Refleksion over hæmodialysevandets mikrobiologiske kvalitet i Brasilien Ⅲ

Gældende lovgivning om dialysevand i Brasilien

Kriterierne anvendt tilevaluering af dialysevand opstod gennem de kompetente myndigheders bevidsthed om den potentielle risiko, som patienter under behandling var udsat for (Faria, 2011).

HVOR LANG TAGE DET FOR CISTANCHE AT VIRKE?

Resolutionen fra Collegiate Board of Directors (RDC) nr. 33/2008 indeholder bestemmelser om den tekniske forskrift for planlægning, programmering, udarbejdelse, evaluering og godkendelse af vandbehandlings- og distributionssystemer til hæmodialyse i det brasilianske sundhedsregulerende agentur (Anvisa, 2008) .

RDC nr. 11/2014 indeholder krav om god praksis vedrDialysetjenester, den gælder for alle dialysetjenester, uanset om de er offentlige, private, filantropiske, civile eller militære, inklusive dem, der udfører undervisnings- og forskningsaktiviteter. Det bestemmer også, at prøverne til mikrobiologiske analyser indsamles mindst en gang om måneden ved returpunktet for distributionssløjfen og i et af punkterne i behandlingsrummet. Derudover bestemmer den, at vandets mikrobiologiske kvalitet skal verificeres, når der er pyrogene manifestationer, bakteriemi eller mistanke om sepsis ipatienter i dialyse. Denne RDC nr. 11/2014 fastlægger vandkvalitetsstandarden for dialyse, med de biologiske og mikrobiologiske egenskaber fremhævet i tabel 1 (Anvisa, 2014).

TABEL I - Biologisk og mikrobiologisk kvalitetsstandard for dialysevand

Den Internationale Standardiseringsorganisation (ISO) sørger i sin standard nr. 13959:2014 forhæmodialysevand og relaterede terapier, angiver som en kvalitetsstandard et samlet mikrobiologisk tal mindre end 100 CFU/ml eller mindre, hvis det er tilfældet, fastsat i lokal lovgivning. Den specificerede også niveauer af endotoksiner under 0,25UE/ml eller lige så små, hvis det er tilfældet, fastsat af lokal lovgivning (International Organization for Standardization, 2014).

KONVENTIONELLE OG ALTERNATIVE MIKROBIOLOGISKE METODER

Optælling af heterotrofe bakterier

Det kan betragtes som en indledende markering af de mikrobiologiske tests, da mikroskoperne i midten af ​​1610 og i 1665 blev opfundet af henholdsvis Galileo Galilei og Van Leeuwenhoek. Selvom Leeuwenhoek nok ikke var den første til at observere bakterier og protozoer, var han den første til at lave rapporter med tegninger og beskrivelser af sine observationer. Blandt disse beskrev han i 1675 levende ting til stede i vand (Dias, 2018; Pelczar, Reid, Chan, 1980).

Imidlertid havde tyske videnskabsmænd observeret væksten af ​​kolonier i kogte kartofler, hvilket karakteriserede praksis med mikrobiel dyrkning og udvikling af kulturmedier. Det var Koch, der startede dyrkningen af ​​mikroorganismer i et fast medium. Han kaldte agar stoffet udvundet af alger, der kunne størkne ved stuetemperatur. Richard Petri udviklede en glasplade til deponering af kulturmediet (Jay, 2001; Pelczar, Reid, Chan, 1996).

Efter 200 år med opdagelsen af ​​levende væsener i vand af Leeuwenhoek, Louis Pasteur, Robert Koch, Theobald Smith og et par andre videnskabsmænd associerede mikroskopiske væsener med sygdomme. Joseph Lister, i 1878, opnåede de første rene kulturer af bakterier ved at anvende serielle fortyndinger i et flydende medium (Pelczar, Reid, Chan, 1980).

I slutningen af ​​det 19. århundrede blev dyrkningsteknikker taget i brug for at analysere kvaliteten af ​​drikkevand. Til E. coli-analyse og andre colibakterier blev kulturbouillon, gennem det mest sandsynlige antal (MPN), hovedmetoden, samt Kochs agarmedium eller fast medium for den samlede optælling, som begge har gennemgået et par modifikationer. I 1950 blev brugen af ​​membranfiltre til bakterieoptælling introduceret (Pelczar, Reid, Chan, 1996; Sartory, Watkins, 1999).

MNP er enkel, men kræver en længere analysetid (op til 5 dage), hvorimod formodede resultater i membranfiltrering er tilgængelige efter 3-5 dages inkubation (Anvisa, 2019). Hvad angår det faste medium, består en af ​​mulighederne i plaque counting agar (PCA), medier fattige på næringsstoffer og uegnede til bakteriegenvinding, der allerede er stresset i vand. Ernæringsmæssigt svagere dyrkningsmedier kan for eksempel også anvendes, fordi de kan genvinde et større antal bakterier, men ikke hele den levedygtige population (Sartory, Watkins, 1999). Reasoner's 2A Agar (R2A), er et eksempel på ernæringsmæssigt svagere dyrkningsmedier og er den mest anbefalede til vandmikrobiologisk analyse (USP, 2017).

I øjeblikket er der mange konventionelle mikrobiologiske metoder, såsom plademetode, membranfiltrering og flere rør ved MNP-processen (Anvisa, 2019). Selvom de er enkle, effektive og økonomiske, har de nogle begrænsninger: lav selektivitet af dyrkningsmediet, variabilitet af den biologiske respons og sene resultater i påvisning af mikroorganismer, der kompromitterer tiden til at bestemme forebyggende foranstaltninger for at reducere patienters skader (Anvisa , 2019).

I et forsøg på at minimere disse begrænsninger er alternative mikrobiologiske metoder blevet udviklet for at give et højere kvalitetsniveau til testene, større følsomhed og hurtigere resultater, hvilket gør det muligt at træffe korrigerende handlinger tidligt (Anvisa, 2019)

Bakterielle endotoksiner

Theodor Billroth brugte i 1865 udtrykket pyrogen til at henvise til stoffer, der forårsagede feber (Kikkert, Groot, Aarden, 2008; Medical Staff Conference, 1978). Richard Pfeiffers undersøgelser af kolera i 1892, som blev opmuntret af Robert Koch, indviede ham som endotoksinets fader for hans opdagelse (Rietschel, Cavaillon, 2003).

I 1942 blev pyrogentesten ved in vivo-metoden tilføjet i American Pharmacopoeia i dens tolvte udgave (Mc Closky et al., 1943). Siden den blev inkluderet, er denne test blevet brugt i vid udstrækning til at evaluere kontamineringen med pyrogener i parenterale lægemidler (Kikkert, Groot, Aarden, 2008). Men først i 1976 blev denne test inkluderet i den brasilianske farmakopé (Navega et al., 2015).

Testen er baseret på måling af kaninens feberrespons efter intravenøs injektion af testopløsningen, og fortolkningen af ​​resultaterne bruges til at karakterisere den biologiske kontrol (Anvisa, 2019). Der er dog nogle begrænsninger, såsom dyreforvaltning, biologisk variabilitet og etiske spørgsmål. Disse aspekter tilskyndede forskere til at udvikle alternative metoder til in vivo test af pyrogener (Kikkert, Groot, Aarden, 2008). I deres forskning observerede Levin og Bang (1964), citeret af Kikkert, Groot og Aarden (2008), at Escherichia coli endotoksin forårsagede koagulering i hæmolymfen af ​​krabben Limulus polyphemus.

Limulus Amebocyte Lysate (LAL) testen blev tilføjet i den amerikanske farmakopé i 1980, hvorimod den først blev inkluderet i den brasilianske farmakopé i 1996 (Farmacopéia, 1996; USP, 1980). Der findes to typer LAL-tests, den første er den semikvantitative koagulationstest, som er baseret på geldannelse; den anden er den fotometriske, en kvantitativ test, som kan opdeles i en kromogen metode, der er baseret på farveudvikling, og den turbidimetriske metode, som er baseret på turbiditetsudvikling (Anvisa, 2019).

LAL-tests har dog nogle begrænsninger, såsom variabiliteten af ​​analytikerteknikken og den iboende fejl i de anvendte instrumenter, hvilket kompromitterer analysekvaliteten, i denne sammenhæng er alternative metoder, der eliminerer disse begrænsninger, ønskelige (Anvisa, 2019; Charles River, 2017 Lemgruber et al., 2011)

Alternative mikrobiologiske metoder

Alternative mikrobiologiske metoder er ønskelige, når det søges at overvinde begrænsningerne ved konventionelle metoder. I forskellige kompendier er alternative metoder klassificeret i kvalitativ, kvantitativ eller identifikation (Anvisa, 2019; PDA, 2013; USP, 2017).

Den brasilianske farmakopé fremhæver de vigtigste metoder: levedygtighedsbaseret, vækstbaseret og cellulær komponentbaseret (Anvisa, 2019). Hovedtyperne af alternative mikrobiologiske metoder og deres respektive teknologier er beskrevet i tabel II.

TABEL II - Hovedtyper af alternative mikrobiologiske metoder og deres respektive teknologier

På trods af vigtigheden af ​​at bruge hurtige alternative metoder til ikke kun at give mulighed for korrigerende handlinger i realtid, men også større patientsikkerhed, udføres få undersøgelser for at demonstrere deres anvendelighed inden for dialysebehandlet vandanalyse (Anvisa, 2019) . Riepl et al. (2011) evaluerede anvendeligheden af ​​fastfasecytometri, afsløret ved epifluorescensmikroskopi, og observerede en høj korrelation mellem den konventionelle og den alternative metode.

Fastfase-cytometriapplikationen i dialysevandmikrobiologisk analyse er lovende, fordi den udover at være pålidelig er en hurtig metode, da analysetiden er omkring tre timer, og dens anvendelse foreslås til overvågning af ikke kun vandkvaliteten, men også dialysen væske (Canaud, 2011; Riepl et al., 2011).

Cytometri, udover at være en hurtig metode, tillader også påvisning af levedygtige ikke-dyrkbare mikroorganismer. Disse mikroorganismer er ansvarlige for resultaternes divergenser mellem laboratorieforsøg og ægte vandmikrobiota. De er ude af stand til at dele sig og danne kolonier, selvom de har en aktiv metabolisk mekanisme og forbliver i live. Mange bakterier, især gram-negative, har denne evne. Mycobacterium-arter kan fremhæves som potentielle VNC (Anvisa, 2019; Joux, Lebaron, 2000; Díaz et al., 2010; Sandle, 2015).

Cellulære komponent-baserede teknikker som 16S rDNA PCR-analyse er også en lovende teknik, fordi den er uafhængig af kultur og derfor i stand til at påvise ikke-dyrkbare levedygtige mikroorganismer (Anvisa, 2019; Gomila et al., 2010; Gomila, Ramirez, Lalucat, 2007 ).