Proteomics og cytokinanalyser skelner myalgisk encephalomyelitis/kronisk træthedssyndrom-tilfælde fra kontroller, del 2

Korrelationer af proteinniveauer med kliniske metadata indikerer deres betydning i sygdomstilstand

Alle proteiner blev analyseret for korrelationer med de kliniske metadata ved hjælp af de samme metoder, der tidligere er beskrevet. Kun signifikante resultater efter justering for flere sammenligninger (q<0.1) are shown in Table 2. There were significant correlations between plasma cytokines, plasma proteomics, and the clinical metadata, but none were found with the EV cytokine dataset (Table 2).

Cistanche kan fungere som en anti-trætheds- og udholdenhedsforstærker, og eksperimentelle undersøgelser har vist, at afkog af Cistanche tubulosa effektivt kunne beskytte leverhepatocytter og endotelceller beskadiget i vægtbærende svømmemus, opregulere ekspressionen af ​​NOS3 og fremme hepatisk glykogen syntese og udøver således anti-træthedseffektivitet. Phenylethanoid-glycosid-rigt Cistanche tubulosa-ekstrakt kunne signifikant reducere serum-kreatinkinase, lactat-dehydrogenase og lactat-niveauer og øge hæmoglobin- (HB) og glukoseniveauer i ICR-mus, og dette kunne spille en anti-træthedsrolle ved at mindske muskelskaden og forsinkelse af mælkesyreberigelsen til energilagring i mus. Compound Cistanche Tubulosa-tabletter forlængede den vægtbærende svømmetid betydeligt, øgede leverglykogenreserven og sænkede serumurinstofniveauet efter træning hos mus, hvilket viste dens anti-træthedseffekt. Afkog af Cistanchis kan forbedre udholdenheden og fremskynde elimineringen af ​​træthed hos motionsmus og kan også reducere forhøjelsen af ​​serumkreatinkinase efter belastningsøvelser og holde ultrastrukturen af ​​skeletmuskulaturen hos mus normal efter træning, hvilket indikerer, at det har virkningerne for at øge fysisk styrke og anti-træthed. Cistanchis forlængede også signifikant overlevelsestiden for nitritforgiftede mus og forbedrede tolerancen over for hypoxi og træthed.

Klik på træthed

Hvorfor vil vi være trætte? Hvordan kan vi løse træthedsproblemerne?

【Kontakt】 E-mail: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501

Inden for plasmacytokindatasættet var både kolonistimulerende faktor 2 (CSF2) og leptin negativt korreleret med køn og positivt korreleret med BMI i både ME/CFS- og kontrolgrupperne (fig. 6a). Interessant nok har personer med ME/CFS og IBS højere koncentrationer af CSF2 og leptin end personer med ME/CFS og uden IBS, og disse sammenhænge blev ikke observeret i kontrolgruppen (fig. 6b).

ME/CFS-kohorten afslørede også unikke signifikante sammenhænge med sundhedsspørgeskemadataene relateret til fysisk funktion (SF{{0}}) og træthed (MFI-20), som ikke blev fundet i kontrolgruppen. CSF2 og leptin var negativt korreleret med fysisk funktion (r=− {{10}}.539, q=0.002 for CSF2; r{{9 }}− 0,558, q=0,002 for leptin) og den fysiske komponentoversigt (r=− 0,459, q=0,035 for CSF2; r=− 0,445 , q=0.035 for leptin), og positivt korreleret med generel træthed (r=0.439, q=0.047 for CSF2; r=0.436, q =0.047 for leptin) (tabel 2, fig. 6c).

Vi fandt andre signifikante korrelationer mellem cytokiner og de kliniske data hos ME/CFS-personer, som ikke blev fundet i kontroller: CCL2, CXCL1{{30}} og CCL11 var positivt korreleret med alder (r{{3} }.440, q=0.060 for CCL2; r=0.394, q=0.099 for CXCL10; r=0.431, q=0 0,060 for CCL2) (fig. 6d). Begge (TNF og IL1RA var positivt korreleret med BMI (henholdsvis r=0.543, q=0.001 og r=0.468, q=0}.010), og negativt korreleret med kategorien Fysisk funktion for SF-36 (r=− 0,508, q=0.004 og r=− 0,480, q=0. 007 for henholdsvis TNF og IL1RA) (fig. 6e) Endelig korrelerede IL13 positivt med scoren for reduceret aktivitet fra MFI- 20-spørgeskemaet (r=0.482, q=0.025 ).

Som nævnt ovenfor blev der fundet yderligere signifikante korrelationer mellem plasmaproteomikdatasættet og de kliniske metadata. Der var 9 signifikante korrelationer i kontrolgruppen og kun to i ME/CFS-personerne (tabel 2, nederste del). I kontrolprøver var Protein S (PROS1) og Fc Receptor-Like 3 (FCRL3) negativt korreleret med vitalitet (r=− 0.590, q=0 .015 for PROS1, r=− 0.538, q=0.039 for FCRL3). Derudover var PROS1 negativt korreleret med SF-36 Physical Component Summary (r=− 0,608, q=0.008) og positivt korreleret med MFI-20 General Fatigue-score (r=0.590, q=0.016). Cholesteryl Ester Transfer Protein (CETP) var positivt korreleret med generel træthed (r=0.547, q=0.032) og totalscore fra MFI-20 (r{{35} }.557, q=0.025), og hæmoglobinunderenheden Alpha 1 (HBA1) var negativt korreleret med de to samme scores (r=− 0,558, q=0.046 og r=− 0,556, henholdsvis q=0.025) (fig. 7a). I ME/CFS-gruppen var Serpin Family A Member 5 (SERPINA5) positivt korreleret med generel sundhed (r=0.646, q=0.004) og social funktion (r=0 .593, q=0.027) fra SF-36-spørgeskemaet (fig. 7b).

Robust lineær regression afslører yderligere forhold mellem visse proteiner og klinisk information

For bedre at forstå forholdet mellem proteiner og metadataene udførte vi robust lineær regression og t-test for de estimerede koefficienter. Robust lineær regression blev udført for henholdsvis EV-cytokiner, plasmacytokiner og plasmaproteomik. Hver model inkluderede et specifikt proteinniveau som den forudsagte variabel og kohorten (ME/CFS eller kontrol), køn, alder, BMI og Irritable Bowel Syndrome (IBS) som en kovariat. Interaktioner mellem kohorten og metadata-kovariaterne blev også inkluderet i modellen. Interaktionerne tester hypotesen om, at forholdet mellem metadata og niveauet af et protein er anderledes ved ME/CFS end i kontrolgruppen. De signifikante effekter er opsummeret i tabel 3. Det er standardpraksis i biostatistik at inkludere begge hovedeffekter, når to variable har en statistisk signifikant interaktion. Begrundelsen her er, at interaktionen viser, at variablerne har effekter, selvom hovedeffekten ikke opnår statistisk signifikans. Vi fulgte denne praksis. I tabel 3 er Mand en dummy (indikator eller 0–1) variabel, der er lig med 1 for mænd og 0 for kvinder. På samme måde er ME/CFS en dummy-variabel, der er 1 eller 0 for henholdsvis tilfælde eller kontroller, og IBS er en dummy-variabel lig med 1 eller {{10}} for forsøgspersoner med eller uden IBS, hhv. ME/CFS: Alder er produktet af ME/CFS og Alder og er derfor lig med 1 for ME/CFS-tilfælde og lig med 0 for kontroller. ME/CFS: Mand er produktet af to dummy-variable og er derfor lig med 1 for mænd i ME/CFS-gruppen og lig med 0 for alle andre forsøgspersoner. ME/CFS:(+) IBS er lig med 1 for ME/CFS tilfælde med IBS og 0 ellers.

I EV-cytokinprøver var alder signifikant for at forudsige CXCL1-niveau (=- 0.013, q=0.035) og CCL11-niveau (=0.032, q{ {9}}.035). Tus, CXCL1 falder med alderen, men CCL11 stiger med alderen. (Tabel 3).

I plasmacytokiner forudsagde både BMI og mænd signifikant Leptin- og CSF2-niveauer. Effekten for dummy-variablen Mand er forskellen mellem gennemsnittet for mænd og kvinder. For eksempel er gennemsnittet af variablen Leptin (eller CSF2) alt andet lige 1,119 (eller 1,230) lavere for mænd sammenlignet med kvinder. For både CCL2 og CSF3 var hovedeffekten af ​​alder og interaktionsperioden mellem alder og kohorte signifikant. Skæringspunkterne for regression af CCL2 på alder er 0.690 og 0.690− 2.696= − 2.{{27} }06 for henholdsvis kontroller og sager. For hver etårig stigning i alder, vil gennemsnittet af CCL2 falde med 0.037 i kontroller og stige med 0.075–0.037=0}.038 i sager. Skæringerne for regression af CSF3 på alder er 0,576 og 0,576−1.994=− 1,418 for henholdsvis kontroller og tilfælde. For hver etårig stigning i alder vil gennemsnittet af CFS3 falde med 0,047 i kontroller og stige med 0,075-0.047=0,028 i tilfælde.

I plasmaproteomikdata var alder også signifikant til at forudsige SAA1-niveau (=0.047, q=0.049). For PFN1 var interaktionen mellem ME/CFS og køn signifikant (=− 1,901, q=0.03{{20} }). Middelværdien af ​​PFN1 er 0.809 for kvindelige kontroller, 0.809−0.996=− 0,187 for kvindelige tilfælde, 0.809+0 .081=0.890 for mandlige kontroller og 0.809+0.081−0.996−1.901=− 2.007 for mandlige tilfælde. Således er gennemsnitlig PFN1 højere i kontroller end i tilfælde for begge køn, men forskellen er meget større hos mænd (0.809+0.187=0.996 for kvinder versus 0.890+2. 007=2.897 for mænd).

For IGHA2 var interaktionen mellem ME/CFS og IBS signifikant (=3.467, q < 0.001). Middelværdien af ​​IGHA2 er 0.454 for kontroller uden IBS, {{20}}.454−2.048=− 1.594 for ME/CFS-tilfælde uden IBS, {{33 }}.454−2.811=− 2.357 for kontroller med IBS og 0.45 4−2.048−2.811+3.{ {26}}− 0.938 for tilfælde med IBS. Derfor er den gennemsnitlige IGHA2 højere for kontroller end tilfælde for forsøgspersoner uden IBS, men højere i tilfælde end kontroller for forsøgspersoner med IBS. For LRG1 var interaktionen mellem ME/CFS og IBS signifikant (=3.093, q < 0.001). Middelværdien af ​​LRG1 er 0,261 for kontroller uden IBS, 0,261−1.082=− 0,821 for ME/CFS tilfælde uden IBS, 0,261−2.502=− 2,241 for kontroller med IBS og 0,261−1,082 −2.502+3.093= 0.230 for tilfælde med IBS. Vi ser, at middel LRG1 er højere i kontroller end tilfælde for forsøgspersoner uden IBS, men højere i tilfælde end kontroller for forsøgspersoner med IBS (tabel 4).

IBS har modsatte virkninger i tilfælde og kontroller på IGHA2 og LRG1 (tabel 4). Selvom disse forskelle er statistisk signifikante, skal det bemærkes, at der kun var én kontrolperson med IBS.

Tre maskinlæringstilgange resulterer i prædiktive og diskriminerende modeller

De øverste 20 proteinanalytter og kendetegns vigtighedsværdier for hver af de tre maskinlæringstilgange kan findes i tabel 5. Alle tre metoder havde en fremragende præstation til at skelne ME/CFS fra kontroller, der brugte top 2{{ 16}} proteinanalytter med 250 replikationer af femdobbelt krydsvalidering. Figur 8 viser ROC-kurverne og AUROC-værdierne fra disse tre klassifikatorer med de øverste 2 0-proteiner rangeret i betydningsmålinger. XGBoost-klassifikatoren klarede sig bedst med en høj grad af nøjagtighed (86.1%, Yderligere fil 1: Fig. S3a) med en krydsvalideret AUROC-værdi på 0.947 (95% CI { {26}}.895–0.998). Desuden gav logistisk regression (LASSO) de bedste resultater med en AUC på 0.873 (95 % CI 0.792–0.953) og nøjagtighed på 78,6 % ved at bruge de 8 bedste proteiner fra hver klassifikator. (Fig. 8b og Yderligere fil 1: Fig. S3b). Endelig skelnede Random Forest med 7 proteinanalytter fælles for alle tre top 20-lister (fed proteiner i tabel 5) ME/CFS fra kontrollerne med en AUROC-værdi på 0,891 (95 % CI 0,817–0,966) og nøjagtighed på 79,1 % (fig. 8c og yderligere fil 1: Fig. S3c).

Diskussion

I denne undersøgelse brugte vi prøver og data fra 98 af de 100 forsøgspersoner, som tidligere har leveret prøver, der blev analyseret for fækal metagenomik og plasmacytokiner [26] og også for plasmaproteiner analyseret ved massespektrometri [14]. Desuden blev ekstracellulære vesikler isoleret fra disse 98 prøver, og vi fandt, at middelstørrelsen og koncentrationerne af partikler var signifikant højere i ME/CFS (fig. 2). Selvom en tidligere rapport, der anvender den samme EV-oprensningsmetode som den nuværende undersøgelse, fandt, at den gennemsnitlige størrelse af ME/CFS EV'er var reduceret [42], analyserede forfatterne EV'er isoleret fra 10 ME/CFS-patienter og 5 raske kontroller vs. 49 ME/ CFS og 49 kontroller i denne undersøgelse brugte ikke thrombin til at fjerne fibrinogen og brugte lave centrifugalkræfter til at pelletere EV'er (1500 g vs. 12, 000 g i denne undersøgelse). Alt sammen kunne dette forklare de forskellige resultater observeret med vores nuværende undersøgelse. Endelig bekræftede vores resultater andre fund, der rapporterede højere koncentrationer af vesikler i ME/CFS [24, 25, 42], og disse observationer ses også ved tilstande som Alzheimers sygdom [17] og cerebrovaskulær sygdom [20].

Vores arbejde viser værdien af ​​at bruge flere assays på de samme prøver, og også vigtigheden af ​​at udføre korrelationer med kliniske data. Dette har gjort det muligt for os at identificere flere associationer af bestemte proteiner med patientsymptomer. Det er vigtigt, at vi demonstrerer, at data kan skelne mellem patienter og kontroller med høj nøjagtighed. ME/CFS har længe været ukorrekt set af nogle som en psykisk sygdom. At kunne adskille patienter og kontroller gennem analyser af plasma er en stærk demonstration af sygdommens biologiske karakter. Et resumé af vores eksperimentelle analyser og nøgleresultater er vist i fig. 9.

Vores nuværende analyse af 98 prøver stemmer overens med den tidligere sammenligning af plasmacytokiner i 100 ME/CFS og kontroller, som ikke identificerede nogen signifikante forskelle mellem kohorter efter justering for flere tests [26]. I modsætning hertil identificerede vi 17 EV-cytokiner, der adskiller patienter og kontroller med justerede p-værdier på mindre end 0,2, alle højere hos ME/CFS-personer. Ud af disse 17 proteiner er størstedelen (10 ud af 17) kendt for at være pro-inflammatoriske cytokiner/kemokiner (TNF , IL1 , CXCL8, CXCL1, IL15, CCL7, IL17, CCL5, IL1 og IL1R1), 5 er relaterede. til adaptiv immunitet (IL2, CSF2, IL3, IL4 og IL7), IL12p40 har anti-inflammatoriske egenskaber, og NGF er både pro- og anti-inflammatorisk. Højere niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner er på linje med tidligere rapporter [43-45].

Selvom forskelle i EV-cytokinniveauer ikke nåede statistisk signifikans efter korrektion for flere sammenligninger i et tidligere pilotstudie med kun 38 forsøgspersoner, blev 13 af de 17 EV-cytokiner i denne undersøgelse også fundet i højere niveauer i EV'er fra ME/CFS-personer i sammenligning med kontroller [25]. Den mest signifikante forskel var IL2 (q=0.007, fig. 3). IL2 er et udskilt cytokin, der produceres af aktiverede CD4+ og CD8+T-lymfocytter og fremmer stærk proliferation af aktiverede B-celler og efterfølgende immunglobulinproduktion. Det spiller en central rolle i reguleringen af ​​det adaptive immunsystem ved at kontrollere overlevelsen og spredningen af ​​regulatoriske T-celler. IL2-niveauer viste sig at være højere i cerebrospinalvæske [46] og plasma fra ME/CFS-patienter [47]. De højere niveauer af IL2 fundet i elbiler i denne undersøgelse kan være en del af et specifikt immunrespons ved ME/CFS. Adskillige cytokiner/kemokiner, der blev observeret at være dysregulerede, produceres enten af ​​B-celler eller er også B-celleregulatorer (f.eks. CXCL1 og CXCL12).

Korrelationer af cytokiner med andre cytokiner giver information om netværkene af interaktioner mellem signalmolekyler. Adskillige andre undersøgelser viste, at netværkene af plasma- eller ekstracellulære vesikelcytokiner adskiller sig mellem ME/CFS-personer og kontroller [25, 41, 44, 48]. Vi har valgt at vise korrelationer mellem de tre typer data: plasma- og EV-cytokiner og plasmaproteomik - ved hjælp af korrelogrammer. Inspektion af den visuelle repræsentation af disse protein-protein-interaktioner afslører straks, at der er positive korrelationer mellem EV-cytokiner og mellem plasmacytokiner, der forekommer i tilfælde, men ikke kontroller og omvendt (fig. 5). En særlig slående observation er et større antal positive korrelationer mellem plasmacytokiner i ME/CFS end i kontroller (fig. 5b), hvilket indikerer, at cytokinsignalering er væsentligt anderledes, måske afspejler et inflammatorisk miljø.

Enoghalvfjerds proteiner karakteriseret ved massespektrometri udviste signifikante korrelationer med andre plasmaproteiner (fig. 5c). For eksempel udviste F2 31 positive korrelationer med andre proteiner, hvoraf elleve blev set i tilfælde, men ikke kontroller. F2 er koagulationsfaktor II eller thrombin og omdanner fibrinogen til fibrin og aktiverer faktor V, VII, VIII og XIII. Thrombin fremmer blodpladeaktivering og -aggregering, men det menes også at have andre funktioner under inflammation og sårheling [49].

På trods af at vi ikke observerede signifikante forskelle i niveauer af plasmacytokiner mellem de to kohorter, observerede vi korrelationer mellem plasmacytokiner med kliniske data. CSF2, også kendt som Granulocyte Monocyte Colony Stimulation factor (GM-CSF), er lavere hos mænd i både ME/CFS og kontroller og stiger med BMI i begge kohorter i henhold til både den robuste lineære regressions- og korrelationsanalyser (fig. 6a, tabeller) 2 og 3). I ME/CFS-kohorten, med stigende CSF2, indikerer score på SF36 Fysisk Funktion og MFI-træthedsskalaen en større effekt af henholdsvis fysiske symptomer og træthedssymptomer. En stigning i GM-CSF er forbundet med kronisk inflammation [50]. GM-CSF inducerer klassiske monocytter til at differentiere til monocyt-afledte dendritiske celler og makrofager in vitro [51]. Klassiske monocytter udviser et unikt genekspressionsmønster i ME/CFS sammenlignet med kontroller [52], og forhøjet GM-CSF kunne være en signalfaktor involveret i dette respons.

Forøgelser i niveauer af tre cytokiner, CCL2, CXCL10 og CCL11, var kun forbundet med stigende alder i ME/CFS-kohorten ifølge Spearman-korrelationer. CCL2, også kendt som MCP-1 (Monocyt Chemoattractant Protein-1), tiltrækker monocytter over endotelet ind i væv [53], og kan også være en faktor i den ændrede monocyt-genekspressionsprofil [54]. CCL2 blev også observeret at falde med alderen i den samlede kohorte ved både robust lineær regression og Spearman-korrelation, men stigninger i ME/CFS-kohorten med stigende alder ifølge Spearman-korrelation (fig. 6d, tabel 3). Ved brug af robust lineær regression var plasma CCL11 ikke signifikant stigende med alderen, men EV CCL11 blev forudsagt at være højere med stigende alder. CXCL10 (IP10) er også involveret i cellemigration, især tiltrækningen af ​​makrofager, monocytter og aktiverede T- og NK-celler [55]. CCL11, også kendt som eotaxin, er kendt for at stige med alderen, og højere niveauer er forbundet med nedsat neurogenese [56]. To store undersøgelser har tidligere observeret en sammenhæng mellem leptin, GM-CSF, IP10 og eotaxin med ME/CFS-sværhedsgrad [43] eller højere eotaxin i langvarige ME/CFS-tilfælde [41]. Næsten alle ME/CFS-personer i denne undersøgelse har været syge i mere end 3 år.

Højere leptin er korreleret med kvindeligt køn og højere BMI hos både patienter og kontroller ved robust lineær regression og korrelationsanalyser (tabel 2 og 3). Højere leptin er også forbundet med IBS i patientkohorten (fig. 6b). Forøgelse i leptin er også korreleret med dårligere score på SF36 fysiske funktionsmål og MFI-træthedsskala (fig. 6c). Leptin var tidligere korreleret med træthed og sværhedsgrad ved ME/CFS [43, 54]. Stigende niveauer af et andet inflammatorisk cytokin, TNF, korrelerer også med lavere patientfysiske funktionsscore på SF36 og er tidligere blevet rapporteret at være forhøjet ved ME/CFS [41, 57, 58] (fig. 6e).

Højere niveauer af IL1-RA, som antagoniserer IL1-inflammatoriske cytokiner, var forbundet med højere BMI og lavere SF-36 fysisk funktion i ME/CFS-tilfælde (fig. 6e). Selvom IL1-RA kan anses for at være antiinflammatorisk, er det kendt, at IL1-RA-niveauer er højere ved fedme [59], og højere niveauer anses for at være en markør for metabolisk dysregulering [60] , hvilket kan resultere i den lavere fysiske formåen.

Vi observerede, at lavere niveauer af det antiinflammatoriske cytokin IL13 var forbundet med lavere aktivitet i ME/CFS-tilfældene. IL-13 blev tidligere rapporteret at være lavere hos kvinder med ME/CFS i forhold til kontroller [61]. I modsætning hertil var højere IL13 korreleret med øget symptomsværhedsgrad i en undersøgelse [43], mens der ikke blev set nogen forskel mellem tilfælde og kontroller i en anden [41].

【Kontakt】 E-mail: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501