Prædiktiv betydning af nyremyeloid-relateret protein 8-ekspression hos patienter med fedme- eller type 2-diabetes-associerede nyresygdomme

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Takashige Kuwabara¹, Kiyoshi Mori1,^2*, Masato Kasahara^1,3, Hideki Yokoi¹, Hirotaka Imamaki¹, Akira Ishii¹, Kenichi Koga¹, Akira Sugawara⁴, Shinji Yasuno³, Kenji Ueshima³, Takashi Morikawa⁵, Yoshio Konishi⁵, Masahito Imanishi⁵, Akira Nishiyama⁶, Kazuwa Nakao^1,2, Masashi Mukoyama¹

¹Institut for Medicin og Klinisk Videnskab, Kyoto University Graduate School of Medicine, Kyoto, Japan,

²Medical Innovation Center, Kyoto University Graduate School of Medicine, Kyoto, Japan,

³Institut for EBM-forskning, Institut for Fremskridt inden for Klinisk og Translationel Videnskab, Kyoto Universitetshospital, Kyoto, Japan,

⁴Nefrologisk afdeling, Osaka Røde Kors Hospital, Osaka, Japan,

5 afdeling for nefrologi og hypertension, Osaka City General Hospital, Osaka, Japan,

6 Department of Pharmacology, Kagawa University Medical School, Kagawa, Japan

Abstrakt

Baggrund og formål: Vi har rapporteret, at toll-lignende receptor 4 (TLR4) og en af ​​dens endogene ligander, myeloid-relateret protein 8 (MRP8 eller S100A8), spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​diabetisk nefropati hos mus. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere betydningen afnyreMRP8-ekspression hos patienter medfedme- eller type 2 diabetes-associeretnyresygdomme. Metoder: Hos diabetikere, overvægtige eller kontrolpersoner blev MRP8-mRNA- og proteinekspressionsniveauer i nyrebiopsiprøver bestemt ved realtids-RT-PCR og immunhistokemi (henholdsvis n=28 og 65) og deres associationer med baseline og prognostiske parametre blev analyseret. Virkninger af MRP8 på pro-inflammatoriske genekspressioner blev undersøgt ved hjælp af makrofager. Resultater:NyreMRP8-gen- og proteinekspressionsniveauer var forhøjet i overvægtige eller diabetiske grupper sammenlignet med kontrolgruppen. Blandt alle forsøgspersoner, ved univariat lineær regressionsanalyse, var glomerulært MRP8-positivt celletal og tubulointerstitiel MRP8-positivt areal ved baseline begge henholdsvis korreleret ikke kun med forskellige kendte risikofaktorer for diabetisk nefropati (f.eks. som systolisk blodtryk, proteinuri og serumkreatinin), men også med omfanget af glomerulosklerose og tubulointerstitiel fibrose. Uafhængige faktorer, der forudsiger urinproteinniveauer et år senere, blev undersøgt ved multivariat analyse, og de inkluderede glomerulær MRP8-positivt celletal (b=0.59, P,0.001), proteinuri (b=0.37, P=0.002) og systolisk blodtryk (b=0.21, P=0.04) ved baseline, efter justering for kendt risiko faktorer. MRP8-proteinekspression blev observeret i CD68-positive makrofager og atrofiske tubuli. I dyrkede musemakrofager udløste MRP8-protein-inducerede proinflammatoriske cytokinekspressioner også auto-induktion af MRP8 på en TLR-4-afhængig måde.

Konklusioner: Glomerulær MRP8-ekspression ser ud til at være forbundet med progression af proteinuri hos overvægtige eller type 2-diabetespatienter, muligvis ved at inducere inflammatoriske ændringer i makrofager gennem TLR4-signalering.

Virkninger af cistanche: behandling af nyresygdomme

Introduktion

Kronisk inflammation spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​diabetes ellerfedmeog dets kardiovaskulære komplikationer [1]. Inddragelsen af ​​medfødte immunreceptorer og de endogene ligander i processen med kronisk inflammation er blevet impliceret. Myeloid-relateret protein 8 (MRP8, også kendt som S100A8 eller calgranulin A) blev oprindeligt identificeret som et cytoplasmatisk calciumbindende protein i neutrofiler og monocytter [2] og er blevet bredt anerkendt som en potent endogen ligand for toll-lignende receptor 4 (TLR4) ) i forskellige sygdomme, herunder septisk shock, vaskulære og autoimmune lidelser [3,4,5]. Vi har for nylig foreslået, at MRP8/TLR4-signalering spiller en vigtig rolle i den hyperlipidæmi-inducerede progression af diabetisk nefropati [6]. Glomerulære makrofager og samlende kanalceller er hovedkilder til MRP8 i musemodeller for henholdsvis diabetisk nefropati[6] og nyrefibrose [7]. Plasmaniveauer af MRP8, som normalt danner et heterodimert kompleks med en bindingspartner MRP14 i blodbanen, er øget hos overvægtige personer [8,9]. Der har dog ikke været rapporter om nyreekspression af MRP8 hos patienter med fedme ellertype2 diabetesog dets sammenhæng med nyreprognose.

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme mRNA- og proteinekspressionsniveauer af MRP8 inyreaf japanske patienter med diabetisk nefropati (DN),fedme-relateret glomerulopati(ORG), nefrotisk syndrom med minimal forandring (MCNS) eller mindre glomerulær abnormitet (MGA), som alle blev diagnosticeret ved nyrebiopsi, og for at evaluere om renal MRP8-ekspression kan forudsige nyreudfald.

Cistanche kan forbedre nyrefunktionen

Materialer og metoder

Etikerklæring

Den menneskelige undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne udtrykt i Helsinki-erklæringen og blev godkendt af de etiske komitéer for menneskelig forskning på henholdsvis Kyoto University Graduate School of Medicine og Osaka City General Hospital. Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke. Dyreundersøgelsesprotokollen blev godkendt af Dyreforskningskomitéen ved Kyoto University Graduate School of Medicine (tilladelsesnummer: Med Kyo 13318). Al dyrekirurgi blev udført under natriumpentobarbital-bedøvelse, og alle anstrengelser blev gjort for at minimere lidelse.

Studiefag

Proteinuriske patienter medfedmeeller type 2-diabetes, som gennemgik nyrebiopsi, blev inkluderet i denne undersøgelse. Patienter med infektionssygdom, cancer, leversygdom eller kollagensygdom blev udelukket. Proteinuri blev defineret som urinprotein større end 0,5 g/g kreatinin eller urinalbumin større end 300 mg/g kreatinin i mindst to på hinanden følgende målinger.Fedmeblev defineret som et kropsmasseindeks (BMI) større end 25.0 (kg/m²). Type 2-diabetes blev diagnosticeret i overensstemmelse med Verdenssundhedsorganisationens kriterier. Biokemiske målinger ved indlæggelse til nyrebiopsi blev brugt som baseline karakteristika til tværsnitsanalyse. Estimeret glomerulær filtrationshastighed (eGFR) blev beregnet ved hjælp af en forenklet forudsigelsesligning foreslået af Japanese Society of Nephrology: eGFR (ml/min/1,73 m)²)=1946 [alder (år)]20.287 6 [serumkreatinin (mg perdl)]21.094 60.739 (for kvinder), som er en valideret lokal modifikation af MDRD [ 10]. Serumkoncentrationerne af kreatinin blev målt ved hjælp af en enzymatisk metode.

Til immunhistokemi blev 65 japanske patienter, som gennemgik nyrebiopsi ved Institut for Medicin og Klinisk Videnskab, Kyoto Universitetshospital mellem 2000 og 2011, analyseret. Biopsi-beviste diagnoser af alle patienter i denne periode er anført i tabel S1 i fil S1. De undersøgte emner i dette arbejde omfattede DN (n=19), ORG (n=10) og ikke-overvægtige, ikke-diabetiske kontrolpersoner, der blev diagnosticeret som MGA(n=19) eller MCNS (n=17). Nogle tilfælde i disse kategorier blev udelukket, fordi resterende prøver indeholdt mindre end 10 glomeruli. Definitionen af ​​DN bestod af (1) mere end 5 års varighed efter indtræden af ​​diabetes, (2) eksistens af mikro- eller makroalbuminuri, (3) kompatible histopatologiske ændringer med DN såsom glomerulær basalmembranfortykkelse, mesangial ekspansion, nodulær sklerose (Kimmelstiel-Wilson nodules) og/eller arteriolær hyalinose, og (4) udelukkelse af andre årsager til nyresygdomme [11]. ORG blev defineret morfologisk som fokal segmentel glomerulosklerose og/eller glomerulomegali hos forsøgspersoner med beggefedmeog proteinuri, hvis definitioner blev beskrevet ovenfor [12,13].

Til mRNA-ekspressionsanalyse blev prøver af lav kvalitet, hvor18S-ribosomalt RNA (rRNA)-niveauer var lavere end detektionsfølsomhedsgrænsen ved real-time RT-PCR, udelukket. De indskrevne forsøgspersoner bestod af 22 type 2-diabetespatienter, som gennemgik nyrebiopsi på Osaka City General Hospital mellem 2000 og 2010, og 6 ikke-diabetiske kontrolpersoner, som havde biopsi-bevist MGA.

Tabel 1 og 2 opsummerer de kliniske baseline-karakteristika for de patienter, som blev undersøgt ved henholdsvis immunhistokemisk eller genekspressionsanalyse. Til lysmikroskopi blev vævsprøverne behandlet i overensstemmelse med standardprocedurer. Sektioner blev farvet med hæmatoxylin-eosin, periodic acid-Schiff, periodisk syre methenamin sølv eller Masson trichrome (fig. S1). Forholdet mellem antallet af glomeruli med global sklerose og antallet af glomeruli og de relative områder af tubulointerstitiel fibrose blev evalueret uafhængigt af to patologer, der ikke var klar over diagnose og kliniske data.

Virkninger af cistanche: behandling af nyresygdomme

Definition af nyreresultater

Følgende to prognostiske indikatorer blev undersøgt ved henholdsvis lineær regression og logistisk regressionsanalyser: (1) omfanget af proteinuri målt et år efter biopsi, og (2) nyrehændelse defineret som den årlige stigning i serumkreatinin med 0,50 procent fra baseline eller påbegyndelse af kronisk dialyse.

Immunhistokemi

Immunhistokemi af MRP8 og CD68 blev udført under anvendelse afnyresektioner (tykkelse 4 mm) fikseret med 4 procent bufret paraformaldehyd. Efter antigenudvinding med citratbuffer blev nyresektioner inkuberet med 10 procent gedeserum efterfulgt af muse-anti-humant MRP8 (1:100; BMA biomedicals, Augst, Schweiz)[14] eller muse-anti-humane CD68-antistoffer (1:50) DAKO, Ely, Storbritannien). Primære antistoffer blev visualiseret med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof og 3,3-diaminobenzidintetrahydrochlorid (Dako USA, Carpinteria, CA). Kerner blev modfarvet med hæmatoxylin. MRP8-positive celler blev talt i mere end 10 glomeruli, og MRP8-positivt område i tubulointerstitium blev målt kvantitativt for at opnå et gennemsnit for hvert individ ved hjælp af MetaMorph 7.5-software (Molecular Devices, Downingtown, PA, USA ). Kolokalisering af CD68- og MRP8-positive celler blev evalueret med serielle sektioner. Der var hverken MRP8- eller CD68-signal i negative kontroller farvet uden første antistof (fig. S2). Ved præinkubation af anti-MRP8-antistof med 20 molært overskud af rekombinant humant MRP8-protein (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ved 4uC natten over blev farvningen markant reduceret, hvis ikke fuldstændig, hvilket yderligere understøttede antistoffets specificitet (fig. S3) .

Cistanche til behandling af nyre

Evaluering af mRNA-ekspression

Frossetnyresektioner blev adskilt i glomeruli og nonglomerulus væv ved laser capture mikro-dissektion (LM200; Olympus, Tokyo, Japan) som tidligere beskrevet [15]. Total RNA blev ekstraheret med RNeasy mini kit (Qiagen, Tokyo, Japan). mRNA ekspressionsniveauer blev bestemt ved TaqMan real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [16,17]. Ekspressionsniveauer af alle gener blev normaliseret af 18S rRNA (intern kontrol) niveauer. Se tabel S2 i fil S1 for primer- og probesekvenser. Eukaryot 18S rRNA blev påvist med præudviklede TaqMan-assay-reagenser (Applied Biosystems).

Tabel 1. Baseline kliniske karakteristika for patienter ved nyrebiopsi, som blev analyseret for MRP8-proteinekspression ved immunhistokemi.

MGA: mindre glomerulær abnormitet, MCNS: nefrotisk syndrom med minimal forandring, ORG:fedme-relateret glomerulopati, DN: diabetisk nefropati, BMI: body mass index, BUN: blodurinstofnitrogen, CRP: C-reaktivt protein. Data er midler 6 SD. *Overordnede forskelle mellem MGA-, MCNS-, ORG- og DN-grupper blev sammenlignet af ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

MRP8 behandling af makrofager

Knoglemarvs-afledte makrofager blev genereret fra vildtype eller TLR4 knockout (KO) mus [18] på C57BL/6J genetisk baggrund (Oriental BioService, Kyoto, Japan) som beskrevet tidligere [6]. Kort fortalt, efter lysis af røde blodlegemer blev knoglemarvsceller resuspenderet i et medium indeholdende 20 procent føtalt kalveserum og 50 ng/ml rekombinant human makrofag-koloni-stimulerende faktor (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) og dyrket ved 37uC i 5 procent CO2 atmosfære. På dag 7 blev makrofager inkuberet med rekombinant muse MRP8 (Abnova, Taipei, Taiwan) eller vehikel i 4 timer. Polymyxin B (25 mg/ml, NacalaiTesque, Kyoto, Japan) blev tilsat til hver brønd for at minimere kontaminering af endotoksin som beskrevet tidligere [3,19]. Noendotoxin blev påvist ved enhver koncentration af MRP8 testet herefter inkubation med 25 mg/ml polymyxin B ved ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA). Total RNA fra celler blev ekstraheret med RNeasy MiniKit, og mRNA-ekspressionsniveauer af interleukin-1 beta (IL-1b), tumornekrosefaktor-alfa (TNFa) og MRP8 blev bestemt af TaqMan i realtid RT-PCR. Ekspressionsniveauer af alle gener blev normaliseret af gnaver-GAPDH-niveauer (intern kontrol, præ-udviklede TaqMan-assay-reagenser). Primer- og probesekvenser til realtids-PCR er opført i tabel S2 i fil S1.

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middel 6 SD, eller betyder 695 procent konfidensinterval (CI), når det er relevant. Til sammenligningen mellem fire grupper blev en- eller to-vejs ANOVA med Bonferronis post-hoc analyse brugt, og kategoriske variable blev sammenlignet ved hjælp af x2 test. Elevens uparrede t-test blev anvendt til sammenligning mellem to grupper efter behov. Spearman-korrelationskoefficienter blev estimeret til at bestemme sammenhænge mellem to variable. For at undersøge virkningerne af baseline-kovariater, der bestemmer omfanget af glomerulær eller tubulointerstitiel MRP8-ekspression eller urinproteinniveauer et år efter biopsi, blev der udført univariate og multivariate lineære regressionsanalyser. Logistisk regressionsanalyse blev brugt til at analysere forklarende variabler, der forudsiger forekomsten af ​​nyrehændelser. Alle data blev analyseret ved hjælp af StatView 5.0-software (SAS InstituteInc., Cary, NC, USA). P-værdier,0.05 blev betragtet som statistisk signifikante.

Virkninger af cistanche: behandling af nyresygdomme

Resultater

Vi sammenlignede MRP8-proteinekspressionsniveauer inyreblandt DN, ORG og ikke-overvægtige, ikke-diabetiske kontrolgrupper (MGA og CNS). Immunhistokemisk analyse afslørede, at både glomerulært MRP8-positivt celletal (Fig. 1A) og tubulointerstitielt MRP8-positivt område (Fig. 1B) i DN var signifikant større end dem i andre grupper, herunder MGA, MCNS, og ORG (s<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

Tabel 2. Baseline kliniske karakteristika for patienter ved nyrebiopsi, som blev analyseret for MRP8-mRNA-ekspression ved realtids-RT-PCR.

Associationerne mellemnyreMRP8-signaler og kliniske baseline-parametre på tidspunktet for nyrebiopsi blev analyseret i tværsnit (tabel 3). Ved univariat analyse var glomerulær og/eller tubulointerstitiel MRP8-proteinekspression signifikant korreleret til alder, systolisk og diastolisk blodtryk, urinprotein, serumniveauer af kreatinin, BUN- og HDL-kolesterol, eGFR og omfanget af global glomerulosklerose og tubulointerstitiel fibrose. Disse parametre blev yderligere undersøgt ved multivariat analyse efter at have ekskluderet diastolisk blodtryk, eGFR og BUN på grund af kollinearitet. Procentdel af tubulointerstitiel fibrose var uafhængigt korreleret med glomerulæreMRP8-signaler (b=0.62, justeret P=0.02) og tubulointerstitielMRP8-signaler (b=0.85, justeret P 0,001). Derudover var tubulointerstitielle MRP8-signaler også uafhængigt korreleret med baseline-proteinuri (b=0.20, justeret P=0.01). Spredte plotanalyser mellem MRP8-signaler i glomeruli eller tubulointerstitium og kliniske parametre indikerede, at MCNS-gruppen havde et distinkt distributionsmønster fra andre grupper, især hvad angår urinprotein og serum LDL-kolesterolniveauer (fig. S5A-D, S6A-D). Udelukkelse af MCNS-gruppe forbedrede korrelationen mellem MRP8-signaler og urinprotein- eller serum-LDL-kolesterolniveauer (fig. S5E-F, S6E-F). Derfor udførte vi en underanalyse, der ekskluderede MCNS-patienter og fandt, at urinprotein var en uafhængig faktor korreleret med glomerulæreMRP8-signaler ved multivariat analyse (tabel 4; b=0.36, justeret P=0.03 ).

Dernæst udførte vi lineær regression eller logistisk regressionsanalyser for at identificere forklarende faktorer, der forudsagde nyreresultater, som var omfanget af proteinuri et år senere og nyrehændelse inden for et år. Da der var en god sammenhæng mellem glomerulære og tubulointerstitielle MRP8-signaler (fig. S7; R=0.67,P,0.001), blev disse parametre alternativt inkluderet i yderligere analyser . Vi evaluerede sammenhængen mellem baseline-parametre og urinprotein 1 år efter nyrebiopsi ved multipel regressionsanalyse. Som vist i tabel 5 var glomerulært MRP8-signal (b=0.59, justeret P,0.001) en forudsigelig faktor for omfanget af proteinuri et år senere, såvel som det systoliske blodtryk ved baseline (b {{13} }.21, justeret P=0.04) og baseline proteinuri(b=0.37, justeret P=0.002). Disse parametre var uafhængige af andre kendte risikofaktorer for diabetisk nefropati, herunder nyreinsufficiens (serumkreatinin) og omfanget af global sklerose og tubulointerstitiel fibrose [11,21-24]. På den anden side var tubulointerstitielt MRP8-signal (b=0.34, justeret P=0.09) ikke en uafhængig prædiktiv faktor for urinproteinniveauer et år senere. Nyrehændelser forekom hos 7 patienter (6 i DN og 1 i ORG-tilfælde) inden for et år efter nyrebiopsi. Ved univariat analyse var ikke kun omfanget af glomerulosklerose og tubulointerstitiel fibrose og glomerulære og tubulointerstitielle MRP8-signaler, men også blodtryk, nyreinsufficiens og urinproteinniveauer ved baseline signifikante prædiktive faktorer for forekomsten af ​​nyrehændelser. Ved multivariat analyse blev deres kovariater imidlertid annulleret af hinanden (tabel S3 i fil S1), sandsynligvis på grund af høje korrelationer mellem disse parametre.

Endelig undersøgte vi styrken af ​​MRP8 som en endogen ligand for TLR4 ved hjælp af dyrkede makrofager. I knoglemarvs-afledte makrofager fra vildtype-mus inducerede MRP8-protein opregulering af proinflammatoriske cytokin-gener såsom IL-1b og TNFa og udløste også auto-induktion af MRP8, på en dosisafhængig måde mellem 1{{ 15}}-1000 ng/ml. Disse virkninger af MRP8 blev undertrykt ca. to tredjedele i makrofager opnået fra TLR4 KO-mus (P, 0,01) (fig. 3).

Figur 1. Immunhistokemiske og mRNA-analyser for MRP8 innyrebiopsiprøver. Kvantificering af glomerulær MRP{{0}}positivt celletal (A) og tubulointerstitiel MRP8-positivt område (B). mRNA-ekspression af MRP8 i glomerulære og ikke-glomerulære fraktioner (C). Åbne søjler: ikke-overvægtige, ikke-diabetiske kontroller, som er MGA eller MCNS, lukkede søjler: ORG eller DN (A–C). Repræsentative billeder af MGA-, MCNS-, ORG- og DN-grupper (D-G). MGA: mindre glomerulær abnormitet, MCNS: minimal forandring nefrotisk syndrom, ORG: fedme-relateret glomerulopati, DN: diabetisk nefropati. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001

Diskussion

Den nuværende undersøgelse har vist, at MRP8 er rigeligt udtrykt i glomeruli og tubulointerstitium hos patienter med DN'er sammenlignet med ORG og ikke-overvægtige, ikke-diabetisk kontrol (MGA og MCNS). Desuden havde MRP8-ekspressionsniveauer en tendens til at være højere hos ORG-personer end MGA- eller MCNS-personer. I grundlinje-tværsnitsundersøgelse inklusive alle forsøgspersoner, ved univariat lineær regressionsanalyse, var glomerulært MRP8-positivt celletal og tubulointerstitiel MRP8-positivt areal begge korreleret, ikke kun med forskellige kendte risikofaktorer for diabetisk nefropati (såsom systolisk blodtryk, proteinuri og serumkreatinin), men også med omfanget af glomerulosklerose og tubulointerstitiel fibrose. Ved multivariat analyse var tubulointerstitiel MRP8-positivt område signifikant korreleret med proteinuri og tubulointerstitiel fibrose. Glomerulært MRP8-positivt celletal var signifikant korreleret med tubulointerstitiel fibrose i den primære analyse og med proteinuri i en underanalyse, der ekskluderede MCNS-gruppen. Immunhistokemi indikerede, at MRP8 blev udtrykt, i det mindste delvist, af CD68(plus)-udtrykkende makrofager og atrofiske tubuli. Disse resultater rejser muligheden for, atnyreMRP8-signaler i glomeruli eller tubulointerstitium kan tjene som nye markører for diabetisk nefropati.

Figur 2. Lokalisering af CD68- og MRP8-proteinekspression i serielle snit af diabetisk nefropatitilfælde. Ekspression af CD68(A, B) og MRP8-ekspression (C, D) i parrede nyreprøver (A og C, ellerB og D). Pile angiver samlokalisering af CD68- og MRP8-signaler.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

I den prognostiske undersøgelse afslørede multivariat analyse, at urinproteinniveauer et år efter nyrebiopsi uafhængigt var forbundet med glomerulær MRP8-positivt celletal, urinprotein og systolisk blodtryk ved baseline. Det skal bemærkes, at glomerulær MRP8-ekspression viste den stærkeste korrelation med urinprotein et år senere (b= 0.87), endda stærkere end baseline urinprotein (b=0.78), ved univariat analyse. Det skyldes delvist, at glomerulær MRP8-ekspression ikke er stort set forhøjet i 'godartede' former for proteinuri, såsom dem, der observeres hos MCNS-patienter, hvis niveauer af proteinuri er ekstremt høje ved diagnosticering ved nyrebiopsi, men som normalt forsvinder inden for et år efter påbegyndelse af immunsuppressiv behandling. Disse resultater tyder på, at glomerulær MRP8-ekspression kan have en unik prædiktiv karakter som en sygdomsmarkør, som ikke kan erstattes af baseline-proteinuri eller rutinemæssig patologisk analyse, der evaluerer global glomerulosklerose og tubulointerstitiel fibrose. Desuden spekulerer vi i, at glomerulær MRP8-ekspression ikke er en simpel markør eller tilskuer, men en aktiv spiller i glomerulær skade som diskuteret nedenfor.

Bestemmelseskoefficienten (R2) beregnet med forklarende parametre inkluderet i multipel regressionsanalyse var henholdsvis 0.52* og 0.74#. y, år; BP, blodtryk; gCr, g kreatinin; T-chol, total kolesterol; HDL-Chol, HDL-cholesterol; LDL-chol, LDL-kolesterol; GS, glomerulosklerose; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

Tabel 4. Delanalyse af forholdet mellem kliniske baseline-parametre og MRP8-signaler, efter udelukkelse af MCNS-gruppe.

Tabel 5. Multipel regressionsanalyse til identifikation af faktorer, der forudsiger urinproteinniveauer 1 år efter nyrebiopsi

Figur 3. Virkninger af MRP8 på knoglemarvs-afledte makrofager. Knoglemarvs-afledte makrofager (BMDM) blev stimuleret med rekombinant muse-MRP8 i 4 timer. Fejlbjælker angiver 95 procent CI, og statistiske analyser blev udført med log-transformerede værdier. To-vejs ANOVA afslørede signifikante effekter af genotyper, MRP8-koncentrationer og deres interaktioner for ekspression af alle 3 gener (P,0.001 for alle sammenligninger). n=4. WT, vildtype; KO, knockout; IL-1b, interleukin 1 beta; TNFa, tumornekrosefaktor-alfa. *P,0,01 blandt forskellige koncentrationer, #P,0,01 blandt genotyper.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

I et andet forsøg på en longitudinel undersøgelse lykkedes det ikke med logistisk regressionsanalyse at finde ud af nogen uafhængige forudsigelser for forekomsten af ​​en nyrehændelse inden for et år. Vi spekulerer i, at dette til dels skyldes, at tubulointerstitiel MRP8-ekspression og tubulointerstitiel fibrose var to potente prædiktorer for nyrehændelse i univariat analyse, men deres betydning blev annulleret af hinanden i multivariat analyse. Disse to parametre viste en stærk korrelation (R=0.68, P,0.001) (Fig. S8), hvilket tyder på, at disse to parametre kan svare til at forudsige nyrehændelser. Faktisk viste interstitiel MRP8-ekspression et ganske lignende mønster som interstitiel fibrose evalueret ved Masson-trikromfarvning. Mængden af ​​interstitiel MRP8 afhænger i vid udstrækning af de positive signaler i atrofiske tubuli snarere end dem i makrofager, hvis egenskab adskiller sig fra glomerulær MRP8 i en punktformet fordeling. Desuden kan en lille prøvestørrelse, kort observationsperiode og få forsøgspersoner, der udviklede nyrehændelser, have reduceret detektionsevnen. Da MRP8-ekspression i tubulære epitelceller spiller en årsagsrolle i progressionen af ​​tubulointerstitiel inflammation i en musemodel af nyrefibrose[7], vil yderligere analyse være nødvendig for at afklare rollen af ​​tubulointerstitiel MRP8 i DN.

I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse [6] blev MRP8 mRNA opreguleret overvejende i den glomerulære fraktion af humane DN-personer sammenlignet med kontrolpersoner med MGA. På den anden side blev MRP8-proteinekspression ikke kun observeret i glomerulus, men også i tubulointerstitium. I denne forbindelse skal det bemærkes, at der var to forskellige mønstre af MRP8-farvning i tubulointerstitium af DN. Den ene var intens og fokal farvning i svært atrofiske tubuli. Den anden var mild farvning fordelt langs børstekanten af ​​proksimale tubuli, som også blev fundet i ORG og MCNS. Sidstnævnte signaler repræsenterer sandsynligvis MRP8-protein, der stammer fra blodet og reabsorberes af proksimale tubuli, som ikke bør ledsages af øget MRP8-mRNA-ekspression. Hvad angår andre proteiner end MRP8, har vi og andre for nylig rapporteret lignende fænomener med immunreaktivt proteinpåvisning i de proksimale tubuli forårsaget af reabsorption, men ikke af nyresyntese [25,26]. På den anden side, da en lille MRP8-farvning forblev i antistofabsorptionstesten, især i glomerulære eksudative læsioner og alvorligt arrede, fibrotiske læsioner omkring atrofiske tubuli, kan tilstedeværelsen af ​​ikke-specifikke signaler fuldstændigt negeres (fig. S3).

Glomerulære MRP8-signaler viste hovedsageligt punktmønstre i DN-personer (fig. 1, fig. S4). Da både CD68 og MRP8 blev påvist af muse monoklonale antistoffer, blev lokaliseringen af ​​disse molekyler evalueret ved serielle snit, ikke ved dobbelt immunfarvning. Farvningsmønstre af MRP8 var kompatible med dem i andre inflammatoriske nyresygdomme, herunder IgAnephritis [27], membranproliferativ glomerulonephritis [14] og ANCA-relateret glomerulonephritis [20], hvor makrofager blev foreslået som en væsentlig kilde til MRP8, som vi rapporterede i en gnavermodel [6]. Derudover kunne neutrofiler betragtes som en anden kilde til MRP8, der påvirker vaskulære komplikationer [28]. I øjeblikket undersøger vi den molekylære mekanisme, hvorforMRP8 overvejende er opreguleret i myeloid-celler, der infiltrerer glomeruli. In vitro undersøgelse afslørede, at MRP8 inducerede inflammatorisk cytokinekspression og også forstærkede ekspression af MRP8 selv i makrofager på en TLR4-afhængig måde. Derudover var MRP8-positive celler fraværende i nodulær skleroserende læsioner, hvilket tyder på, at glomerulær MRP8 kan afspejle igangværende glomerulær skade [20]. Det er vigtigt, at et menneskeligt studie i stor skala rapporterede, at MRP8-genekspression i mononukleære blodceller hos type 1-diabetespatienter er signifikant forhøjet hos personer med diabetiske komplikationer, herunder nefropati [29].

Da hæmning af renin-angiotensin-systemet (RAS) er en vigtig determinant for nyreresultater, undersøgte vi virkningerne af RAS-blokade pånyreMRP8 udtryk. Vi fandt ingen signifikant forskel i nyre-MRP8-mRNA-ekspression mellem DN-patienter behandlet med eller uden RAS-blokade (Fig. S9), sandsynligvis fordi tilfælde behandlet med RAS-blokade havde en tendens til at have mere alvorlig hypertension og proteinuri end tilfælde uden RAS-blokade

Hos overvægtige mennesker og mus kan øget plasma MRP8/14-kompleks afspejle en grad affedmeog stammer fra adipocytter såvel som leukocytter [8,9]. Vores ORG-tilfælde havde mild farvning af MRP8 i proksimale tubuli, hvilket tyder på øgede plasmaniveauer af MRP8. I modsætning hertil var der ingen signifikant sammenhæng mellem tubulointerstitiel MRP8-ekspression og kropsmasseindeks (fig. S6G). Derfor lokal MRP8 udtryk inyrekan tjene bedre som markør for nyreskade frem for forfedme[8,9].

Cistanche til forbedring af nyredysfunktion

Vores undersøgelse har flere begrænsninger. Prøveantallet af hver undersøgt gruppe var lille. Ikke-identiske forsøgspersoner blev indskrevet i mRNA og immunhistokemiske analyser. Da vi kun har analyseret patienter, der har gennemgået nyrebiopsi, afspejler sammensætningen af ​​de undersøgte patienter muligvis ikke dem hos almindelige type 2-diabetespatienter eller generelt kroniske.nyresygdomspersoner. Selvom alder ikke blev bibeholdt som en uafhængig faktor forbundet med MRP8-signaler i vores data (tabel 3), er det kendt, at aldring er forbundet med kronisk inflammation [30]. Effekterne af alder kan ikke helt negligeres. Selvom de fleste MRP8-signaler gik tabt i antistofabsorptionstesten, var der nogle positive signaler tilbage, som kan være forårsaget af den ikke-specifikke binding af det første antistof. Som diskuteret ovenfor hjælper undersøgelse af renal MRP8-ekspression ved nyrebiopsi os med at forstå patofysiologien og prognosen for kroniske nyresygdomme, især forbundet medfedmeog diabetes, men har en ulempe ved rutinemæssig og gentagen brug i ambulatorier

Sammenfattende tyder den nuværende undersøgelse på, at udtrykket af MRP8 inyreafspejler den aktuelle patologiske status og forudsiger også nyreudfald hos patienter medfedmeellertype 2 diabetes. Yderligere undersøgelser af MRP8-niveauer i urin blandt overvægtige eller diabetespatienter i stor skala kan være berettiget

Understøttende information

Figur S1 Repræsentative fotos, der viser nyrebiopsisnit af en DN-patient farvet med (A) periodinsyre Schiff, (B) periodisk syremethenaminsølv eller (C)Masson-trikrom. Forholdet mellem antallet af glomeruli med global sklerose (pile) blandt antallet af glomeruli og det relative areal af tubulointerstitiel fibrose var henholdsvis 33 procent og 65 procent hos denne patient. (TIFF)

Figur S2 Immunhistokemi for MRP8- og CD68-proteiner i DN-patienter. Billeder i højre kolonne viser negative kontroleksperimenter uden 1. antistof. (TIF)

Figur S3 Antistofabsorptionstest for MRP8-farvning.PBS: fosfatbufret saltvand, rhMRP8: rekombinant humanMRP8.(TIF)

Figur S4 Repræsentative billeder af MRP8-ekspression i MGA-, MCNS-, ORG- og DN-grupper.(TIF)

Figur S5 Korrelation mellem glomerulær MRP8-positivt celletal og kliniske parametre. De log-transformerede værdier af MRP8-signaler blev brugt. Korrelationerne blev analyseret ved hjælp af alle 4 grupper (A-D, G) eller 3 grupper eksklusive MCNS-gruppen (E, F). Åbne cirkler: mindre glomerulær abnormitet (MGA), lukkede cirkler: minimal forandring nefrotisk syndrom (MCNS), åbne trekanter:fedme-relateret glomerulopati (ORG), lukkede trekanter: diabetisk nefropati (DN).(TIF)

Figur S6 Korrelation mellem tubulointerstitiel MRP8-positivt område og kliniske parametre. De log-transformerede værdier af MRP8-signaler blev brugt. Disse korrelationer blev analyseret ved hjælp af alle de 4 grupper (A–D, G) eller 3 grupper undtagen MCNS-gruppen (E, F).(TIF)

Figur S7 Korrelation mellem glomerulær og tubulointerstitiel MRP8-ekspression. De log-transformerede værdier af MRP8-signaler blev brugt.(TIF)

Figur S8 Korrelation mellem tubulointerstitiel MRP8-positivt område og tubulointerstitiel fibrose. De log-transformerede værdier af MRP8-signaler blev brugt.(TIF)

Figur S9 Renal mRNA-ekspression af MRP8 i DN-patienter med eller uden renin-angiotensin blokade.NS: ikke signifikant. n=15 (Ja), 6 (Nej). Blandt 22 DN-tilfælde var information om medicin ikke tilgængelig hos én patient.(TIF)

Fil S1 understøttende tabeller.

Tabel S1, Patologiske diagnoser af alle tilfælde, der har gennemgået nyrebiopsi på Institut for Medicin og Klinisk Videnskab, Kyoto Universitetshospital mellem 2000 og 2011. Tabel S2, Primer- og probesekvenser for TaqMan real-time RT-PCR. Tabel S3, Logistisk regressionsanalyse for forekomsten af ​​en nyrehændelse inden for et år. (DOC)AnerkendelserVi takker S. Tanaka for statistisk rådgivning, Y. Ogawa, N.Igarashi og C. Kimura for teknisk assistance, og A. Yamamoto og SOgino for sekretærhjælp. Forfatterbidrag Udtænkt og designet eksperimenterne: TK KM MK HY MI AN KNMM. Udførte forsøgene: TK HI AI KK TM YK MI AN. Analyserede data: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Bidragede reagenser/materialer/analyseværktøjer: TK KM. Skrev papiret: TK KMMM.

Virkninger af cistanche: behandling af nyresygdomme

Referencer

1. Donath MY, Shoelson SE (2011) Type 2-diabetes som en inflammatorisk sygdom.Nat Rev Immunol 11: 98-107.

2. Odink K, Cerletti N, Bruggen J, Clerc RG, Tarcsay L, et al. (1987) Twocalcium-bindende proteiner i infiltrerende makrofager af leddegigt. Nature 330: 80-82.

3. Vogl T, Tenbrock K, Ludwig S, Leukert N, Ehrhardt C, et al. (2007) Mrp8 ogMrp14 er endogene aktivatorer af Toll-lignende receptor 4, der fremmer dødelig, endotoksin-induceret shock. Nat Med 13: 1042-1049.

4. Croce K, Gao H, Wang Y, Mooroka T, Sakuma M, et al. (2009) Myeloidrelateret protein-8/14 er afgørende for den biologiske reaktion på vaskulær skade. Circulation 120: 427-436.

5. Loser K, Vogl T, Voskort M, Lueken A, Kupas V, et al. (2010) De Toll-lignende receptor 4-ligander Mrp8 og Mrp14 er afgørende i udviklingen af ​​autoreaktive CD8 plus T-celler. Nat Med 16: 713–717.

6. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2012) Forværring af diabetisk nefropati ved hyperlipidæmi medieres af Toll-lignende receptor 4 hos mus. Diabetologia 55: 2256-2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011) Nyreopsamlende kanalepitelceller regulerer inflammation i tubulointerstitiel skade hos mus. J Clin Invest 121: 3425-3441.

8. Sekimoto R, Kishida K, Nakatsuji H, Nakagawa T, Funahashi T, et al. (2012) Høje cirkulerende niveauer af S100A8/A9-kompleks (calprotectin) hos japansk hankøn med abdominal fedt og dysreguleret ekspression af S100A8 og S100A9 i fedtvæv fra overvægtige mus. Biochem Biophys Res Commun 419: 782-789.

9. Mortensen OH, Nielsen AR, Erikstrup C, Plomgaard P, Fischer CP, et al. (2009) Calprotectin - en ny markør forfedme. PLoS One 4: e7419.

10. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K, et al. (2009) Reviderede ligninger for estimeret GFR fra serumkreatinin i Japan. Am JNyreDis53: 982-992.

11. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, et al. (2005) Diabetisk nefropati: diagnose, forebyggelse og behandling. Diabetes Care 28:164–176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001)Fedme-relateret glomerulopati: en ny epidemi.NyreInt 59: 1498-1509.

13. Praga M, Morales E (2006)Fedme, proteinuri og progression af nyresvigt.Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481-486.

14. Kawasaki Y, Hosoya M, Takahashi A, Isome M, Tanji M, et al. (2005) Myeloid-relaterede protein 8-ekspressioner på makrofager er en nyttig prognostisk markør for nyreinsufficiens hos børn med MPGN type 1. Am JNyreDis 45: 510-518.

15. Nishiyama A, Konishi Y, Ohashi N, Morikawa T, Urushihara M, et al. (2011) Angiotensinogen i urin afspejler aktiviteten af ​​det intrarenale renin-angiotensin-system hos patienter med IgA nefropati. Nephrol Dial Transplant 26: 170–177.

16. Ogawa Y, Mukoyama M, Yokoi H, Kasahara M, Mori K, et al. (2012) Natriuretisk peptidreceptor guanylylcyclase-A beskytter podocytter mod aldosteron-induceret glomerulær skade. J Am Soc Nephrol 23: 1198-1209.

17. Yokoi H, Mukoyama M, Mori K, Kasahara M, Suganami T, et al. (2008) Overekspression af bindevævsvækstfaktor i podocytter forværrer diabetisk nefropati hos mus.NyreInt 73: 446-455.

18. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, et al. (1999) Forkant: Toll-lignende receptor 4 (TLR4)-deficiente mus er hyporesponsive over for lipopolysaccharid: bevis for TLR4 som Lps-genproduktet. J Immunol162: 3749-3752.

19. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X, et al. (2007) Rolle af den Toll-lignende receptor 4/NF-kappaB pathway i mættede fedtsyre-inducerede inflammatoriske ændringer i interaktionen mellem adipocytter og makrofager. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 84-91.

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen N, et al. (2013) Leukocyt- og serum-S100A8/S100A9-ekspression afspejler sygdomsaktivitet i ANCA-associeret vaskulitis og glomerulonephritis.NyreInt 83: 1150-1158.

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) De vigtigste risikofaktorer for nefropati ved type 2 diabetes mellitus er plasmakolesterolniveauer, gennemsnitligt blodtryk og hyperglykæmi. Arch Intern Med 158: 998–1004.

22. Adler AI, Stratton IM, Neil HA, Yudkin JS, Matthews DR, et al. (2000) Forbindelse af systolisk blodtryk med makrovaskulære og mikrovaskulære komplikationer af type 2-diabetes (UKPDS 36): en prospektiv observationsundersøgelse.BMJ 321: 412-419.

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) Nephropathy of type -2 diabetes mellitus. J Assoc Nephrol 9: 2157-2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) Kliniske og histologiske korrelationer af fald i nyrefunktionen hos diabetespatienter med proteinuri. Diabetes 43: 1046-1051.

25. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A, et al. (2012) Liverangiotensinogen er den primære kilde til renal angiotensin II. J Am Soc Nephrol23: 1181-1189.

26. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2009) Urin-neutrofile gelatinase-associerede lipocalinniveauer afspejler skader på glomeruli, proksimale tubuli og distale nefroner.NyreInt 75: 285-294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y, et al. (2009) Akkumulering af makrofager, der udtrykker myeloid-relateret protein 8 forbundet med progressionen af ​​sklerotiske ændringer hos børn med IgA nefropati. Tohoku J Exp Med 218: 49-55.

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S, et al. (2013) Hyperglykæmi fremmer myelopoiese og forringer opløsningen af ​​åreforkalkning. Cell Metab 17: 695-708.

29. Jin Y, Sharma A, Carey C, Hopkins D, Wang X, et al. (2013) Udtrykket af inflammatoriske gener er opreguleret i perifert blod hos patienter med type 1-diabetes. Diabetes pleje.

30. Longo VD, Finch CE (2003) Evolutionær medicin: fra dværgmodelsystemer til sunde hundredårige? Science 299: 1342-1346.

Citat: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) Forudsigende betydning afNyreMyeloid-relateret protein 8-ekspression hos patienter medFedme- eller type 2 diabetes-associerede nyresygdomme. PLoS ONE 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942

Redaktør: Utpal Sen, University of Louisville, USA

Modtaget 11. september 2013; Godkendt 14. januar 2014; Udgivet 18. februar 2014

Copyright: 2014 Kuwabara et al. Dette er en artikel med åben adgang distribueret under vilkårene i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat at den oprindelige forfatter og kilde krediteres.

Finansiering: Dette arbejde blev delvist støttet af Grant-in-Aid for Diabetic Nephropathy and Nephrosclerosis Research fra Ministeriet for Sundhed, Arbejdsmarked og Velfærd i Japan (til KM), forskningsstipendier fra det japanske ministerium for undervisning, kultur, sport, videnskab , og teknologi (til TK, KM og MM), fra Japan Foundation for Applied Enzymology (til TK) og fra Smoking Research Foundation (til MM). Finansierne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at publicere eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer nogen konkurrerende interesser.

* E-mail: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp