Hurtig samtidig bestemmelse af seks effektive komponenter i Cistanche Tubulosa ved nær-infrarød spektroskopi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang og Yuhai Guo

Abstrakt:

Kvantitativ bestemmelse af flere effektive komponenter i en given plante kræver normalt en meget stor mængde autentiske naturprodukter. I denne undersøgelse foreslog vi en hurtig og ikke-destruktiv metode til samtidig bestemmelse af echinacosid, verbascosid, mannitol, saccharose, glucose og fructose iCistanche tubulosaved nær-infrarød spektroskopi (NIRS). Nær-infrarød diffus reflektansspektroskopi (DRS) og højtydende væskekromatografi (HPLC) blev udført på 116 batches af Cistanche tubulosa-prøver. DRS-dataene blev behandlet ved hjælp af standard normal variation (SNV) og multiplikativ spredningskorrektion (MSC) metoder. Partiel mindste kvadraters regression (PLSR) blev brugt til at bygge kalibreringsmodeller for komponenter af interesse i Cistanche tubulosa. Alle modeller blev derefter vurderet ved at beregne den gennemsnitlige kvadratiske fejl ved kalibrering (RMSEC), korrelationskoefficienten for kalibrering (r). r-værdierne for alle seks kalibreringsmodeller blev bestemt til at være større end 0.94, hvilket tyder på, at hver model er pålidelig. Derfor kan de kvantitative NIR-modeller rapporteret i denne undersøgelse kvalificeres til nøjagtigt at kvantificere indholdet af seks medicinske komponenter iCistanche tubulosa.

Nøgleord: Cistanche tubulosa; højtydende væskekromatografi; nær-infrarød spektroskopi; delvise mindste kvadrater

Introduktion

Cistanche(Hoffmg. Et Link) er en flerårig fanerogamisk slægt af Orobanchaceae-familien af ​​planter. De fleste arter, der tilhører Cistanche-slægten, har været brugt som lægeplante i årtusinder i Kina; have et ry som en overlegen tonic; og er kendt som "Ginseng of the Deserts" [1,2].Cistanche tubulosaer en obligatorisk parasit af rødderne af den flerårige plante Tamarix Chinensis. Det er blevet dokumenteret i den kinesiske farmakopé som den autentiske kilde til Cistanches Herba (kinesisk navn: Roucongrong) fra 2005-udgaven [3]. Moderne farmakologisk forskning i Cistanche-arter blev indledt i 1980'erne [4]. Farmakologiske undersøgelser viste, at ekstrakterne af Cistanche-planter besidder et bredt spektrum af aktiviteter, såsom helbredelse af nyremangel og senil forstoppelse, fremme af evnen til at lære og huske, anti-Alzheimers sygdom, forbedring af immunitet, anti-aldring, anti-træthed osv. [1,5-7]. I de sidste tre årtier er omfattende og systematiske farmakologiske undersøgelser blevet kombineret med fytokemiske undersøgelser for at belyse det materielle grundlag for de gavnlige virkninger af rødderne af Cistanche-planter. Disse undersøgelser viser, at phenylethanoidglycosider (PhG'er) var de vigtigste effektive komponenter i Cistanche-planter, der spiller en nøglerolle til behandling af nyremangel, impotens [8], anti-aging [9] og anti-Alzheimers sygdom [10]. Indholdet af to PhG'er (echinacoside og verbascoside) var påkrævet i kinesisk farmakopé. I mellemtiden ejer kulhydrater som mannitol, saccharose, glucose og fructose i Cistanche-planter den afførende funktion, og kulhydratklyngerne af Cistanche-planter er blevet brugt til behandling af forstoppelse [11].

Vilde ressourcer afCistanche tubulosaer hovedsageligt fordelt i området omkring Taklamakan-ørkenen i den sydlige Xinjiang autonome region i Kina. I lighed med mange andre arter, der bruges som traditionelle kinesiske lægemidler (TCM'er), er C. tubulosa af stor økonomisk værdi og næsten uddød i sit vilde habitat på grund af overopsamling. Dyrkning af C. tubulosa begyndte i 1990'erne i Kina for at sikre forsyningen af ​​råvarer til Cistanches Herba samt beskytte vilde planters ressourcer. Fra 2017 eksisterer der næsten 13 tusinde ha dyrket C. tubulosa i Hotan-præfekturet i Xinjiang [12,13]. Der kræves fremskridt inden for planteteknologi for at udvide dyrkningen samt forbedre kvaliteten afCistanche tubulosa.

Det primære formål med at dyrkeCistanche tubulosaer at producere Cistanches Herba, der er rig på disse effektive komponenter. Imidlertid kan indholdet af de effektive komponenter i Cistanches Herba, såsom PhG'er og oligosaccharider, blive væsentligt påvirket af mange faktorer under produktionen [12,13]. Et realtidsdetektionssystem for kvaliteten af ​​C. tubulosa bør undersøges. Derfor er det nødvendigt at udvikle en høj gennemløbsmetode for fuldt ud at opfylde kravet om at analysere et stort antal prøver inden for en kort periode. Traditionelt blev bestemmelsen af ​​de primære effektive komponenter, såsom PhG'er og kulhydrater, i C. tubulosa normalt opnået ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC) [14,15]. Selvom det er nøjagtigt og pålideligt, er det tidskrævende og besværligt at indsamle og behandle data. Derudover kræves der også megen tid og kræfter til prøveforberedelse, som normalt involverer pulverisering, ekstraktion og filtrering af HPLC-assays. Derfor er der brug for et klart princip og let betjeningsværktøj for at få en forholdsvis stor mængde data. Heldigvis er nær-infrarød spektroskopi (NIRS) blevet brugt i vid udstrækning til at vurdere landbrugsprodukter [16], fødevarer [17], medicinske prøver [18] og farmaceutiske produkter [19], fordi den er hurtig såvel som ikke-destruktiv. Derfor kunne NIRS nøjagtigt matche kravene til effektive målinger af TCM'er, og det er ikke overraskende, at NIRS er blevet anvendt til kvalitativ identifikation [20,21] og kvantificering af forbindelser [22] i TCM'er.

I denne undersøgelse blev indholdet af seks effektive komponenter, herunder echinacosid, verbascosid, mannitol, saccharose, glucose og fructose i 116 batches af C. tubulosa-prøver, der blev indsamlet fra Hotan-præfekturet i Xinjiang i 2013-2015, først bestemt ved HPLC. Bagefter blev kalibreringsmodellerne for disse seks komponenter etableret med den partielle mindste kvadraters regression (PLSR) metoden. Disse modeller blev derefter valideret med korrelationskoefficienten og forudsigelsesfejl i kalibreringssættene. Resultaterne viste, at den udviklede metode kunne anvendes som en pålidelig metode til kvantitativ analyse af C. tubulosa.

Resultat

HPLC-analyse

Indholdet af echinacosid og verbascosid blev bestemt ved en veldefineret HPLC-UV-metode i litteraturen [3,23] og fire kulhydrater (mannitol, saccharose, glucose og fructose) blev bestemt ved en veldefineret HPLC-ELSD-metode i litteraturen [24] for alle de 116 prøver. Prøveforberedelse og -bestemmelsesmetoder blev beskrevet i afsnit 3.1 og 3.3. Figur 1 viser de karakteristiske kromatogrammer for de blandede standarder. Det kan ses, at alle seks effektive komponenter var baseline-separeret og derfor kunne kvantificeres. HPLC-metoden blev valideret før prøvetestningen. Hovedresultaterne af HPLC-metoden er angivet i tabel 1. En gunstig lineær sammenhæng (r=0.9998) og genvinding (98,5 procent ) af metoden til bestemmelse af echinacoside er vist i resultaterne, det samme resultat som alle fem komponenter. Derfor kan indholdet af de seks effektive komponenter bestemmes nøjagtigt. Alle bestemte indholdsintervaller er opsummeret i tabel 1.

NIRS Analyse

Figur 2 viser NIR-spektrene (4000–10,000 cm−1) af C. tubulosa-prøverne. Signifikante absorptionstoppe optrådte fra 4000 cm−1 til 7500 cm−1 i alle prøver, mens der optrådte blide udsving fra 7500 cm−1 til 10.000 cm−1. Basislinjedrift af NIR-spektrene opstod, fordi prøven let blev påvirket af faktorer som partikelstørrelse og farve (figur 2A). Matematiske forbehandlinger af spektrene blev brugt til at reducere indflydelsen af ​​unødvendig information til en vis grad. De matematiske forbehandlinger omfattede første afledning (1. afledning), anden afledning (2. afledning), standard normal sort (SNV) og multiplikativ spredningskorrektion (MSC). Figur 2B viser den 2. afledning af NIR-spektrene for C. tubulosa, og de signifikante variationer, der fandt sted fra tre regioner, 4000-4500 cm-1, 5000-5500 cm-1 og 7000-7500 cm-1, er åbenlyst observeret .

Etablering af kvantitative kalibreringsmodeller

Partiel mindste kvadraters regression (PLSR) er en klassisk modelleringsmetode, og den er blevet anvendt i vid udstrækning i kvantitative modeller på grund af den høje kvalitet af resultaterne. Fordelene ved PLSR inkluderer dens gode prognoseevne og relative enkelhed. PLSR er også blevet anvendt i vid udstrækning i etableringen af ​​kvantitative kalibreringsmodeller af TCM'er [25]. Baseret på de forbehandlede NIR-spektre, og NIR-kvantitativ analysemodel for de seks effektive komponenter i C. tubulosa blev etableret ved hjælp af PLSR-metoden med HPLC-analysedata som de sande værdier. De 116 prøver blev tilfældigt opdelt i kalibrerings- og valideringssæt med et 3:1-forhold. De mest egnede betingelser for kalibreringen blev valgt ved lav RMSEC og høj korrelationskoefficient.

Valg af bølgebånd til kalibreringsmodellerne

Valget af et passende bølgebånd var et vigtigt skridt for opbygningen af ​​kalibreringsmodeller. I denne undersøgelse blev NIR-intervalspektrene på 4000-7500 cm-1 (anbefalet af TQ-analytikersoftware) og 4000-10.000 cm-1 sammenlignet. Det blev observeret, at dette område var uegnet til kalibrering i intervallet mellem 4000 cm-1 og 7500 cm-1 fra tabel 2. Derfor var spektralintervallerne for de seks kemiske bestanddele i den aktuelle undersøgelse. alle udvalgt fra intervallet fra 4000 til 10.000 cm-1 ved at sammenligne præstationerne for RMSEC og korrelationskoefficienten.

Valg af det optimale antal faktorer for kalibreringsmodellerne

PLSR forklarer den maksimale mængde af variabilitet i dataene ved at reducere dimensionaliteten af ​​spektradataene ved beregning af faktorer. Problemet med "underfittedness" opstod på grund af utilstrækkelig information, som skyldtes et begrænset antal faktorer; Hvis man vælger de faktorer, der er større end de optimale værdier, der er introduceret i modellen, vil det imidlertid medføre problemet med "overfittedness". Enten "underfittedness" eller "overfittedness" vil reducere forudsigelseskraften af ​​de etablerede modeller [22]. Figur 3 viser sammenhængen mellem RMSECV og faktorer for alle seks forbindelser. Derfor valgte vi de faktorer, der svarer til de laveste værdier af RMSECV. Det optimale valg af faktorer for kalibreringsmodellerne er angivet i tabel 3.

Valg af spektral forbehandling til kalibreringsmodellerne

En anden mest kritisk indflydelsesrig faktor for kalibreringsmodeller er spektral forbehandling, som har til formål at reducere påvirkningen af ​​spredning og basislinjedrift, forbedre signal-til-støj-forhold og fjerne uregelmæssige variationer. Multiplikativ spredningskorrektion (MSC) og standard normal variate (SNV) metoder blev brugt til at eliminere påvirkningen af ​​strålingsspredning almindelig. For at løse virkningerne af baseline-drift blev 1. og 2. derivatspektre sammenlignet, og 2. derivativ blev valgt [26]. For den ønskede effekt udglattede vi spektrene med Savitzky-Golay (SG) filteralgoritmen før udledning for at forhindre støjforstørrelse. Tabel 3 viser informationen om spektral forbehandling og dens resultater for kalibreringsmodellerne.

Evaluering af de etablerede modeller

En god NIRS-kalibreringsmodel bør have lave RMSEC- og RMSEP-værdier samt en høj korrelationskoefficient (r) og små forskelle mellem RMSEC og RMSEP [27-29]. Kalibreringsmodellerne for de seks udvalgte forbindelser blev etableret i overensstemmelse med procedurerne nævnt ovenfor (tabel 3). RMSEC- og r-værdierne for kalibreringssættet af echinacosid var henholdsvis 27,6 og 0.9808. Ydeevneparametrene for andre modeller af kemiske forbindelser er anført i tabel 3, hvorfra vi kan konkludere, at de etablerede modeller fremkommer tilfredsstillende forudsigelsesresultater og kan bruges til hurtig kvantitativ analyse af C. tubulosa. Spredningsplot af de seks kemiske forbindelser er vist i figur 4 for at gøre kalibreringsmodellerne mere beskrivende og observerede visuelt. Som vist i figur 4 opstod der mindre forskelle mellem de forudsigelige og målte værdier, fordi de fleste prikker var fordelt rundt om den regressive kurve med en ligning som y=x. Derfor blev der observeret fremragende prædiktive præstationer i figur 4.

Materialer og metoder

Prøveforberedelse

Et hundrede seksten C. tubulosa prøver blev indsamlet fra Hotan Prefecture i Xinjiang autonome region fra 2013 til 2015. Alle prøver blev dyrket, men de blev indsamlet på forskellige vækststadier. Den friske vægt af prøverne varierede fra 20 g til 1000 g. Efter soltørring blev de tørrede prøver knust og sigtet gennem en 60-masket sigte [3,23].

NIR spektroskopisk dataindsamling

NIR-spektrene for prøverne blev opsamlet med et 8 cm-1-interval over spektralområdet på 4000-10.000 cm-1 med et Antaris MXFT-NIR-system (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) udstyret med en håndholdt optisk fiberreflektansadapter. Hvert spektrum blev opnået ved at tage 64 scanninger i gennemsnit. Alle prøver fik lov til at ækvilibrere til stuetemperatur (25 °C) før NIR-spektrascanning for at sikre, at prøverne blev analyseret ved samme temperatur. Luftfugtigheden i laboratoriet blev holdt på et omgivende niveau.

HPLC dataindsamling

Ekstraktionsforberedelse

Et gram C. tubulosa-pulver blev ekstraheret med 50 ml 50% methanol i en konisk kolbe med ultralydbehandling (500 W, 40 kHz) i 30 min. Ekstrakten blev opbevaret ved 4 ◦C. Supernatanten af ​​ekstrakten blev filtreret for at opnå en prøve til HPLC-analyse [3,23].

Samtidig bestemmelse af Echinacoside og Verbascoside med HPLC-UV

Væskekromatografisk analyse blev udført på et Shimadzu UHPLC-system (Shimadzu, Kyoto, Japan) bestående af to LC-20ADXR opløsningsmiddelleveringsenheder, en LC-20AD pumpe, en SIL-20ACXRauto prøveudtager , en CTO-20AC-søjleovn, en SPD-M20A DAD-detektor, DGU-20A3R-afgasser og ICBM-20A-controller.

En Grace Prevail Carbohydrate ES-søjle (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) anvendt til de kromatografiske separationer blev holdt ved 35 ◦C. Den mobile fase bestod af acetonitril (A) og 0,1 procent vandig myresyre (B) og blev leveret efter gradientprogrammet som følger: 0–7 min, en lineær gradient på 10–20 procent A; 7-15 min, 20 procent A; og 15-20 min, en lineær gradient på 20-10 procent A. Medhastigheden for den mobile fase var 0,4 ml/min. UV-overvågning blev udført ved 330 nm.

Samtidig bestemmelse af mannitol, saccharose, glukose og fructose med HPLC-ELSD

HPLC blev udført på et Agilent 1100 serie LC-system (Palo Alto, CA, USA) bestående af en aG1322A afgasser, en G1311A kvaternær pumpe, en G1311A autosampler, en G1316A kolonnetemperaturregulator og en G1315B DAD detektor.

En Sigma Prevail Carbohydrate ES-søjle (4,6 × 250 mm, 5 µm) blev anvendt til kromatografiske separationer og holdt ved en kolonnetemperatur på 25 ◦C. Den mobile fase var sammensat af acetonitril og vand (77:23, v/v) og isokratisk allieret tilført med en tilsvarende hastighed på 0,7 ml/min. Spildevandet blev overvåget ved hjælp af en fordampningslysspredningsdetektor (ELSD) med standardparametre [23,24].

Databehandling

TQ Analyst (version 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) blev brugt til at udføre opdeling af kalibrerings- og valideringssættene, matematisk forbehandling af spektrene, etableringen af ​​kalibreringsmodellerne og andre beregninger. Oprindelse (version 9.1) blev brugt til at lave figurerne.

Konklusioner

Anerkendelser: Dette arbejde blev støttet af National Science and Technology Planning Project of China(2015BAD29B00-04).

Forfatterbidrag: Xinhong Wang udtænkte og designede eksperimenterne. Xinhong Wang og Xiaoguang Wang udførte eksperimenterne. Xinhong Wang og Yuhai Guo skrev papiret.

Interessekonflikter: Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

Referencer

1. Jiang, Y.; Tu, PF Analyse af kemiske bestanddele i cistanche-arter. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970-1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma dyrket som en ny afgrøde i Kina. Genet. Ressource. Afgrøde Evol. 2008, 56, 137-142. [CrossRef]

3. Redigering af kinesisk farmakopéudvalg. Chinese Pharmacopoeia, 2005. udgave; Chemical Industrial Press: Beijing, Kina, 2005; Bind 1, s. 90.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. Bestanddele af cistanchE herba (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508-511. [CrossRef] [PubMed]

5. Sang, ZH; Lei, L.; Tu, PF Fremskridt inden for forskning af farmakologisk aktivitet i planter med cistanche-huffing. Et link. Hage. Tradition. Urt. Drugs 2003, 34, 473-476.

6. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Antioxidative virkninger af phenylethanoider fra Cistanche deserticola. Biol. Pharm. Tyr. 1996, 19, 1580-1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, CQ Forskning i virkningen af ​​phenylethanoid glycosider (PEG) af Cistanche deserticola på anti-aldring i gamle mus induceret af D-galactose. J. Chin. Med. Mater. 2008, 31, 1385-1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Farmakologiske undersøgelser af Cistanchis Herba. I. Virkninger af bestanddelene i Cistanchis Herba på sex og indlæringsadfærd hos kronisk stressede mus. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131-1144. [CrossRef]

9. Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Anti-aging aktive ingredienser fra urter og nutraceuticals brugt i traditionel kinesisk medicin: farmakologiske mekanismer og implikationer for lægemiddelopdagelse. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395-1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Neuroprotektive virkninger af Cistanches Herba-terapi på patienter med moderat Alzheimers sygdom. Evid. Baseret komplement. Altern. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ZL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Undersøgelse af afførende bestanddele i Cistanche deserticola YC Ma. Mod. Hage. Med. 2015, 17, 307-310.

12. Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, TX; Wang, XY; Aierkan, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; et al. Dyrkningsteknikker for Cistanche tubulosa og dens vært Tamarix spp. Mod. Hage. Med. 2015, 17, 349-358.

13. Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tian, ​​YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Udvikling af økologisk industri af cistanches herba til fremme af økologisk civilisation i den vestlige ørkenregion. Mod. Hage. Med. 2015, 17, 297-301.

14. Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Kvantitativ analyse af cistanches herba ved hjælp af højtydende væskekromatografi kombineret med diodearraydetektion og højopløsningsmassespektrometri kombineret med kemometriske metoder. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945-1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9 af 9

15. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Differentiering af herba-cistancher ved fingeraftryk med højtydende væskekromatografi-diodearraydetektion-massespektrometri. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156-2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---