandt vi, at kosttilskud med A. memranaceus i 10 måneder ikke havde nogen tydelige virkninger sammenlignet med dem, der blev observeret hos kontrolmusene, mens vægten af ​​mus blev reduceret efter 20 måneder. Derfor kan A. membranaceus være uegnet til LT-behandling til fodrede mus.

Som konklusion viser vores resultater, at R. glutinosa kan forlænge levetiden for mus ved at bevare roen og forbedre funktionen af ​​HSC'er. Ydermere kan R. glutinosa reducere de intercellulære niveauer af ROS og antallet af SA‐ ‐gal‐positive celler og øge B‐celle immunitet.

ANKENDELSER

Denne undersøgelse blev delvist støttet af National Science Foundation for China (31672374), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016‐ 12M‐ 1‐012) og PUMC Youth Fund (2017310018).

INTERESSEKONFLIKT

Ingen.

FORFATTERS BIDRAG

Alle opførte forfattere opfylder kravene til forfatterskab. CQ og LFZ udtænkte og designede eksperimenterne. LB udførte eksperimenterne og skrev hovedmanuskripttesten. GYS udførte og analyserede data fra FACS. YJY designede eksperimentet om den traditionelle kinesiske medicin. WC klarede musene. Alle forfattere har læst og godkendt manuskriptet.