Beskyttende virkninger af alfa-liponsyre mod 5-Fluorouracil-induceret gastrointestinal mucositis hos rotter, del 1

Abstrakt: Alfa-liponsyre (ALA) bruges i vid udstrækning i multivitaminformler og anti-aldringsprodukter. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de potentielle beskyttende fordele ved ALA på 5-fluorouracil (5-FU)-induceret gastrointestinal mucositis hos Wistar albinorotter. Væv fra maven, tyndtarmen og tyktarmen blev skåret ud, og blodsera blev opnået for at identificere biokemiske indekser såsom TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 og TIMP-1. En histopatologisk undersøgelse blev også udført. Resultaterne afslørede mucositis-forhøjede niveauer af TNF-, IL-1, MDA, MMP-1, -2, -8 og TIMP-1 i både væv og sera og disse værdier faldt dramatisk efter ALA-behandling. Reducerede SOD- og GPx-aktiviteter i mucositis-grupper blev vendt i ALA-behandlede grupper. Skaden produceret af slimhindebetændelse i maven og tyndtarmen faldt i den ALA-behandlede gruppe, ifølge histopatologisk evaluering. Følgelig kan implementeringen af ​​ALA-supplement i 5-FU-behandling fungere som en beskyttende intervention for cancerpatienter med gastrointestinal mucositis. I lyset af resultaterne kan ALA, en fødevareafledt antioxidant med pleiotrope egenskaber, være en effektiv behandling for 5-FU-induceret gastrointestinal mucositis og forhindre oxidativt stress, inflammation og vævsskade hos cancerpatienter, der modtager {{ 24}}FU-terapi.

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en robust fjernelsesevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på sædmembranens funktion. Cistanche-polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescerende mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH-frie radikaler og kan opfange reaktive oxygenarter, forhindre frie radikal-induceret kollagennedbrydning og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin fra frie radikaler.

Klik på Cistanche Tubulosa

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Introduktion

Alfa-liponsyre (ALA) er til stede i en lang række fødevarer, herunder grøntsager (spinat, broccoli, tomater) og kød (især indvolde), samt adskillige kosttilskud [1,2]. ALA har adskillige antioxidantvirkninger, herunder aktivering af endogene antioxidantmekanismer og chelering af metalioner såsom jern, zink og kobber [3,4]. Som et organosulfur-molekyle kan ALA opfange reaktive oxygenarter (ROS) og øge aktiviteten af ​​vævsantioxidantenzymer såsom glutathionperoxidase (GPx) og superoxiddismutase (SOD) [5-7]. På grund af dets antioxidantegenskaber har ALA vist sig at reducere ALA-afhængig celledød i lungekræft [8], brystkræft [9] og tyktarmskræft [10]. Desuden har tidligere forskning vist, at ALA har antiinflammatoriske egenskaber [11-16]. ALA arbejder på at reducere inflammation ved at modulere ekspressionen af ​​inflammatoriske cytokiner såsom tumornekrosefaktor-alfa (TNF-) og interleukin-1 (IL-1) [17,18]. De farmakologiske fordele ved ALA er blevet bevist inden for en lang række medicinske-relaterede områder, herunder kardiovaskulære, neurobeskyttende, kognitive og anti-aldringsmodeller [19].

Kræft er den førende årsag til dødelighed i alle lande og en væsentlig hindring for lang levetid [20]. Bivirkningerne af kemoterapeutisk medicin er en af ​​de vigtigste invaliderende faktorer i kampen mod kræft, og slimhindebetændelse er en af ​​de mest udbredte sygdomme, man støder på hos kræftpatienter [21]. Mucositis er en patologisk betændelsestilstand karakteriseret ved ulceration og betændelse i slimhinden i mave-tarmsystemet [22]. Mucositis øger brugen af ​​opioidanalgetika på grund af smerte og fremskynder overgangen til total parenteral ernæring på grund af ernæringsmæssige problemer [23]. Slimhindebetændelse og mucositis-relaterede vanskeligheder forringer patientens livskvalitet, mens udvikling af livstruende tilstande og negative reaktioner på terapi giver anledning til bekymring på grund af dårlig læsionsbehandling [24].

Det oftest anvendte kemoterapeutiske lægemiddel til maligniteter i mave-tarmkanalen er pyrimidinanalogen 5-fluorouracil (5-FU). 5-FU udøver sine anticancer-effekter ved at hæmme thymidylatsyntase (TS) og integrere dets metabolitter i RNA og DNA [25]. Imidlertid inducerer dette middel gastrointestinal mucositis, en alvorlig invaliderende bivirkning [26]. Især nedbrydningen af ​​oxidant-antioxidant-balancen, en stigning i pro-inflammatoriske cytokinniveauer og proteolytisk enzymaktivitet spiller en stor rolle i udviklingen af ​​disse negative virkninger. Selvom antioxidanter og antiinflammatoriske lægemidler er blevet brugt i et forsøg på at løse dette problem, er der endnu ikke identificeret en særlig robust terapeutisk metode [27,28].

Til dato har flere undersøgelser rapporteret brugen af ​​5-FU og ALA sammen i forskellige kræftformer; disse omfatter cervikale og kolorektale tumorer [29,30]. Ydermere vil hjælpemedicin, der kan inkorporeres i behandlingsprocedurer for at forhindre cancerpatienter fra de uønskede virkninger af mave-tarmslimhindebetændelse induceret af 5-FU, være fordelagtige. Formålet med denne undersøgelse var således at bestemme de biologiske virkninger af at bruge ALA i rotter med en mucositis-model skabt af 5-FU, udover at undersøge dets mulige anvendelse som et kandidatmiddel i behandlingsprotokoller.

2. Materialer og metoder

2.1. Dyr

Dyrene blev taget fra dyreforsøgsenhederne ved Near East University. Rotterne (Wistar albino, begge køn) blev holdt under en 12:12 timers mørke/lys-cyklus fra starten ved en stuetemperatur på 22 ± 2 ◦C i en fugtighedskontrolleret facilitet (50 ± 5 procent). Fodring var ad libitum uden nogen begrænsning til deres standard rottefoder og drikkevand. Rotter blev anbragt i et plexiglasbur (4 rotter pr. bur med dimensioner på 60 x 40 x 40 cm). Studieprotokollen blev godkendt af Near East University Local Animal Experiments Ethics Committee (godkendelse nr. 2019/01 den 17. januar 2019 og 2020/11 den 27. november 2020) og etiske retningslinjer nævnt i Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens senere ændringer blev fulgt.

32 Wistar Albino-rotter af begge køn, der vejede 200-250 g, blev fordelt i fire grupper med otte rotter hver (n=8): Kontrol-, ALA-, Mucositis- og Mucositis plus ALA-grupper. Kontrolgruppen modtog kun intraperitonealt (ip) saltvand (SF) en gang om dagen i en uge. ALA-gruppen modtog kun ALA i en dosis på 100 mg/kg ip én gang dagligt i en uge fra dag 1 [31,32]. Mucositis-gruppen blev behandlet med SF (ip) på dag 1 og 400 mg/kg 5-FU ip fra dag 2 til slutningen af ​​eksperimentet [33]. Mucositis plus ALA-gruppen modtog 100 mg/kg ip ALA på dag 1 og 400 mg/kg ip 5-FU på dag 2. Derefter blev 100 mg/kg/dag ip ALA-administration fortsat indtil slutningen af ​​eksperimentet . Dyrene blev overvåget i en uge, uden at der blev oplevet nogen dødelighed i det tidsrum. Dyrene i alle grupper blev aflivet ved slutningen af ​​forskningsperioden ved administration af en kombination af en ketamin/xylazin-overdosis. Laboratorieassays blev udført på det diagnostiske laboratorium og histopatologiske laboratorium på dyrehospitalet, Near East University.

2.2. Indsamling af blod- og vævsprøver

Blodprøver blev taget og sendt til laboratoriet i serumseparatorrør. Serumprøverne blev adskilt ved 2000 x g i 10 minutter og holdt ved -80 ◦C indtil videre analyse. For at eliminere ekstra blod blev mave-, tyndtarms- og tyktarmsvæv opsamlet og skyllet med fosfatbufferopløsning (pH=7.4). Derefter, efter at være blevet leveret til laboratoriet, gennemgik de en homogeniseringsprocedure. Vævshomogenisering blev udført i henhold til producentens protokol under anvendelse af RIPA-buffer (varenr. 10010263, batchnr. 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) og Dounce vævskværnesæt (D8938, lot. 3110, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) på is. Efter homogenisering blev prøver centrifugeret ved 1600 x g i 10 minutter ved plus 4 ◦C. Bradford-proteinbestemmelsesteknikken blev brugt til at kvantificere proteinniveauer i vævsprøver, og supernatanter blev derefter frosset ved -80 ◦C til efterfølgende undersøgelse.

2.3. Målinger af biokemiske indekser

Aktiviteter af alanintransaminase (ALT), aspartattransaminase (AST), alkalisk fosfatase (ALP), lactatdehydrogenase (LDH), lipase (LIP), amylase (AMY), kreatinin, blodurinstofnitrogen (BUN), totalt protein (TP) , og albuminniveauer blev målt som biokemiske indekser i serumprøver ved hjælp af en automatiseret BS-240 VET Clinical Chemistry Analyzer (Mindray, Shenzhen, Kina).

2.4. Måling af cytokiner i sera og væv

TNF- og IL-1-koncentrationer i sera og vævsprøver blev målt ved hjælp af kommercielt tilgængelige rottespecifikke enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) assaysæt (ELR-TNF- og ELR-IL1 -, RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA) efter producentens instruktioner.

2.5. Måling af matrixmetalloproteinaser (MMP'er) og vævsinhibitorer af metalloproteinase-1 (TIMP-1) i sera og væv

MMP'er og TIMP-1, som er involveret i en række biologiske processer, såsom cancer og inflammation, blev målt i både vævshomogenater og sera ved hjælp af producentens instruktioner og anbefalinger fra kommercielt tilgængelige rottespecifikke ELISA-assays (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Wuhan, Kina; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA). Serumkoncentrationer af MMP'erne og TIMP-1 blev udtrykt som pg/mL, mens vævsniveauer blev udtrykt som pg/mg protein.

2.6. Måling af malondialdehyd (MDA), GPx og SOD i væv

MDA-niveauer i væv blev evalueret under anvendelse af kommercielt tilgængelige assay-sæt for at bestemme lipidperoxidationstilstanden (TBARS Assay Kit, varenr. 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA). Måleprincippet er baseret på reaktionen med thiobarbitursyre (TBA) i kogende vand i 60 min i surt medium og måling af absorbansen af ​​reaktionsblandingen ved 532 nm (Ohkawa et al., 1979). En VersaMax Tunable Microplate Reader blev brugt til at måle absorbansen (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). MDA-koncentrationer i væv blev udtrykt som nmol MDA/mg protein.

I væv blev GPx- og SOD-aktivitet evalueret ved hjælp af klar-til-brug assay-sæt. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, UK) ved at bruge en automatiseret BS-240 VET Clinical Chemistry Analyzer (Mindray, Shenzhen, Kina). Mængderne af GPx og SOD i vævsprøverne (mave, tyndtarm og tyktarm) blev udtrykt som U/mg protein.

2.7. Histopatologisk vurdering

Vævene i maven, tyndtarmen og tyktarmen opnået umiddelbart efter forsøgsperioden blev fikseret i 10 procent (v/v) neutral formalin i 24 timer ved stuetemperatur. Efter fiksering blev vævene anbragt på en vævssporingsanordning, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland). Væv taget fra vævssporingsanordningen blev derefter indlejret i paraffin. Sektioner med 5- µm tykkelse blev skåret fra vævene ved hjælp af en mikrotom Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland), og rutinemæssig hæmatoxylin & eosin (HE) farvning blev udført. Sektioner blev undersøgt histomorfologiske med et Leica DM500 lysmikroskop koblet med Leica Microsystem Framework integreret digital billeddannelsesanalysesystem (Leica Application Suite version 3.0 Series 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Tyskland).

2.8. Statistiske analyser

GraphPad Prism-software blev brugt til statistisk analyse (version 7.04, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Dataene blev alle udtrykt som middel ± standardafvigelse (X ± SD). En variansanalyse (ANOVA) test blev brugt til at sammenligne datagrupper, efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest. Derudover blev Kruskal-Wallis-testen brugt til at sammenligne histomorfologiske resultater blandt grupper. En forskel på p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

3. Resultater

3.1. ALA påvirker biokemiske indekser positivt

Tabel 1 viser serumenzymaktivitet og metabolitkoncentrationer. Sammenlignet med kontrolgruppen havde mucositis-gruppen væsentligt højere niveauer af albumin, ALT, AST, ALP, LDH, amylase, lipase, BUN, kreatinin og TP (p < 0).05 –0.0001). Der var dog en signifikant forskel i albumin-, AST-, ALT-, ALP-, LDH-, BUN-, kreatinin-, amylase-, BUN- og kreatininniveauer mellem ALA plus Mucositis-gruppen og Mucositis-gruppen (p < 0,05-0,001). ALP-, ALT-, AST-, LDH- og amylaseniveauer var også væsentligt forskellige mellem mucositis- og ALA-grupperne (p < 0,05-0,0001). Følgelig blev niveauerne af leverenzymer, bugspytkirtelenzymer og metabolitter observeret at blive dramatisk reduceret i mucositis-gruppen, når ALA blev tilføjet til behandlingen.

3.2. ALA reducerer produktionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner

Niveauerne af pro-inflammatoriske cytokiner TNF- og IL-1 i serum-, mave-, tyndtarms- og tyktarmsprøver kan ses i figur 1. TNF- og IL-1-niveauerne i sera og alle væv fra dyr i mucositis-gruppen var signifikant højere sammenlignet med kontrol-, ALA- og mucositis plus ALA-grupper (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). TNF- og IL-1-niveauer i sera og alle væv reduceredes imidlertid signifikant i Mucositis plus ALA-gruppen sammenlignet med Mucositis-gruppen (p < 0.05-0,0001). Mellem kontrol- og mucositis plus ALA-grupperne var der en væsentlig forskel i niveauerne af TNF- i tyndtarmen og tyktarmen. (p < 0,01). Der var også signifikante forskelle i TNF-niveauer i tyktarmen og tyndtarmen mellem ALA- og Mucositis plus ALA-grupperne. (hhv. p < 0,01, p < 0,001). Endvidere var der statistisk signifikante forskelle mellem kontrol- og mucositis plus ALA-grupperne med hensyn til IL-1-niveauer i maven (p < 0,05). Derfor så ALA ud til signifikant at undertrykke niveauerne af pro-inflammatoriske cytokiner i mucositis.

3.3. ALA-behandling reducerer lipidperoxidation og øger aktiviteten af ​​antioxidantenzymer i væv

MDA-niveauer, GPx og SOD-aktiviteter blev kvantificeret for at vurdere peroxidation og antioxidantstatus på vævsniveau (figur 2). MDA-niveauer i mucositis-gruppens mave, tyndtarm og tyktarm var signifikant højere end i kontrol-, ALA- og mucositis plus ALA-grupperne (p < 0.05–0 .0001). Derudover var niveauerne af MDA i tyktarmen i Mucositis plus ALA-gruppen væsentligt forskellige fra niveauerne for kontrol- og ALA-grupperne (p < 0,0001).

Rotter i kontrol- og ALA-grupperne havde signifikant højere SOD-niveauer i alle væv end rotter i mucositis-gruppen (p < {{0}}.05–0.{{8 }}{{10}}01). SOD-niveauer i tyktarmsprøverne var signifikant forskellige i ALA- og Mucositis plus ALA-grupperne (p < 0,01). I maveprøverne var SOD-niveauerne signifikant lavere i ALA- og Mucositis plus ALA-grupperne (p < 0,05). Ydermere var SOD-niveauer i tyndtarmen hos rotter fra Mucositis-gruppen væsentligt lavere end SOD-niveauer i ALA-gruppen (p < 0,05). Imidlertid var SOD-niveauer i maven og tyktarmen hos dyr i Mucositis- og Mucositis plus ALA-grupperne væsentligt forskellige (p < 0,05-0,0001).

3.4. ALA-behandling øger niveauet af vævs-MMP'er og TIMP-1

MMP{{0}}-, MMP-2-, MMP-8- og TIMP-1-aktiviteter (tabel 2) i serum, mave, tyndtarm og tyktarm var signifikant højere i mucositis-gruppen sammenlignet med kontrol- og ALA-grupperne (p < 0.05–0.0001). Stigningen i MMP-1, MMP-2, MMP-8 og TIMP-1 niveauer i mucositis rotters sera og mave, tyndtarm og tyktarm blev signifikant undertrykt i Mucositis plus ALA-rotter (p < 0,05-0,0001), selvom der ikke var nogen signifikant forskel i serum MMP-8-niveauer mellem mucositis plus ALA- og mucositis-grupperne.