Proteiner blev fundet med en frekvens på mindst 2 i hver undersøgt tilstand

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Ydermere, fra søjlediagrammerne i figur 5B og 6B, er den karakteristiske proteinfordeling i overensstemmelse med den udskillende celles hypoxiske prækonditionering mærkbar. I dette tilfælde, for fuldstændig information, blev proteiner, der ikke overstiger tærsklen for DAve og DCI sæt, også rapporteret. Fosteret har sekretomresultater beriget med 60 kDa varmechokproteinet (HSPD1, figur 5B, venstre panel) i dets hypoxiske formulering, mens den perinatale modpart i høj grad udtrykte glat muskelcelle kontraktilt myosin regulatorisk [52]let polypeptid 9 (MYL9, figur). 5B, højre panel). En vigtig del af forskellen mellem svangerskabsstadier synes at afhænge mere af hypoxisk prækonditionering i hAFS. elbiler; f-have-EV'er opnået fra hypoxisk cellepriming blev fundet beriget med faktorer, herunder Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Laminin Subunit -5 og -1(LAMA5 og LAMB1), Thrombospondin{{17 }} (THBS1, figur 6B, venstre panel). Hypoxiske p-hAFS-EV'er indeholdt Ferritin Heavy Chain (FTH1), stilladsproteiner som Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexin A6(ANXA6), Rab GDP-dissociationshæmmer beta (GDI2) sammen med Thy -1 membranglykoprotein (THY1), Neuropilin-1(NRP1) og Matrix Metalloprotein 14 (MMP14, figur 6B, højre panel).

Klik venligst her for at vide mere

Proteiner blev fundet med en frekvens på mindst 2 i hver undersøgt tilstand i f-hAFS. EV'er og p-hAFS-EV'er blev yderligere sammenlignet med Vesciclepedia-databasen [53]. Som forventet er størstedelen af ​​de identificerede proteiner (96 procent) tidligere blevet beskrevet i EV'er og exosomer i referencedatabasen (figur S3A).cistanche fordeleI denne henseende blev Gene Ontology (GO) berigelsesanalyse udført ved hjælp af FunRich [54]. Overfloden af ​​GO-termer i datasættet blev sammenlignet med deres naturlige mængde i referencedatabasen for at finde statistisk overrepræsenterede grupper af proteiner i henhold til deres involvering i biologiske processer, molekylær funktion og cellulære komponenter (for dette sidste aspekt er data ikke vist, men tilgængelig på forespørgsel). Med hensyn til analysen af ​​de molekylære funktioner forbundet med identificerede proteiner indikerede hAFS-CM-fraktioner berigelse i en strukturel bestanddel af ekstracellulær matrix og cytoskelet, cytoskeletproteinbinding og strukturel molekyleaktivitet (figur S2), mens hAFS-EV'er blev beriget med en strukturel bestanddel af cytoskelet og ribosom, DNA- og RNA-binding og GTPase og chaperonbindingsfaktorer (figur S3C).

Biologisk procesberigelsesanalyse for både hAFS-CM og have-EV'er indikerede, at størstedelen af ​​proteiner moduleret i de føtale- og perinatale hAFS-sekretomfraktioner tilhører cellevækst/vedligeholdelse og proteinmetabolisme (figur 5C og 6C). Inden for hAFS-EV'er bemærkede vi, at udtrykket "ekstracellulære matrix strukturelle bestanddele" udelukkende var forbundet med hypoxiske f-hAF-EV'er; udtrykkene "calciumionbinding" og "strukturel molekylær aktivitet" blev hovedsageligt beriget i hypoxiske f-hAFS- og p-hAFS-prøver (figur S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I og en DCI (konfidens af differentielt udtryk) Større end eller lig med I5I passerede filtrene og blev betragtet som differentielt udtrykt; se tabel S3 for den komplette liste og detaljerede parametre for de rapporterede proteiner. (C) Biologiske processer berigelsesanalyse af proteiner identificeret med en frekvens på mindst 2 i f-hAFS-EV'er (venstre panel) og p-hAFS-EV'er (højre panel) efter hypoxisk prækonditionering. Baseret på FunRich-værktøjet vises genontologitermer i søjlediagrammer, der rapporterer procentdelen af ​​gener beriget for hver kategori (mørkegule søjler for f-hAFS-EVsnormo, røde søjler for f-hAFS-EVShypo, lysegrønne søjler for p-hAFS -EVsnormo og mørkegrønne bjælker for p-hAFS-EVShypo). Kun genontologiske termer med Bonferroni korrigeret*s<0.05 are="">

Cistanche kan anti-aging

2.6. Cytokin- og kemokinprofileringen af ​​føtal vs. perinatal har-CM og har-EV'er afslørede forskellige distributionsmønstre

Vi har tidligere valideret den regenerative kapacitet af f-hAFS-CMhypo på skadede kardiovaskulære celler via parakrine effekter [34,35,49]. Her sammenlignede vi cytokin- og kemokinindholdet af f-hAFS-CMHypo med den tilsvarende p-hAFS-modpart (figur 7A, figur S4A og tabel S4) og fandt nogle diskriminerende faktorer.

ANGIOGENIN, Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer (EMMPRIN), Interleukin 8 (IL-8) og Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) blev fundet udelukkende beriget inf-hAFS-CMNypo og blev ikke fundet. påvist i p-hAFS-CMhypo. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 (IGFBP2) og Osteopontin (OPN) blev signifikant forøget i f-hAFS-CMhypo over p-hAFS-CMHypo med 3.5-og 3.8-fold (" s<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Mens føtal versus perinatal have-CM viste differentiel ekspression i deres cytokin- og kemokinprofil, var de tilsvarende føtale versus perinatale EV-modstykker mere homogent fordelt, dog med lavere ekspressionsprofiler (figur 7B, figur S4B og tabel S5). Ikke desto mindre kunne nogle forskelle forstås: DiPeptidyl-Peptidase IV (DPPIV), Vækst/differentieringsfaktor 15 (GDF-15) og IL-8 blev kun udtrykt af f-hAFS-EVSHypo, selvom de var ved lav niveauer; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND og vitamin D-bindende protein (VDBP) blev kun fundet i p-hAFS-EVShypo, på trods af endnu en gang påvist i lave mængder. Andre cytokiner såsom hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, Stromal Derived Factor{ {23}} alfa (SDF-1a), blev fundet i både f-hAFS-EVShypo og p-hAFS-EVSHvpo, hvor PAI-1 og EMMPRIN var mere udtrykt (figur 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 og SDF-lo blev udelukkende beriget i alle hypoxiske have-EV'er sammenlignet med den tilsvarende hAFS-CM, uanset svangerskabsstadiet. Desuden, mens EMMPRIN ikke blev påvist i p-hAFS-CMhypo, blev det fundet beriget i den EV tilsvarende fraktion; omvendt var OPN mere rigeligt i f-have-CMhypo end i f-have-EVShypo, mens det var sammenligneligt blandt de tilsvarende p-hAFS-sekretomfraktioner. FGF-19, MIF og PTX3 blev på samme måde udtrykt i både føtal- og perinatal has-CM og i de tilsvarende hAFS-EV'er. PAI-1 var stærkt beriget i hypoxiske sekretomfraktioner.

Figur 7. Cytokin- og kemokinprofilering i føtal- og perinatale hAFS-sekretomformuleringer. (A) Ekspression af cytokiner og kemokiner detekteret i det hypoxiske føtal-versus perinatale have-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) rapporteres i pixeltæthed ved vilkårlig enhed [AU]. Værdier er udtrykt som middel ±sem af uafhængige eksperimenter og rapporteret i tabel S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B)Cytokin- og kemokinindhold påvist i det hypoxiske føtal- versus perinatale hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) og udtrykt ved pixeltæthed i vilkårlige enheder [AU].cistanche kolesterolVærdier er udtrykt som middelværdi±søm af n=3 uafhængige eksperimenter og rapporteret i tabel S5. CST3: Cystatin C;EMMPRIN:Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer;FCFF-19: Fibroblast Growth Factor-19;IGFBP2:Insulin-like Growth Factor(IGF)Binding Protein 2;IL-8:Interleukin -8;IL-17a:Interleukin-17a; MCP-1: Monocyt Chemoattractant Protein-1;MIF:Macrophage Migration Inhibitory Factor; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Plasminogen Activator Inhibitor-1; BDNF: hjerneafledt neurotrofisk faktor; DPPIV: Dipeptidyl Peptidase IV; GDF-15:Growth Differentiation Factor-15;IGFBP3:Insulin-like Growth Factor(IGF)Binding Protein 3;SDF-1a: Stromal Derived Factor-1 alfa; VDBP: Vitamin D-bindende protein.

2.7. Føtale- og perinatale have-EV'er er beriget med RNA-information i deres last

Da små ikke-kodende RNA'er er blevet betragtet som masterregulatorer af EV parakrin indflydelse på målceller [4,55], fokuserede vi hovedsageligt RNA-sekventeringsanalyse på mikroRNA (miRNA) indhold i f-hAFS-EV'er og p-hAFS-EV'er. Lille RNA-profilering viste berigelse af miRNA i både føtal- og perinatale hAFS-EV'er (omkring 35-36 procent) sammenlignet med den samlede lille RNA-mængde (figur 8A). miRNA-komponenten var faktisk blandt de to mest repræsenterede RNA-arter i begge EV-formuleringer sammen med rRNA(***p) p < 0.0001).="" følgende="" mirna'er="" var="" de="" mest="" berigede="" i="" de="" analyserede="" ev-prøver:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,lad-7a-5p,lad-7b-5p,lad-7f{="" {27}}p,lad-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" og="" mir-221-3s.="" det="" skal="" bemærkes,="" at="" føtal-="" og="" perinatale="" have-ev'er="" delte="" størstedelen="" af="" ​​sådanne="" mirna'er="" (nemlig="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" lad-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" og="" mir-221-3p,="" figur="" 7b).="" de="" 15="" mest="" berigede="" mirna-arter="" dækkede="" mere="" end="" 60="" procent="" af="" det="" samlede="" mirna-indhold="" i="" hver="" prøve.="" på="" den="" anden="" side="" blev="" der="" fundet="" omkring="" 100="" mirna'er="" i="" de="" resterende="" 30="" procent="" af="" det="" vesikulære="" mirna-indhold="" (figur="">

For yderligere at karakterisere miRNA-indholdet inden for hAFS-EV'er undersøgte vi, om hAFS-gestationsstadiet eller in vitro hypoxisk celleprækonditionering kunne påvirke berigelsen af ​​specifikke miRNA'er. Den stærkeste modulation blev fundet mellem svangerskabsstadier, hvor næsten alle modulerede miRNA'er blev beriget i f-hAFS-EV'er over den perinatale modpart (Figur 9A og Tabel 1). Hypoksisk prækonditionering havde en mildere effekt på miRNA-last, hvorimod modulation i denne sammenligning var i begge retninger, med nogle miRNA beriget i hypoxiske og andre i normoxiske kontrolforhold (Figur 9A).

Som en komplementær analyse fokuserede vi på identifikation af undersøgte miRNA'er med den laveste variabilitet på tværs af de forskellige donorer og kulturprækonditionering for EV'er afledt af begge undersøgte gestationsstadier. miRNA'er som følge af denne analyse spændte fra høje til lave ekspressionsniveauer (figur 9B). Inden for den mest stabile miRNA-kerne af hAFS-EVs last blev nogle delte miRNA mellem f-hAFS-EVs og p-hAFS-EVs identificeret (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p på højt niveau; miR-221-3p,miR-221-5p og miR-22-3p på dæmpet niveau, tabel 2).

Figur 9. Analyse af differentiel berigelse af miRNA'er i føtal- og perinatale hAFS-EV'er. (A) Volcano plots for differentiel berigelse af hAFS-EV miRNA-last i henhold til svangerskabsstadiet (venstre panel) og in vitro hypoxisk prækonditionering af udskillende celler (højre panel). For miRNA-detaljer henvises til tabel 1. (B) Scatterplot af korrelationen mellem variabilitet (X-akse) og berigelsesniveau (Y-akse) af stabile miRNA'er inden for føtale hAFS-EV'er (venstre panel) og perinatale hAFS-EV'er (højre panel) i henhold til høj (gule prikker), svag (grønne prikker) og lav (mørk lilla prikker) berigelse. For miRNA-detaljer henvises til tabel 2. RPM: aflæsninger pr. million.

3. Diskussion

Rester af kasserede prøver af humant fostervand er blevet identificeret som en værdifuld kilde til stromaceller med lovende potentiale inden for regenerativ medicin og vævsteknologi. Etiske bekymringer forbundet med deres isolation er minimale, da de kan fås fra enten resterende prøver af rutineprænatal screening amniocentese, under II trimester af graviditeten (føtalt hAFS) eller fra fostervand kasseret som klinisk affald i III trimester planlagt C-sektion procedurer (perinatal hAFS). I de senere år er hAFS blevet foreslået som potentielle terapeutiske midler til reparation og regenerering af humant væv givet de opmuntrende beviser opnået fra eksperimentelle sygdomsmodeller. Interessant nok er de også blevet foreslået til in utero terapi af føtal-neonatale neurologiske sygdomme; faktisk antydede prækliniske undersøgelser, at hAFS administreret prænatalt via intra-amniotisk levering beskyttede rygmarven under drægtighed via parakrin aktivitet i en rottemodel af myelomeningocele [56-58], og reducerede skaden af ​​blotlagt tarm i eksperimentel gastroschisis hos gnavere[59] ]. Fra et translationelt perspektiv kunne in utero transplantation af hAFS erstattes af administration af det mest egnede præparat af deres sekretom (hAFS-CM eller hAFS-EVs).cistanche deserticola bivirkningerDenne strategi vil muliggøre hurtig og rettidig indgriben under graviditeten ved at overvinde begrænsningerne af kanonisk celleterapi (dvs. tidskrævende in vitro celleudvidelse), samtidig med at der tilbydes hyldeklare og brugsklare farmaceutiske formuleringer.

Den nylige udvikling af mindre invasive prænatale diagnostiske teknikker kan resultere i et fald i amniocenteseprocedurer i den nærmeste fremtid, og dermed anbefale perinatal hAFS som den mere tilgængelige mulighed. Ikke desto mindre, da føtale hAFS er mere udviklingsmæssigt umodne, kan de rumme et mere effektivt parakrint potentiale. Inden for dette scenarie sammenlignede vi her føtal- og perinatal c-KITt hAFS, og vi fokuserede på at profilere deres sekretomfraktioner. Vi fremhævede relevante sondringer, der skal tages i betragtning for den mulige kliniske oversættelse af deres parakrine kapacitet.

I overensstemmelse med tidligere uafhængige undersøgelser viser vi, at svangerskabsstadiet ikke påvirkede den heterogene hAFS-morfologi og deres mesenkymale antigenprofil [25,26]. Vi evaluerede derefter parametre, der var mere tilbøjelige til at påvirke cellesekretorisk og parakrin aktivitet ud over kanonisk stromal immunfænotype. Især tilstedeværelsen af ​​en CD146-positiv, CD107a-høj subpopulation i knoglemarvs mesenkymale stamceller har for nylig vist sig at korrelere med bemærkelsesværdig modulerende og terapeutisk parakrin aktivitet [47]. Her afslørede vi, at både føtal- og perinatal hAFS er stærkt karakteriseret ved denne molekylære signatur, der understøtter deres sekretoriske styrke med relevante translationelle implikationer. Desuden var føtale hAFS karakteriseret ved ineffektiv aerob metabolisme, mens mere modne perinatale viste højere iltforbrugshastighed og ATP-syntese. Dette kan tyde på en mere umoden metabolisk profil af II trimester hAFS, der ligner navlestrengs stromaceller fra præmature nyfødte, som har vist den samme tendens [60].

For at udløse parakrint potentiale blev hAFS udsat for 24 timers serumfri hypoxisk priming, en strategi, vi tidligere med succes har udviklet [34,35,37] for føtale celler, og som vi her undersøgte på deres perinatale modstykke for første gang. Prækonditionering af føtal- og perinatal hAFS under hypoxi resulterede i en positiv tendens i stigningen i deres sekretomkoncentration og i mængden af ​​frigivne EV'er, hvorimod svangerskabsstadiet ikke udøvede nogen effekt på cellesekretomudbyttet eller på EV-morfologi og størrelsesfordeling.

Navnlig afslørede karakterisering af hAFS parakrine last nogle specifikke forskelle i henhold til de forskellige forhold, vi evaluerede. Den proteomiske profilering af det føtale hAFS-sekretom afslørede mærkbare faktorfordelinger baseret på svangerskabsstadiet og cellehypoxisk prækonditionering. Dette indikerer, at hAFS parakrine potentiale kan erhverve en distinkt identitet under modning fra Ⅱ til Ⅲ svangerskabstrimester, som igen kan moduleres ved at stimulere de secernerende celler in vitro. Biologiske processer berigelsesanalyse af hAFS-CM og hAFS-EV'er antydede, at de fleste af de modulerede proteiner kan stemme overens med cellevækst/vedligeholdelse og proteinmetabolisme, hvilket understøtter de celle gavnlige parakrine virkninger, der er rapporteret langt. Især blev det hypoxiske føtale hAFS-totalsekretom fundet beriget med varmechokproteinet HSPD1 (HSP60), som blev demonstreret at understøtte sårheling i en diabetisk musehudskademodel og fremme makrofags pro-opløsning skævvridning til M2-fænotype [61] . Ligeledes blev hypoxiske føtale hAFS-EV'er beriget for faktorer, der fremmer neurogenese (HSPG2[62], selvfornyelse af celler og hjerne- og kardiovaskulær udvikling (LAMA5[63]og LAMB1[64]og migration (THBS1 [2]). Proteoglykanen AGRN blev også fundet i elbiler efter hypoxisk priming af føtal hAFS.cistanche dosering redditVores resultater er i overensstemmelse med tidligere bevis på, at AGRN er opreguleret i proteomet af mesenkymale stromaceller under inflammatoriske og hypoksiske instruktive stimuli [65]. AGRN har også vist sig at være impliceret i immunsynapsesignalering [66] og stemmer overens med neonatal musehjerteregenerering [67], hvilket understøtter en udtalt disposition af udviklingsmæssigt unge føtal hAFS mod regenerative parakrine effekter. Desuden blev føtalt hAFS bekræftet at være mere responsivt over for hypoxisk prækonditionering som vist ved berigelse af prædiktorer for vaskulær regenerativ effektivitet, såsom ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 og MCP-1 cytokin[68], i deres betingede medium. Dette understøtter tidligere beviser for den parakrine styrke af føtalt hAFS-CM til at booste endogen neo-arteriogenese i prækliniske gnavermodeller af myokardieinfarkt, iskæmi i bagben og iskæmisk fasciokutan flap [34,69-71]Yderligere er føtal hAFS totalsekretom blev fundet betydeligt mere beriget med IGFBP2 og OPN sammenlignet med det perinatale, hvilket tyder på en mere udtalt pro-resolverende og anti-aldringsmodulerende profil[72-75]. Den perinatale have-CM, mens den var mindre forstærket i parakrine faktorer, blev på samme måde suppleret med neurotrofiske og immunmodulerende faktorer, såsom CST3[76,77] og MIF[78].

Sammenlignet med total hAFS-CM viste de tilsvarende hypoxiske føtale- og perinatale-EV-modstykker lavere ekspression af cytokiner og kemokiner, med undtagelse af den vaskulære remodelleringsmediator EMMPRIN [79], som for det meste var beriget i vesikelrummet. Den tidligere rapporterede kardioaktive og pro-regenerative profil af føtale hAFS-EV'er[34,37] er blevet bekræftet heri af bevis for deres eksklusive udtryk for kardiobeskyttende IL-8 [80] og GDF-15, en vigtig parakrin faktor, der udløser endogen voksen hippocampus neurogenese[81,82], såvel som modvirker antracyklin-induceret kardiotoksicitet [78]. Både føtal- og perinatale hAFS-EV'er viste lignende udtryk for progenitor/stamcellehandelsregulatoren SDF-1 [83-85]. Den proteomiske analyse rapporterede øget ekspression af proteiner relateret til angiogenese, såsom NRP1 [86] og MP14[87] i hypoxiske perinatale hAFS-EV'er; en sådan stimulerende profil kan forklare tidligere resultater om de endoteliale regenerative egenskaber af Ⅲ trimester hAFS i en præklinisk musemodel for iskæmisk skeletmuskelskade [25], på trods af beviset på, at deres hAFS-CM er mindre pro-angiogen end den tilsvarende føtale. Navnlig blev den neurale vækstfaktor BDNF fundet i både føtal- og perinatal EV-last, skønt i lave mængder, hvilket tyder på en formodet neurotrofisk aktivitet for hAFS-EV'er i neuronale overlevelses- og neuroudviklingsprocesser, som også observeret for ekstracellulære vesikler udskilt af menneskelig knogle marv og navlestrengsblod-MSC[8889]. Både sekretomformuleringer fra føtal- og perinatal hAFS, der undergik hypoxisk stimulation, viste sig at være beriget med PAI-1, en facilitator af endotelaktivering [90], som også har været involveret i polariseringen af ​​M2-makrofager i hjertet og udstyret med kardiobeskyttende og anti-fibrotisk potentiale [91].

MikroRNA'er (miRNA'er) er bredt blevet behandlet som afgørende regulatorer af stamcelle- og mesenkymal stromal celle-EV parakrin aktivitet [92,93]. Her fandt vi, at de 15 mest berigede miRNA-arter inden for hAFS-EV'erne dækker mere end 60 procent af det samlede miRNA-indhold i hver prøve. Disse miRNA'er er blevet rapporteret at karakterisere den molekylære last af mesenkymale stromale celle-EV'er (lad-7a-5p [4,95]), beskytte mod myokardieiskæmi ved at påvirke vaskulær regenerering og hæmme fibrose (lad -7b-5p, lad-7f-5p, miR-21-5p og miR-155-5p [96,97]), promover sårheling ved at regulere keratinocytfunktionen (miR-16-5p [98]) og modvirke neuronal død efter forhjerneiskæmi (miR-29a-3p [99.100]). På den anden side blev der fundet omkring 1000 miRNA'er i de resterende 30 procent af indholdet af vesikulært miRNA. En sådan ubalanceret fordeling er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [4] og fremhæver de for det meste berigede miRNA'er som de formodede ansvarlige for den vigtigste biologiske aktivitet af hAFS-EV'er. Interessant nok delte føtal- og perinatale hAFS-EV'er størstedelen af ​​15 miRNA'er. Det skal bemærkes, at vi også observerede, at både føtale hAFS-EV'er og perinatale indeholdt et sæt meget stabile miRNA'er på tværs af forskellige berigelsesniveauer. Sådanne beviser kan foreslå en bred vifte af "husholdning"-kandidater, der skal bruges som en intern referencekontrol i qPCR-eksperimenter på hAFS-EV'er. Desuden en konsekvent undergruppe af sådanne stabile miRNA'er (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) deles mellem de to svangerskabsstadier og overlapper med de 15 for det meste berigede, hvilket tyder på en endnu mere konstant adfærd og en pålidelig præ-opløsende molekylær signatur([96,{{45 }}]). Det skal bemærkes, at et par kandidater inden for en sådan karakteristisk kerne for nylig er blevet rapporteret som reference miRNA'er i neurobeskyttende EV'er opnået fra II trimester fostervand-afledte mesenkymale stromaceller (miR-29a-3p og miR{{ 49}}s[95]). Ikke desto mindre bemærkede vi også, at gestationsalder kan modulere miRNA-lasten mere end hypoxisk prækonditionering. Udviklingsmæssigt blev mere juvenile EV'er opnået fra III trimester føtal hAFS beriget med miRNA'er, der tidligere er vist at understøtte levedygtigheden af ​​embryonale stamceller (miR-302-3p [101]), celleproliferation og osteogen differentiering af knoglemarvsstromaceller (miR) -217 [102]), mens den også rummer tumorsuppressorpotentiale (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Baseret på vores resultater bekræfter vi her, at føtal- og perinatal hAFS kan repræsentere attraktive parakrine kilder, der skal udnyttes til regenerativ medicin. Mens deres fænotype og sekretoriske aktivitet var ens, har vi fremhævet nogle ejendommelige aspekter i deres sekretomformuleringer som nyttige indsigter for deres fremtidige terapeutiske oversættelse.

4. Materialer og metoder

4.1. Humant fostervandsstamcelleisolering og in vitro-dyrkning

Humane fostervandsstamceller (hAFS) blev isoleret fra resterende prøver af fostervand (AF) opsamlet ved rutineprænatal screening via Ⅱ trimester fostervandsprøver (føtalt hAFS, f-hAFS) eller som klinisk affald under planlagt kejsersnitslevering under Ⅲ trimester (perinatal hAFS,p-hAFS) på Prænatal Diagnosis and Perinatal Medicine Unit, IRCCS San Martino Hospital, på Føtal- og perinatal Medical and Surgery Unit og Human Genetics Laboratory på IRCCS Istituto Gaslini hospital (Genova, Italien). Informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra alle donorer i henhold til den lokale etiske komitégodkendelse (protokol PR428REG2015) og i overensstemmelse med Helsinki-erklæringens retningslinjer. II trimester føtal AF-prøver blev opnået fra kvindelige donorer med en gennemsnitsalder på ca. 37,42±0,32 år (n=15 fra 36-op til 41 år);Ⅲ trimester perinatale AF-prøver blev opnået fra kvindelige donorer med en gennemsnitsalder på 34,25±1,31 år (n=10 fra 26- op til 42 år). Føtal- og perinatal hAFS blev opnået fra prøver valideret for normal karyotype og isoleret ved immunomagnetisk sortering for c-KIT-ekspression (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Italien) fra adhærente AF mesenchymale stromale celler[16].cistanche ekstrakt fordelec-KIT* hAFS blev dyrket i Minimal Essential Medium (MEM)-alpha med 15 procent FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien), 18 procent Chang B og 2 procent Chang C Medium (Irvine Scientific) , Santa Ana, CA, USA) med 1 procent L-glutamin og 1 procent penicillin/streptomycin (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien), i en inkubator ved 37 grader med 5 procent CO2 og 20 procent Oz atmosfære og dyrket op til 5 passager in vitro, før de bruges til at isolere deres sekretom.

4.2.Biokemisk evaluering af hAFS-metabolisme

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) celler blev brugt til hvert eksperiment. For at evaluere basal respiration blev hAFS permeabiliseret med 0,03 mg/ml digitonin i 10 minutter og suspenderet i phosphatbuffer saltvand (PBS).10 mM pyruvat plus 5 mM malat eller 20 mM succinat blev tilsat for at stimulere banen -måder sammensat af henholdsvis kompleks I, II og IV eller komplekser Ⅱ og IV [60].

For at evaluere de relative bidrag til respiration af glutamin, langkædet fedtsyreoxidation og glucose blev celler efter digitonin-permeabiliseringen suspenderet i et vækstmedium og 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir og 4 uM UK5{{22} }99 blev tilsat for at hæmme henholdsvis glutaminase, carnitin palmitoyl-transferase 1A(CPT1A) eller den mitokondrielle pyruvatbærer (MPC). Fi-F.ATP-syntase(ATP-syntase)-aktivitet blev påvist ved at måle ATP-produktion ved hjælp af den meget følsomme luciferin/luciferase-metode. Assayene blev udført ved 37 grader i 2 minutter, og data blev indsamlet hver 3. 0 s. I et første sæt eksperimenter blev 10 graders celler inkuberet i 10 min i medium indeholdende 50mM KCl,1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0,6mMouabain,1mM P1P5-Di (adenosin-5')penta-phosphat, 0,040 mg/ml ampicillin og 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Derefter blev ATP-syntese induceret ved tilsætning af de respiratoriske substrater (10 mM pyruvat plus 5 mM malat eller 20 mM succinat) og 0,1 mM ADP. Reaktionen blev målt under anvendelse af luciferin/luciferase ATP-bioluminescensanalysesættet CLSII (Roche, Basel, Schweiz) i et Luminometer (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milano, Italien)ATP-standardopløsninger (Roche, Basel, Schweiz) i området {{ 42}}/M blev brugt til kalibrering. I det andet sæt eksperimenter blev ATP-syntese evalueret i nærvær af 4 uM BPTES, 4 uM Etomoxir eller 4 uM UK5099. I dette tilfælde blev 10 celler inkuberet i 10 minutter i et vækstmedium i fravær eller tilstedeværelse af en metabolismehæmmer, og ATP-syntese blev induceret med 0,1 mM ADP. OxPhos (oxidativ phosphorylering) effektivitet (P/O-forhold) blev beregnet som forholdet mellem koncentrationen af ​​produceret ATP og mængden af ​​forbrugt oxygen i nærvær af respiratorisk substrat og ADP. Når iltforbruget er helt afsat til energiproduktion, bør P/O-forholdet være ca. 2,5 og 1,5 efter henholdsvis pyruvat plus malat- eller succinattilsætning [48]For at evaluere bidraget af anaerob glykolyse til hAFS-metabolisme, blev glukose- og laktatkoncentrationer evalueret i vækstmediet. Glucoseforbruget blev evalueret af hexokinase (HK) og glucose-6-phosphat dehydrogenase(G6PD) koblingssystemet efter reduktionen af ​​NADP ved 340 nm. Assaymediet indeholdt 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IE hexokinase og 2 IE glucose-6-phosphatdehydrogenase. Lactatfrigivelse blev analyseret efter reduktionen af ​​NAD plus ved 340 nm. Assaymediet indeholdt 100 mM Tris-HCl (pH8), 5 mM NAD plus og 1 IU/ml lactatdehydrogenase. Prøver blev analyseret før og efter tilsætning af 4 ug oprenset lactatdehydrogenase. I begge tilfælde blev data normaliseret til celleantallet og udtrykt som henholdsvis mM glucose/10 graders celler eller mM lactatfrigivet/10 graders celler[107].

4.3. Flowcytometrikarakterisering af hAFS

Et hundrede tusinde (105) føtale- og p-hAFS-celler blev løsrevet og inkuberet med muse-anti-human-CD107a-Alexa Fluor 647-og anti-human CD146-FITC- konjugerede antistoffer (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien). Celleapoptose blev vurderet ved hjælp af et FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italien) efter producentens instruktioner. Begivenheder blev erhvervet på en BD Bioscience FACS Aria II sorterer og analysator, udstyret med FACS Diva software (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milano, Italien). Data blev analyseret ved hjælp af FlowJo V9.0 software (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milan , Italien). 4.4. Alderdomsfarvning

Ældringsfænotypen af ​​hAFS dyrket op til passage 5 i standard in vitro-betingelser blev evalueret med Senescence -Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA): f-hånd p-hAFS blev fikseret med 1x fikseringsopløsning ved 70 procent sammenflydende og farvet for SA- -gal ved 37 grader natten over i henhold til producentens instruktioner. Ældrende begivenheder blev erhvervet på et Leica DMil-mikroskop (udstyret med Leica Acquire-software V3.4.4, Leica Microsystems, Milano, Italien) og evalueret som en procentdel af SA- -gal-positive celler i forhold til det samlede antal celler pr. felt.

4.5. Adskillelse og koncentration af hAFS-sekretomfraktionerne

f-hAFS og p-hAFS blev dyrket i 24 timer i serumfrit medium (SF) i 1 procent O2-hypoxi versus 20 procent O2-normoksi (kontrol), hvoraf sidstnævnte blev brugt som basislinjereference. Denne prækonditioneringsstrategi blev brugt til at øge frigivelsen af ​​bioaktive parakrine faktorer, som vi tidligere rapporterede [34,35,37,49]. hAFS blev dyrket i 24 timer i serumfrit (SF) medium (Høj glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, med 1 procent L-glutamin og 1 procent penicillin/streptomycin, alt fra Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien), under normoxiske (20 procent O2 og 5 procent CO2 ved 37 grader) eller hypoksiske (1 procent O2 og 5 procent CO2 ved 37 grader i CellXpert C170i og Galaxy 48R CO2 inkubatorer, fra Eppendorf, Milano, Italien) forhold.

f-hAFS-CM og p-hAFS-CM blev opsamlet og centrifugeret ved 4 grader ved 300x g i 10 minutter og 2000x g i 20 minutter for at fjerne cellerester; hAFS-CM blev koncentreret ved hjælp af ultrafiltreringsmembraner med en 3kDa selektiv cut-off (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Tyskland) ved 4 grader ved 3000× g i 90 minutter og derefter yderligere koncentreret ved 4 grad ved 3000× g i 30 min. hAFS-EV'er blev adskilt og koncentreret ved seriel ultracentrifugering fra hAFS-CM. Kort fortalt blev hAFS-CM opsamlet og centrifugeret ved 4 grader ved 300 x g i 10 minutter og 2000 x g i 20 minutter for at fjerne cellerester. Supernatanten blev derefter behandlet ved 10.000 x g i 40 min. Pelleten blev kasseret, og supernatanten blev yderligere bearbejdet ved ultracentrifugering i en Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milano, Italien) ved 10.000 xg i 120 minutter under anvendelse af Beckman Coulters SW55Ti centrifugerotorer med svingende spand. Pelleten indeholdende heterogene hAFS-EV'er blev vasket i PBS med endelig centrifugering ved 100.000 x g i 120 minutter og derefter resuspenderet i PBS filtreret med en 0,22 um pore filtermembran. Proteinkoncentrationer i hAFS-CM og på overfladen af ​​hAFS-EV'er blev målt ved hjælp af BiCinchoninsyre (BCA) assay (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien). Prøver blev erhvervet på en Gen5 mikropladelæser ved 570 nm for at evaluere hAFS-CM og hAFS-EVs udbytte i form af ug af opløsning/10 graders producerende celler.

4.6. Karakterisering af hAFS-EV'er ved transmissionselektronmikroskopi og nanopartikelsporingsanalyse

Transmissionselektronmikroskopi (TEM)-analyse blev udført på et Hitachi TEM-mikroskop (HT7800-serien, Hitachi High Technologies, Monza, Italien). Digitale billeder blev taget med et Mega view 3-kamera og Radius-software (EMSIS, Münster, Tyskland). f-hAFS og p-hAFS blev fikseret i 3,7 procent paraformaldehyd (PA) opløsning fortyndet 1:1 med hAFS komplet medium, vasket i 0.1 M cacodylatbuffer og derefter straks inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i 0,1 M cacodylatbuffer indeholdende 2,5 procent glutaraldehyd (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA). Cellepelleter blev efterfikseret i osmiumtetroxid i 1 time og i en 1 procent uranylacetatopløsning i 1 time. Prøver blev dehydreret i 24 timer ved 42 grader og 48 timer ved 60 grader gennem en sorteret ethanol-serie og indlejret i epoxyharpiks (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Tyskland). Ultratynde snit (50 nm) blev skåret med Leica Ultracut mikrotom (Leica Microsystems, Milano, Italien) og modfarvet med en 5 procent uranylacetat i 50 procent ethanolopløsning. f-hAFS-EV'er og p-hAFS-EV'er blev resuspenderet i 20 uL PBS-opløsning og fikseret ved at tilsætte et lige så stort volumen af ​​2 procent paraformaldehyd i 0,1 M phosphatbufferopløsning (pH 7,4). EV'er blev derefter adsorberet i 10 minutter på formvar-carbonbelagte kobbergitre ved at flyde gitrene på 5 μL dråber på parafilm. Efterfølgende blev gitre med klæbende EV'er skyllet i PBS og negativt farvet med 2 procent uranylacetatopløsning i 5 minutter ved stuetemperatur. Farvede gitre blev indlejret i 2,5 procent methylcellulose for forbedret konservering og lufttørret før undersøgelsen. Morfometrianalyse af hAFS-EV'er blev målt på 10 tilfældigt taget mikrofotografier ved 40.000× g forstørrelse. Størrelsen blev beregnet ved hjælp af den vilkårlige linjefunktion indlejret i måledialogboksen i Radius-softwaren (EMSIS, Münster Tyskland). For at visualisere hAFS-EVs størrelsesfordeling blev resultater plottet som scatter dot plot og som frekvensfordeling, hvor hver størrelse er repræsenteret som et punkt sammen med linjer for medianværdien og området.

f-hAFS-EV'er og p-hAFS-EV'er blev også analyseret ved Nanopartikel Tracking Analysis (NTA) for at vurdere partikler frigivet af 10 graders celler. hAFS-EV'er blev fortyndet 1:100 i PBS-opløsning og erhvervet på en NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, UK), der optog mindst 3 forskellige rammer på hver 60 s. Tre forskellige erhvervelser af hver prøve blev analyseret ved hjælp af Batch Process-indstillingen i softwaren. 4.7.LC-MS/MS Analyse af hAFS-CM og hAFS-EVs 4.7.1.In-Solution Fordøjelse

Proteomisk analyse blev udført på 3 biologiske replikater af hAFS-CM og hAFS. EV'er fra f-hAFS og p-hAFS efter normoxisk eller hypoxisk prækonditionering (n=24 forskellige tilstande). hAFS-CM og hAFS-EVs prøver blev suspenderet i 0.1M NHCO3 pH 7,9 og behandlet med RapigestIM SF-reagens (Waters Co, Milford, MA, USA) ved den endelige koncentration på 0,25 procent (vægt/volumen). De resulterende suspensioner blev inkuberet under omrøring ved 100 grad i 2{{40}} min. Fordøjelsen blev udført på hver prøve ved at tilsætte Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega Inc, Madison, WI, USA) ved et enzym/substrat-forhold på 1:50 (vægt/vægt) natten over ved 37 grader i 0,1 M NH4HCO3 pH 7,9 buffer med 10% CHSCN. En yderligere alikvot trypsin (1:100 vægt/vægt) blev tilsat om morgenen, og fordøjelsen fortsatte i 4 timer. Desuden stoppede tilsætningen af ​​0,5 procent trifluoreddikesyre (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) den enzymatiske reaktion, og en efterfølgende inkubation ved 37 grader i 45 minutter fuldendte RapiGest-syrehydrolysen[108]. De med vand ublandbare nedbrydningsprodukter blev fjernet ved centrifugering ved 13. 000 rpm i 10 min. Til sidst blev de tryptiske fordøjelsesblandinger afsaltet ved brug af PierceTM C-18-spinkolonner (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien) i henhold til producentens protokol og blev resuspenderet i 0,1 procent myresyre (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) i vand (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, USA) i en koncentration på 0,1 ug/μL.

4.7.2.Væskekromatografi

Trypsinfordøjede blandinger blev analyseret ved hjælp af en platform bestående af et nano-væskechromatografisk system, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, en del af AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, USA) konfigureret i trap-elueringstilstand, kombineret med et højopløseligt massespektrometer. Kort fortalt blev prøver (0,8 ug injiceret) først sat på en peptidfælde (200 um × 500 um ChromXP C18- CL, 3 um, 120 A) og vasket med ladepumpen kørende i isokratisk tilstand med 0,1 procent myresyre i vand i 10 minutter ved en strøm på 3 μL/min. Den automatiske omskiftning af en ti-ports ventil eluerede derefter den fangede blanding på en nano-omvendt fasesøjle (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um, 120 A) gennem en 150 min gradient af eluent B (eluent A, 0,1 procent myresyre i vand; eluent B, 0,1 procent myresyre i acetonitril) ved en strømningshastighed på 300 nL/min. I dybden var gradienten: fra 5-10 procent Bin 3min,10-40 procent Bin 130min,40-95 procent Bin 10 min. og holde på 95 procent B i 7min. 4.7.3.Massespektrometri

MS/MS-analyser blev udført på et LTQ-OrbitrapXL massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien) udstyret med en nanospray-ionkilde. Spraykapillærspændingen blev indstillet til 1,7 kV, og ionoverførselskapillartemperaturen blev holdt på 220 grader. Fuld MS-spektre blev registreret over et 400-1600 m/z-område i positiv ion-tilstand med en opløsningsevne på 60.000 (fuld bredde ved halvt maksimum) og en scanningshastighed på 2 spektre/s. Dette trin blev efterfulgt af fem lavopløselige MS/MS-hændelser, der blev sekventielt genereret på en dataafhængig måde på de fem øverste ioner udvalgt fra det fulde MS-spektrum (ved 35 procent kollisionsenergi), under anvendelse af den dynamiske udelukkelse på 0,5 min. MS/MS analyse. Massespektrometer scanningsfunktioner og højtydende væskekromatografi opløsningsmiddelgradienter blev kontrolleret af Xcalibur datasystem version 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien).

4.7.4.Proteomisk databehandling og datamining

Alle genererede data blev søgt ved hjælp af Sequest HT-søgemaskinen indeholdt i Thermo Scientific Proteome Discoverer-softwaren, version 2.1. De eksperimentelle MS/MS-spektre blev korreleret til tryptiske peptidsekvenser ved sammenligning med de teoretiske massespektre opnået ved in silico-fordøjelse af Uniprot Homo Sapiens-proteomdatabasen (74600-poster), downloadet den 2. januar 020 (www.uniprot.org, tilgået den 10 2. marts021). Følgende kriterier blev anvendt til identifikation af peptidsekvenser og relaterede proteiner: trypsin som et enzym, tre manglende spaltninger pr. peptid, massetolerancer på ±50 ppm for precursorioner og ±0,8 Da for-fragmentioner. Perkolatorknude blev brugt med en mål-lokkestrategi for at give en endelig falsk opdagelsesrate (FDR) ved Peptide Spectrum Match (PSM) niveau på 0,01 (streng) baseret på q-værdier, i betragtning af en maksimal deltaCN på 0,05 [109]. Kun peptider med en minimumspeptidlængde på seks aminosyrer og rang 1 blev overvejet. Proteingruppering og strenge sparsomhedsprincipper blev anvendt. MS-dataene er blevet deponeret til ProteomeXchange-konsortiet via PRIDE [10]partnerdepotet (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, adgang til den 10. marts 2021) De 48 proteiner opnået fra SEQUEST-algoritmen blev justeret, normaliseret , og etiketfri sammenlignet. En intern algoritme, nemlig Multidimensional Algorithm Protein Map (MAProMa) blev anvendt til dette formål, ved at bruge de gennemsnitlige peptidspektrummatches (aPSM) [111,112], der svarer til gennemsnittet af alle de spektre, der er identificeret for et protein, og som følge heraf , til dets relative overflod, i hver analyseret tilstand. For at udvælge differentielt udtrykte proteiner i dybden, blev undergrupper (for både føtal- vs perinatal-hAFS-CM og hAFS-EV'er, også i betragtning af hypoxisk celleprækonditioneringsstimulering), parvis sammenlignet ved at anvende en tærskel på 0,4 og 5 på de to MAProMa indekser henholdsvis DAve (Differential Average) og DCI (Differential Confidence Index). DAve, som evaluerer ændringer i proteinekspression, blev defineret som (XY)/(X＋Y)/0,5, mens DCI, som evaluerer tilliden til differentiel ekspression, blev defineret som (X plus Y)×(XY)/2 X og Y udtryk repræsenterer PSM af et givet protein i to sammenlignede prøver. Derudover blev de gennemsnitlige proteinlister, opnået fra hver undersøgt tilstand, udsat for lineær diskriminantanalyse (LDA), og proteiner med det største F-forhold (Større end eller lig med 4,5) og mindste p-værdi (mindre end eller lig med 0,001) blev bibeholdt og behandlet ved hierarkisk klyngedannelse ved anvendelse af Wards metode og den euklidiske afstandsmetrik ved hjælp af JMP 15.2-software. Specifikt repræsenterede F-forholdet modelmiddelkvadraten divideret med fejlmiddelkvadraten, hvorimod p-værdien indikerede sandsynligheden for at opnå en F-værdi, der var større end den beregnede, hvis der i virkeligheden ikke var nogen forskel mellem befolkningsgruppens middelværdier. 4.8. Cytokin- og kemokinprofilering af hAFS-CM og have-EV'er

Cytokin- og kemokinprofilering af hAFS-CM og have-EV'er opnået ved f-hAFS og p-hAFS efter hypoxisk prækonditionering blev vurderet ved hjælp af Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array-kittet (R&D System, Minneapolis, MN, USA) ifølge producentens instruktioner. Tyve ug af hAFS-CM- og hAFS-EVs-prøverne blev anvendt. Membranbilleder blev erhvervet af en Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, UK) Specifikt cytokin/kemokinindhold blev evalueret ved kvantificering af positiv pixelintensitet (ved hjælp af den vilkårlige enhed) for hver detekterbar cytokin ved hjælp af ImageJ-software (tilgængelig på https: //imagej.nih.gov/ij/, adgang til den 10. marts 2021 [13]). 4.9.RNA-ekstraktion fra hAFS-EV'er og Next

Generationssekvensering

RNA blev isoleret fra f-hAFS-EV'er og p-have-EV'er med miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milano, Italien) i henhold til producentens instruktioner. RNA-integritet og størrelsesfordeling blev evalueret ved hjælp af Agilent Small RNA Kit med den lille ikke-kodende RNA-chip for at vurdere indholdet af små RNA'er i området fra 6 til 150 nukleotider (nt). Qubit microRNA-analysekittet (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien) blev brugt til at kvantificere indholdet af mikroRNA (miRNA'er) efter producentens instruktioner. miRNA-sekventeringsbiblioteker blev forberedt og amplificeret ved hjælp af QIAseq miRNA Library-kittet (Qiagen, Milano, Italien) ved hjælp af 18,5 ng af isolerede miRNA'er som input og efter producentens instruktioner. Biblioteker blev samlet efter et kvalitetstjek, og kvantificering af TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, CA, USA) blev udført ved hjælp af Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Poolede biblioteker blev vurderet for kvalitetskontrol ved real-time qPCR efter "Sequencing Library qPCR Quantification" Guide (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) og sekventeret af Illumina NextSeq platform ved hjælp af High Output Hit v2.5 (75 cyklusser) ( Illumina Inc, San Diego, CA, USA). Basiskald blev udført med standard Illumina NextSeq500-arbejdsgangen.

4.10. Bioinformatisk dataanalyse af miRNA-sekventering

Fastq-filer blev først behandlet ved at trimme 3'-adapteren og baser af lav kvalitet af ved hjælp af Cutadapt [114]. Efter trimning blev insert-sekvenserne og UMI-sekvenserne identificeret. Læsninger uden adaptersekvens, læsninger med mindre end 16 bp insertsekvenser og læsninger med mindre end 10 bp UMI-sekvenser blev kasseret. For at kommentere indsættelsessekvenserne blev læsninger justeret til GRCh38 humant genomsamling ved hjælp af Bowtie [15] For hver prøve blev alle læsninger tildelt et bestemt miRNA talt, og de associerede UMI'er blev aggregeret for at tælle unikke molekyler. Sekundær analyse blev udført af brugerdefinerede R-scripts, der var tilgængelige efter rimelig anmodning. Differentialberigelsesanalyse blev udført ved brug af Limma [116] og EdgeR Bioconductor-pakker [117].

4.11. Statistiske analyser

Resultater præsenteres som gennemsnit ±sem af mindst tre(n{0}}) uafhængige eksperimenter. Sammenligninger blev tegnet ved envejs ANOVA efterfulgt af posthoc Tukeys multiple sammenligningstest eller ved Students t-test. Analyser blev udført ved hjælp af Graph-Pad Prism Version 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, tilgået den 10. marts 2021) med statistisk signifikans sat til* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Som konklusion blev føtal- og perinatal hAFS fundet fænotypisk ækvivalent med sammenlignelig sekretorisk styrke og EV-berigelse i størrelse og fordeling; dog kunne nogle forskelle i deres sekretomprofil værdsættes. Specifikt kan den udviklingsmæssigt umodne profil af føtal hAFS rekapituleres af deres sekretomformuleringer udstyret med et mere udtalt pro-vaskulogent, pro-regenerativt og foryngende sekretom. Imidlertid bevarer perinatal hAFS stadig en relevant parakrin profil via ekspression af faktorer relateret til endotelcellemigration, immunmodulerende, antiinflammatorisk og neurotrofisk potentiale svarende til føtal hAFS. Disse resultater kan give nyttige indsigter, der understøtter en fremtidig parakrin terapi af skaderelateret og inflammatorisk/iskæmisk-baseret sygdom. Derfor bør udvælgelsen af ​​enten føtal eller perinatal hAFS som den mest ideelle cellekilde evalueres under hensyntagen til det specifikke kliniske scenarie.

Denne artikel er uddraget fra Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms