Promitotisk virkning af Oenothera Biennis på ældende menneskelige dermale fibroblaster, del 2

3. Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​et hydrofilt Oenothera biennis celleekstrakt (ObHEx) på cellulær senescens, da det viste hudens anti-aldringsegenskaber, når det blev testet i in vitro og ex vivo modeller [18]. Vi brugte en lignende senescent model af NHDF udsat for SIPS til behandling med H2O2 [21,22].

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en robust fjernelsesevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på sædmembranens funktion. Cistanche polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescent mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacoside i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH frie radikaler og evnen til at opfange reaktive oxygenarter og forhindre frie radikaler.

induceret kollagen nedbrydning, og har også en god reparationseffekt på thymin fri radikal anion skade.

Klik på Hvor kan jeg købe Cistanche

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

For at forstå virkningsmekanismen af ​​ObHEx på ældende humane dermale fibroblaster, ved afsløringen af ​​de biologiske veje, der er ændret af ekstraktet, udførte vi en data-uafhængig massespektrometri ultra-dyb proteomisk tilgang. Det gjorde det muligt for os at opnå den mest komplette proteomanalyse af senescensceller til dato og for første gang den samtidige kvantificering af adskillige senescensmarkører.

Først og fremmest, for at vurdere senescensinduktionen ved H2O2-behandling på NHFD-celler, kvantificerede vi de kendte senescensmarkører. Vores proteomiske data bekræftede ældningsinduktion ved oxidativt stress: vi observerede faktisk ændrede niveauer af allerede kendte ældningsmarkører relateret til det øgede lysosomale indhold (GLB1 og FUCA1), DNA-skade (ATR, ATM, MACROH2A1 og MACRO2A2) og G2 fase cellecyklus arrestation (CDK1NA og MKI67). Desuden peger pathway-berigelsesanalysen af ​​de mest nedregulerede proteiner i H2O2-behandlede versus kontrolceller på mitose, hvilket afspejler den senescerende spredningsstop.

Ved at sammenligne proteomet af SIPS NHDF-celler behandlet med ObHEx versus ubehandlede, fandt vi, at behandlingen med ekstraktet var i stand til delvist at genoprette niveauerne af proteiner og komplekser, der spiller afgørende roller i flere stadier af mitose. ObHEx-inkubation øgede niveauerne af CDK1, et mitotisk nøgleprotein, der udløser indtræden i mitose ved at danne et kompleks med cyclin B [34]. Desuden var alle fem underenheder af kondensin I-komplekset opreguleret. Dette kompleks er sammensat af to strukturel vedligeholdelse af kromosomer (SMC) underenheder, SMC2 og SMC4, og tre ikke-SMC underenheder, NCAPD2, NCAPH og NCAPG. I prometafasen er funktionen af ​​kondensin I-komplekset at fremme typen af ​​kondensation af kromosomer ved at indføre positive supercoils i DNA'et på en ATP-afhængig måde [35]. Udover dette opregulerede ekstraktet KNTC1, NUF2 og TRIP13, som er tre proteiner forbundet med kinetochore, et stort kompleks, der under prometafasen forbinder centromerisk kromatin til mikrotubuli fra modsatte spindelpoler for at favorisere segregeringen af ​​søsterkromatider [ 36,37]. Delvis genopretning af niveauerne af MCM-proteiner er også blevet påvist. Disse proteiner er kernen i replikationshelicasekomplekset, der afvikler dobbeltstrenget DNA for at tilvejebringe enkeltstrenge som skabeloner for DNA-polymerase. MCM-komplekset omdannes til en aktiv helicase under S-fasen, men er allerede indlæst på kromatin under telofasen [38,39]. Ekstraktet øgede også niveauerne af IQGAP3, PBK og DHFR. Den første, IQGAP3, er en vigtig regulator af mitotisk progression, fordi den fremmer cdk7-aktivitet, der er afgørende for Cdc2-aktivering [40,41]; PBK er en kinase, der kun er aktiv i mitose; når det phosphoryleres, interagerer det med p53, destabiliserer det og dæmper DNA-skadevejen [42]; og DHFR er et nøgleenzym i DNA-biosyntese, hvis niveauer er markant svækket i senescent humane fibroblaster [43].

Bio-ortogonale assays viste også ObHEx' evne til delvist at vende tilbage til alderdomskendetegn, nemlig lysosomal aktivitet og cellecyklusstop. For at verificere, om gendannelsen af ​​mitotisk proteinekspression ved ObHEx oversættes til reaktivering af cellecyklussen, udførte vi FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) eksperimenter på SIPS NHDF-celler behandlet eller ej med ekstraktet. De viste, at ObHEx var i stand til at reducere andelen af ​​celler, der var blokeret i G2-fasen og at fremme deres genindtræden i cellecyklussen af ​​senescerende celler.

4. Materialer og metoder

4.1. Cellekultur

Normale humane dermale fibroblaster (NHDF; Promocell) blev dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS; Gibco) og 500 U/ml penicillin-streptomycin (Gibco) i 95 procent luft , 5 procent CO2 og en befugtet atmosfære ved 37 ◦C.

4.2. Induktion af stress-induceret for tidlig ældning (SIPS)

I alt 10 1200 000 NHDF-celler blev podet i hver af 60 mm cellekulturskålene, en dag før deres inkubation med 100 µM H2O2 ved 37 ◦C i 2 timer [21,22]. Efterfølgende blev H2O2 vasket med Phosphate Buffered Saline (PBS; Gibco) for at afslutte behandlingen, og cellerne blev dyrket i et normalt medium i 4 dage. For de ikke-ældende celler, anvendt som kontrol, blev 2240 000 NHDF-celler podet i hver af 60 mm cellekulturskålene. Forsøget blev udført i 5 biologiske replikater.

4.3. Oenothera Biennis hydrofilt ekstrakt (ObHEx) præparation

Ekstraktet blev fremstillet i laboratorierne hos Arterra Bioscience SpA [18]. Cellekulturerne blev opnået fra bladene af Oenothera biennis-planter (leveret af GEEL Floricultura ss) ved at inducere proliferationen af ​​meristematiske celler på faste agarplader indtil den opnåede hård hud. Cellerne blev overført til det flydende vækstmedium (Gamborg B5, suppleret med 2,4 dichlorphenoxyeddikesyre (1 mg/L), adenin (1 mg/L) og kinetin (0,01 mg/L) )) og dyrket som suspensionskulturer under orbital rystning. Når kulturer på ca. 150 g/l var opnået, blev cellerne opsamlet og lyseret i PBS ved pH 7,4 for at fremstille et vandopløseligt ekstrakt. Efter lyofilisering blev det opnåede pulver opløst i vand eller cellekulturmedier ved de passende koncentrationer til testning.

4.4. Oenothera Biennis Hydrophilic Extract (ObHEx) Behandling

NHDF-celler blev inkuberet i 24 timer med 0.01 procent (p/v) ObHEx i et komplet medium. Efterfølgende blev cellerne vasket tre gange med PBS og behandlet i yderligere 24 timer med 0,01 procent (p/v) ObHEx i et serumfrit medium. De blev derefter løsnet ved trypsinisering, centrifugeret ved 500 g i 10 minutter ved 4 ◦C og vasket to gange med PBS. Ubehandlede kontrolceller gennemgik de samme inkubationer uden ObHEx.

4.5. Prøveforberedelse til proteomisk analyse

Pellets blev resuspenderet i 60µL Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer og lyseret ved sonikering. Den cellulære lysaters proteinkoncentration blev kvantificeret under anvendelse af et DC™ Protein Assay Kit (Biorad; #5000112). S-TrapTM mikrospinsøjle (Protifi, Huntington, CA, USA) fordøjelse blev udført på 50 µg cellelysater i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev prøverne reduceret med 20 mM tris(2- carboxyethyl)phosphin (TCEP) og alkyleret med 50 mM thioacetamid (CAA) i 15 minutter ved stuetemperatur. Vandig phosphorsyre blev derefter tilsat til en slutkoncentration på 2,5 procent efterfulgt af tilsætning af en S-Trap-bindingsbuffer (90 procent vandig methanol, 100 mM TEAB, pH 7,1). Blandingerne blev derefter fyldt på S-Trap-søjler. Fem ekstra vasketrin blev udført for grundig SDS-eliminering. Derefter blev de cellulære lysater fordøjet med 2,5 µg trypsin (Promega) ved 47 ◦C i 1 time. Efter eluering blev peptiderne vakuumtørret, resuspenderet i 2 procent ACN, 0,1 procent FA og kvantificeret med Nanodrop.

4.6. nanoLC-MS/MS proteinidentifikation og kvantificering

I alt 400 ng af hver prøve blev injiceret på et nanoplade (Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland) højtydende væskekromatografi (HPLC) system koblet til et timsTOF Pro (Bruker Daltonics, Bremen) , Tyskland) massespektrometer. HPLC-separation (opløsningsmiddel A: {{30}},1 procent myresyre i vand; opløsningsmiddel B: 0,1 procent myresyre i acetonitril) blev udført ved 250 l/min under anvendelse af en pakket emittersøjle (C18, 25 cm × 75 µm 1,6 µm) (Ion Optics, Fitzroy, Australien) ved brug af gradienteluering (2 til 13 procent opløsningsmiddel B i løbet af 41 minutter; 13 til 20 procent i løbet af 23 minutter; 20 procent til 30 procent i løbet af 5 minutter; 30 procent til 85 procent i 5 minutter og endelig 85 procent i 5 minutter for at vaske søjlen). Massespektrometriske data blev erhvervet ved hjælp af den data-uafhængige analyse parallel akkumulering seriel fragmentering (diaPASEF) erhvervelse metode. Bleindstillingerne var: masseområde fra 400 til 1200 Da, mobilitetsintervaller fra 0,60 til 1.43 1/k0, antal mobilitetsvindue på 1, cyklustidsestimat på 1,79 s, massetrin pr. cyklus på 32.

4.7. MS databehandling og bioinformatik analyse

Dataanalyse blev udført ved hjælp af DIA-NN-software (version 1.8) [44]. En søgning mod den menneskelige UniProtKB/Swiss-Prot Homo sapiens-database (udgivelse februar 2021, 20.408 poster) blev udført ved hjælp af en biblioteksfri arbejdsgang. Til dette formål blev mulighederne "FASTA digest for biblioteksfri søgning/biblioteksgenerering" og "Deep learning spectra, RTs og IMs forudsigelse" kontrolleret for precursoriongenerering. Et maksimum på 2 trypsin manglende spaltninger blev tilladt, og den maksimale variable modifikation blev sat til 5. Carbamidomethylering (Cys) blev sat som den faste modifikation, hvorimod protein N-terminal methionin-udskæring, methioninoxidation og N-terminal acetylering blev indstillet som variabel ændringer. Peptidlængdeområdet blev indstillet til 7-30 aminosyrer, precursorladningsområde 2-4, precursor m/z-område 300-1800 og fragmention m/z-område 200-1800. For at søge i forældremassen og fragmentioner blev nøjagtigheden automatisk udledt af DIA-NN og blev sat omkring 13 ppm for hver analyse. De falske opdagelsesrater (FDR'er) ved protein- og peptidniveauer blev sat til 1 procent. Match mellem løbene var tilladt. Til kvantificeringsstrategien blev Robust LC (høj præcision) brugt som anbefalet i softwaredokumentationen, mens standardindstillingerne blev bevaret for de andre algoritmeparametre.

Statistisk og bioinformatisk analyse blev udført med Perseus-software (version 1.6.15) frit tilgængelig på webstedet (tilgået den 22. juni 2021) [45] og R/R Studio og RStudio version 20 21.09.1 30 (tilgået den 12. november 2021). Al statistisk R-analyse blev udført ved hjælp af R-statistik-pakken. Pg-rapportmatrixoutputtet af DIA-NN blev brugt, og intensiteter blev log2 transformeret til statistisk analyse. Til den statistiske sammenligning satte vi fire grupper, der hver indeholder 5 biologiske replikater. Vi filtrerede derefter dataene for kun at beholde proteiner med mindst 3 gyldige værdier i mindst én gruppe. Dernæst blev dataene beregnet til at udfylde manglende datapunkter ved at skabe en Gauss-fordeling af tilfældige tal med en standardafvigelse på 33 procent i forhold til standardafvigelsen af ​​de målte værdier og en 1,8 standardafvigelse nedskiftning af middelværdien for at simulere fordelingen af ​​lave værdier. signalværdier. Elevens t-test blev udført mellem SEN og CTRL FDR < 0,05, S0=0.1 for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​markører, der er specifikke for senescens. For derefter at undersøge, om forskellen i effektstørrelsen mellem fravær eller tilstedeværelse af behandlingen er den samme for celler, hvor ældning blev induceret eller ej, blev interaktionen mellem begge faktorer (dvs. induktion og behandling) undersøgt ved hjælp af tovejs ANOVA i R. Derefter blev p-værdier opnået for interaktionen af ​​begge faktorer justeret til multiple test ved hjælp af Benjamini-Hochberg [46] metoden til at kontrollere False Discovery Rate (FDR). Endelig blev Tukey HSD post hoc-analyse udført på proteiner, der viste en q-værdi < 0,05. Massespektrometri proteomics data er blevet deponeret til ProteomeXchange Consortium via PRIDE [47] partner repository med datasættet identifikator PXD034222.

4.8. Ældre-associeret ß-galactosidase-farvning

Ældringsassocieret ß-galactosidase (SA-ß-gal) aktivitet blev evalueret ved hjælp af et Cell Signaling Technology farvningskit (#9860). I alt 1250 000 NHDF-celler/brønd blev podet i en 6-brøndplade én dag før SIPS; hvorimod, som en kontrol, 250 000 celler/brønd. Efter 4 dage i et normalt medium blev cellerne inkuberet eller ej med 0.01 procent (p/v) ObHEx i 48 timer. Efterfølgende blev de vasket med PBS og behandlet med fikseringsopløsningen i 15 min. Efter to vaske med PBS blev cellerne inkuberet med ß-gal-farvningsopløsningen (endelig pH på 6,0) indeholdende 5-brom-4-chlor-3-indolyl- -D-galacto -pyranosid (X-Gal) ved 37 ◦C i en tør inkubator i 20 timer. Positive celler er blå. Farven skyldes spaltningen af ​​X-Gal i galactose og 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl (X) af SA-ß-gal. Indoxylen oxideres til 5,50 -dibrom-4,40 -dichlorindigo, der danner et intenst blåt bundfald. Procentdelen af ​​positive celler i det samlede antal celler blev vurderet ved at tælle 100-150 celler i 5 tilfældigt udvalgte billeder optaget af mikroskopet, for hver tilstand. Celler blev talt ved hjælp af ImageJ-software. Forsøget blev udført i tre eksemplarer.

4.9. Fluorescens-aktiveret cellesorteringsanalyse

I alt {{0}} NHDF-celler/brønd blev podet i en 6-brøndsplade en dag før SIPS; hvorimod, som en kontrol, 50 000 celler/brønd. Efter 4 dage i et normalt medium blev kontrol- og senescentcellerne behandlet eller ej med 0,01 procent (p/v) ObHEx i 72 timer. Derefter blev cellerne inkuberet i nærvær af 5 µg/ml Hoechst 33342 i 30 minutter ved 37 ◦C. Efter trypsinisering og centrifugering ved 500 g i 2 minutter blev de resuspenderet i 200 µL PBS. Endelig blev cellefluorescens målt med en BD LSRFortessa Cell Analyzer. Data blev analyseret ved hjælp af FlowJo software v10.8.1. Forsøget blev udført i tre eksemplarer.

5. Konklusioner

Den dybe senescens-associerede globale proteomprofilering opnået her giver hundredvis af proteiner dereguleret af SIPS, som kan udnyttes af det videnskabelige samfund til yderligere at forstå alderdom og til at evaluere virkningerne af nye potentielle modulatorer. Desuden beviser vores arbejde en pro-mitotisk virkningsmekanisme af ObHEx på senescerende humane dermale fibroblaster: via en stigning i mitotisk proteinekspression fremmer det genoprettelsen af ​​proliferationen af ​​senescerende celler. Baseret på disse resultater foreslår vi derfor ObHEx som en kraftig adjuvans mod ældning forbundet med hudens aldring.

Forfatterbidrag:Konceptualisering, SC, MCM og ICG; metodologi, SC, KR, IM, CC (Cerina Chhuon) og ICG; software, KR; undersøgelse, SC, IM, CC (Cerina Chhuon), KT, SF, ADL, IP og CC (Corinne Cordier); ressourcer, MCM og ICG; skrivning - originalt udkast til forberedelse, SC og ICG; skrivning – gennemgang og redigering, SC, MCM og ICG Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Erklæring om datatilgængelighed:Massespektrometri proteomics data er blevet deponeret til ProteomeXchange Consortium via PRIDE [47] partner repository med datasættet identifikator PXD034222 (Reviewer konto detaljer: Brugernavn: reviewer_pxd034222@ebi.ac.uk; Adgangskode: fK9Pjv90) .

Anerkendelser: Denne undersøgelse blev støttet af Programma Operativo Complementare Ricerca e Innovazione 2014–2020, Asse I "Capitale Umano", Azione I.1 "Dottorati Innovativi con caratterizzazione Industriale". Vi takker de andre medlemmer af Proteomics-platformen Necker Vincent Jung og Joanna Lipecka for deres uvurderlige videnskabelige støtte og frugtbare forslag.

Referencer

1. Di Micco, R.; Krizhanovsky, V.; Baker, D.; d'Adda di Fagagna, F. Cellulær alderdom i aldring: Fra mekanismer til terapeutiske muligheder. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2021, 22, 75-95. [CrossRef] [PubMed]

2. González-Gualda, E.; Baker, AG; Fruk, L.; Muñoz-Espín, D. En guide til vurdering af cellulær alderdom in vitro og in vivo. FEBS J. 2021, 288, 56-80. [CrossRef] [PubMed]

3. Sikora, E.; Bielak- ˙Zmijewska, A.; Mosieniak, G. Hvad er og hvad er ikke celleældning. Postepy Biochem. 2018, 64, 110-118. [CrossRef] [PubMed]

4. Choi, E.-J.; Kil, IS; Cho, E.-G. Ekstracellulære vesikler afledt af ældre fibroblaster dæmper den dermale effekt på keratinocytdifferentiering. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1022. [CrossRef] [PubMed]

5. Krtolica, A.; Parrinello, S.; Lockett, S.; Desprez, PY; Campisi, J. Senescent fibroblaster fremmer epitelcellevækst og tumorigenese: en forbindelse mellem kræft og aldring. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 12072-12077. [CrossRef]

6. Wlaschek, M.; Maity, P.; Makrantonaki, E.; Scharfetter-Kochanek, K. Bindevæv og fibroblastældning i hudens aldring. J. Invest. Dermatol. 2021, 141, 985-992. [CrossRef]

7. Paez-Ribes, M.; González-Gualda, E.; Doherty, GJ; Muñoz-Espín, D. Målretning mod ældre celler i translationel medicin. EMBO Mol. Med. 2019, 11, e10234. [CrossRef]

8. Soto-Gamez, A.; Demaria, M. Terapeutiske indgreb for aldring: Tilfældet med cellulær alderdom. Drug Discov. I dag 2017, 22, 786–795. [CrossRef]

9. Latorre, E.; Birar, VC; Sheerin, AN; Jeynes, JCC; Hooper, A.; Dawe, HR; Melzer, D.; Cox, LS; Faragher, RGA; Ostler, EL; et al. Småmolekylemodulering af splejsningsfaktorekspression er forbundet med redning fra cellulær alderdom. BMC Cell Biol. 2017, 18., 31. [CrossRef]

10. Munir, R.; Semmar, N.; Farman, M.; Ahmad, NS En opdateret gennemgang af farmakologiske aktiviteter og fytokemiske bestanddele af natlys (slægten Oenothera). Asiatisk Pac. J. Trop. Biomed. 2017, 7, 1046-1054. [CrossRef]

11. Timoszuk, M.; Bielawska, K.; Skrzydlewska, E. Primrose (Oenothera biennis) Biologisk aktivitet afhængig af kemisk sammensætning. Antioxidanter 2018, 7, 108. [CrossRef]

12. Lee, SY; Kim, CH; Hwang, BS; Choi, K.-M.; Yang, I.-J.; Kim, G.-Y.; Choi, YH; Park, C.; Jeong, J.-W. Beskyttende virkninger af Oenothera Biennis mod hydrogenperoxid-induceret oxidativ stress og celledød i hudkeratinocytter. Life 2020, 10, 255. [CrossRef]

13. Granica, S.; Czerwi´nska, ME; Piwowarski, JP; Ziaja, M.; Kiss, AK Kemisk sammensætning, antioxidativ og anti-inflammatorisk aktivitet af ekstrakter fremstillet fra luftdele af Oenothera Biennis L. og Oenothera Paradoxa Hudziok opnået efter frødyrkning. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 801-810. [CrossRef]

14. Fecker, R.; Buda, V.; Alexa, E.; Avram, S.; Pavel, IZ; Muntean, D.; Cocan, I.; Watz, C.; Minda, D.; Dehelean, CA; et al. Fytokemisk og biologisk screening af Oenothera Biennis L. Hydroalkoholisk ekstrakt. Biomolecules 2020, 10, 818. [CrossRef]

15. Schäfer, L.; Kragballe, K. Supplement med natlysolie ved atopisk dermatitis: Effekt på fedtsyrer i neutrofiler og epidermis. Lipids 1991, 26, 557-560. [CrossRef]

16. Barbulova, A.; Apone, F.; Colucci, G. Plantecellekulturer som kilde til kosmetiske aktive ingredienser. Kosmetik 2014, 1, 94–104. [CrossRef]

17. Cæsar, LK; Cech, NB Synergi og antagonisme i naturlige produktekstrakter: Når 1 plus 1 ikke er lig med 2. Nat. Prod. Rep. 2019, 36, 869–888. [CrossRef]

18. Ceccacci, S.; De Lucia, A.; Tito, A.; Tortora, A.; Falanga, D.; Arciello, S.; Ausanio, G.; Di Cicco, C.; Monti, MC; Apone, F. An Oenothera Biennis cellekulturekstrakt udstyret med hud anti-aldringsaktivitet forbedrer cellemekaniske egenskaber. Metabolitter 2021, 11, 527. [CrossRef]

19. Farwick, M.; Köhler, T.; Schild, J.; Mentel, M.; Maczkiewitz, U.; Pagani, V.; Bonfigli, A.; Rigano, L.; Bureik, D.; Gauglitz, GG Pentacykliske triterpener fra Terminalia Arjuna viser flere fordele på ældet og tør hud. Skin Pharmacol. Physiol. 2014, 27, 71-81. [CrossRef]

20. Bonte, F.; Dumas, M.; Chaudagne, C.; Meybeck, A. Indflydelsen af ​​Asiatic Acid, Madecassic Acid og Asiaticoside på Human Collagen I Synthesis. Planta Med. 1994, 60, 133-135. [CrossRef]

21. Chowdhary, S. Virkningerne af oxidativ stress på at inducere ældning i humane fibroblaster. J. South Carol. Acad. Sci. 2018, 16, 2.

22. Wang, Z.; Wei, D.; Xiao, H. Metoder til cellulær alderdomsinduktion ved hjælp af oxidativ stress. Metoder Mol. Biol. 2013, 1048, 135-144. [PubMed]

23. Hildebrand, DG; Lehle, S.; Borst, A.; Haferkamp, ​​S.; Essmann, F.; Schulze-Osthoff, K. - Fucosidase som en ny bekvem biomarkør for cellulær alderdom. Cellecyklus 2013, 12, 1922-1927. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, BY; Han, JA; jeg, JS; Morrone, A.; Johung, K.; Goodwin, EC; Kleijer, WJ; DiMaio, D.; Hwang, ES Alderdomsassocieret beta-galactosidase er lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell 2006, 5, 187-195. [CrossRef] [PubMed]

25. Gorgoulis, V.; Adams, PD; Alimonti, A.; Bennett, DC; Bischof, O.; Biskop, C.; Campisi, J.; Collado, M.; Evangelou, K.; Ferbeyre, G.; et al. Cellulær alderdom: Definition af en vej frem. Celle 2019, 179, 813-827. [CrossRef]

26. Matsuoka, S.; Ballif, BA; Smogorzewska, A.; McDonald, ER; Hurov, KE; Luo, J.; Bakalarski, CE; Zhao, Z.; Solimini, N.; Lerenthal, Y.; et al. ATM- og ATR-substratanalyse afslører omfattende proteinnetværk, der reagerer på DNA-skade. Science 2007, 316, 1160-1166. [CrossRef]

27. Zhang, R.; Chen, W.; Adams, PD Molekylær dissektion af dannelse af alderdomsassocierede heterochromatinfoci. Mol. Cell Biol. 2007, 27, 2343-2358. [CrossRef]

28. LaBaer, ​​J.; Garrett, MD; Stevenson, LF; Slingerland, JM; Sandhu, C.; Chou, HS; Fattaey, A.; Harlow, E. Nye funktionelle aktiviteter for P21-familien af ​​CDK-hæmmere. Genes Dev. 1997, 11, 847–862. [CrossRef]

29. Scholzen, T.; Gerdes, J. Ki-67-proteinet: Fra det kendte og det ukendte. J. Cell Physiol. 2000, 182, 311-322. [CrossRef]

30. Passos, JF; von Zglinicki, T. Metoder til cellesortering af unge og ældre celler. Metoder Mol. Biol. 2007, 371, 33-44.

31. Dai, Y.; Tang, H.; Pang, S. Fosfolipiders afgørende roller i aldring og regulering af levetid. Foran. Physiol. 2021, 12, 1998. [CrossRef]

32. Dashty, M. Hedgehog Signaling Pathway er forbundet med aldersrelaterede sygdomme. J. Diabetes Metab. 2014, 5, 2. [CrossRef]

33. Wang, D.; Lu, P.; Liu, Y.; Chen, L.; Zhang, R.; Sui, W.; Dumitru, AG; Chen, X.; Wen, F.; Ouyang, H.-W.; et al. Isolering af levende præmature ældningsceller ved hjælp af FUCCI-teknologi. Sci. Rep. 2016, 6, 30705. [CrossRef]

34. Qian, J.; Beullens, M.; Huang, J.; De Munter, S.; Lesage, B.; Bollen, M. Cdk1 bestiller mitotiske hændelser gennem koordinering af en kromosom-associeret fosfatase-switch. Nat. Commun. 2015, 6, 10215. [CrossRef]

35. Kong, M.; Cutts, EE; Pan, D.; Beuron, F.; Kaliyappan, T.; Xue, C.; Morris, EP; Musacchio, A.; Vannini, A.; Greene, EC Human Condensin I og II driver omfattende ATP-afhængig komprimering af nukleosombundet DNA. Mol. Celle 2020, 79, 99-114.e9. [CrossRef]

36. Kops, GJPL; Gassmann, R. Crowning the Kinetochore: Den fibrøse corona i kromosomadskillelse. Trends Cell Biol. 2020, 30, 653-667. [CrossRef]

37. Ma, HT; Poon, RYC TRIP13 Fungerer i etableringen af ​​spindelsamlingskontrolpunktet ved at genopfylde O-MAD2. Cell Rep. 2018, 22, 1439-1450. [CrossRef]

38. Kuipers, MA; Stasevich, TJ; Sasaki, T.; Wilson, KA; Hazelwood, KL; McNally, JG; Davidson, MW; Gilbert, DM Meget stabil påfyldning af Mcm-proteiner på kromatin i levende celler kræver replikation for at losse. J. Cell Biol. 2011, 192, 29-41. [CrossRef]

39. Meng, Q.; Gao, J.; Zhu, H.; Han, H.; Lu, Z.; Hong, M.; Zhou, H. Den proteomiske undersøgelse af serielt passerede humane hudfibroblastceller afslører nedregulering af kromosomkondensinkomplekse proteiner involveret i replikativ ældning. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2018, 505, 1112-1120. [CrossRef]

40. Larochelle, S.; Pandur, J.; Fisher, RP; Salz, HK; Suter, B. Cdk7 er afgørende for mitose og for in vivo Cdk-aktiverende kinaseaktivitet. Genes Dev. 1998, 12, 370-381. [CrossRef]

41. Leone, M.; Cazorla-Vázquez, S.; Ferrazzi, F.; Wiederstein, JL; Gründl, M.; Weinstock, G.; Vergarajauregui, S.; Eckstein, M.; Krüger, M.; Gaubatz, S.; et al. IQGAP3, et YAP-mål, er påkrævet for korrekt cellecyklusprogression og genomstabilitet. Mol. Cancer Res. 2021, 19, 1712-1726. [CrossRef] [PubMed]

42. Nandi, AK; Ford, T.; Fleksher, D.; Neuman, B.; Rapoport, AP Attenuation of DNA Damage Checkpoint af PBK, en ny mitotisk kinase, involverer protein-protein-interaktion med Tumor Suppressor P53. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2007, 358, 181-188. [CrossRef] [PubMed]

43. Godt, L.; Dimri, GP; Campisi, J.; Chen, KY Regulering af dihydrofolatreduktasegenekspression og E2F-komponenter i humane diploide fibroblaster under vækst og alderdom. J. Cell Physiol. 1996, 168, 580-588. [CrossRef]

44. Demichev, V.; Messner, CB; Vernardis, SI; Lilley, KS; Ralser, M. DIA-NN: Neurale netværk og interferenskorrektion muliggør dyb proteomdækning i høj kapacitet. Nat. Metoder 2020, 17, 41-44. [CrossRef]

45. Tyanova, S.; Temu, T.; Sinitcyn, P.; Carlson, A.; Hein, MIN; Geiger, T.; Mann, M.; Cox, J. Perseus beregningsplatform for omfattende analyse af (Prote)Omics-data. Nat. Metoder 2016, 13, 731-740. [CrossRef]

46. ​​Benjamini, Y.; Hochberg, Y. Kontrol af den falske opdagelsesrate: En praktisk og kraftfuld tilgang til flere tests. JR Stat. Soc. Ser. B (Metodol.) 1995, 57, 289-300. [CrossRef]

47. Perez-Riverol, Y.; Bai, J.; Bandla, C.; García-Seisdedos, D.; Hewapathirana, S.; Kamatchinathan, S.; Kundu, DJ; Prakash, A.; Frericks-Zipper, A.; Eisenacher, M.; et al. PRIDE-databaseressourcerne i 2022: Et knudepunkt for massespektrometri-baserede proteomiske beviser. Nucleic Acids Res. 2021, 50, D543–D552. [CrossRef]

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】