Porcint placentaekstrakt øger de cellulære NAD-niveauer i humane epidermale keratinocytter Ⅱ

Diskussion

Mange undersøgelser har vist, atfald i NADpå grund af aldring er korreleret medfunktionelt fald i vævogudvikling af aldersrelaterede sygdomme og kræft11,22. I epidermis forårsager UV-bestråling, den vigtigste ydre faktor for hudens aldring, NAD-udtømning samtkronologisk aldring23. Da huden konstant udsættes for UV-bestråling i dagligdagen, synes den topiske påføring af NAD-forstærkende midler at være en rimelig tilgang til at forhindre NAD-reduktion og beskytte huden mod UV-skader. Forstærkning af NAD i huden har faktisk vist sig at forhindre UV-induceret hudkræft og immunsuppression hos mus24. Jacobson et al. rapporterede, at topiske nikotinsyrederivater øgede hudens NAD-indhold og forbedrede barrierefunktionen25.

Klik her for at få Cistanche-de bedste anti-aldringsurter

Derudover har flere kliniske undersøgelser vist, at topisk anvendelse af NAD-prækursoren NAM reducerertegn på ældning af huden26,27. Disse in vivo og kliniske data understøtter muligheden for, at forhøjede NAD-niveauer forhindrerhudskader og forsinker aldring. Vi har også tidligere rapporteret, at opretholdelse af tilstrækkelige NAD-niveauer er afgørende for beskyttelsen af ​​humane epidermale celler mod UV-stress21. I denne undersøgelse viste vi, at PPE øger intracellulære NAD-niveauer i keratinocytter. Vi fandt også, at dets aktive ingredienser har LMW på mindre end 3 kDa, hvilket er effektivt for både monolags- og 3-dimensionelle epidermis-kulturmodeller. Disse resultater tyder på, at de aktive ingredienser i PPE kunne absorberes transdermalt og fremhæver derfor dets potentielle anvendelse som et topisk middel til at øge hudens NAD-niveauer.

Tabel 1. NAD-prækursorindhold i PPE.

I huden sænker NAD-mangel funktionen af ​​de vigtigste energimetaboliske veje, såsom glykolyse og oxidativ phosphorylering. Glykolyse er uundværlig for at opretholde en balance mellem keratinocytproliferation og differentiering28. UV-eksponering nedsætter NAD-niveauer og kan derfor fremskynde denne ubalance. Forholdet mellem differentiering og proliferation blev observeret at være markant øget i soleksponeret hud sammenlignet med solbeskyttet hud29. Tan et al. fandt, at FK866-behandling accelererede differentiering og nedsatte metabolisk aktivitet i NHEK'er, og at NAM vendte disse FK866-inducerede hændelser ved at genoprette cellulære NAD-niveauer28.

Figur 4. Topisk PPE viser NAD-gendannelsesaktivitet, men påvirker ikke cellemetaboliske aktivitet i RHE. (A) Skematisk illustration af RHE-modellen. (B) PPE (2 mg/ml) blev påført på stratum corneum-siden af ​​RHE og inkuberet i 48 timer i nærvær eller fravær af FK866 (5 nM). De totale NAD-niveauer af væv blev bestemt under anvendelse af et NAD plus/NADH-assaykit. (C) PPE (0, 1, 2 eller 10 mg/mL) eller 1 procent TX-100 (som positiv kontrol) blev påført på stratum corneum-siden af ​​RHE og inkuberet i 48 timer . Cellemetaboliske aktivitet blev bestemt ved MTT-assay. **s<0.01, the comparison to the control.

I denne undersøgelse fandt vi ud af, at PPE genoprettede den FK866-inducerede NAD-udtømning. Derfor kan bestemmelse af, om PPE kan opretholde differentiering og proliferation i den NAD-depleterede epidermis, give en bedreforståelse af detanti-aging mekanisme.

For nylig har Aioi et al. viste, at lokal brug af PPE i høj grad reducerede ansigtsrynker og forbedrede hudens hydrering17. Vores tidligere kliniske test viste, at topisk påføring af PPE-creme resulterede i en signifikant forbedring afanti-hudældningsparametre, såsomrynker,hudhydrering, hængende, og øjenposer (upublicerede data). Resultaterne af denne undersøgelse kan bidrage til forståelsen af ​​den underliggende mekanisme, hvorved PPE reducerer rynker og forbedrer hydreringen af ​​huden. En tidligere rapport viste, at intracellulære totale NAD-niveauer er positivt korreleret med ekspressionen af ​​ekstracellulære matrixkomponenter, såsom procollagen og elastin, i humane hudfbroblaster30. Behandlingen af ​​fibroblaster med PPE resulterer i øget produktion af type I kollagen17. Kombineret med disse fakta kan PPE fremme kollagenproduktionen ved at øge NAD-indholdet i fibroblaster, hvilket kan føre til lindring af hudrynker observeret i kliniske forsøg. Hudhydrering er tæt forbundet med epidermallagets barrierefunktion. Adskillige undersøgelser har antydet, at NAD er en essentiel co-faktor for at opretholde hudbarrierefunktionen. Ming et al. viste, at den NAD-afhængige deacetylase SIRT1 regulerer ekspressionen af ​​filaggrin, som spiller en kritisk rolle som et forløberprotein for naturlige fugtgivende faktorer i hudbarrierens integritet31. Derudover viste en klinisk undersøgelse, at den topiske anvendelse af et NAD-boostende middel markant reducerede transepidermalt vandtab sammen med en stigning i stratum corneum-tykkelsen i fotobeskadiget hud25. Disse rapporter tyder på, at PPE kan forbedre hudbarrierefunktionen ved at øge cellulære NAD-niveauer i epidermis, hvilket sandsynligvis fører til forbedret hudhydrering, som er bemærket i kliniske forsøg.

I de senere år har NAD-boostere vist sig at være nyttige til at forbedre antioxidant- og antiinflammatoriske virkninger. I diabetiske og septiske musemodeller reducerede NR-administration signifikant fedtfattig diæt-induceret hjernebetændelse og forhindrede lipopolysaccharid-induceret endotelial oxidativ stress, henholdsvis 32,33. I lighed med NR har NMN-tilskud i gamle mus vist sig at vende den pro-inflammatoriske mRNA-ekspressionsprofil i den neurovaskulære enhed og at forbedre kardiovaskulær funktion ved at reducere oxidativt stress34,35. Derudover afslørede et klinisk forsøg med ældre mænd, at oral NR reducerede niveauet af cirkulerende inflammatoriske cytokiner36. Tilsammen understøtter disse in vivo og kliniske undersøgelser ideen om, at anvendelsen af ​​NAD-boostende midler giver antioxidante og antiinflammatoriske virkninger. Forbedret SIRT-aktivitet er blevet foreslået som en af ​​de plausible mekanismer, hvorved disse NAD-boostere udøver antiinflammatoriske og antioxidante virkninger. PPE er kendt for at have antioxidante og antiinflammatoriske virkninger15; dog er der indtil nu foretaget relativt begrænset mekanistisk udforskning. Nærværende undersøgelse giver i det mindste en delvis forklaring på virkningerne af PPE.

PPE er kendt for at indeholde rigelige cellevækstfremmende proteiner såsom laminin, cytokiner og vækstfaktorer. Nylige undersøgelser, herunder vores, har impliceret cellulære NAD-niveauer til at være forbundet med cellevækst i epidermale keratinocytter21,28. Derfor spekulerede vi i, at nogle af disse proteiner kunne bidrage til stigningen i NAD-indhold. I modsætning til vores forventninger fandt vi dog, at en del indeholdende molekyler med lav molekylvægt på mindre end 3 kDa fremmede NAD-produktion i keratinocytter. Interessant nok afslørede fraktionering af PPE-delen ved hjælp af HPLC, at NAD-produktion kun blev observeret i fraktion 3. Vi fandt også, at forstadier til NAD, såsom NMN, NR og NAM, var til stede i denne fraktion, hvilket tyder på, at de kunne forklare effekten af PPE på NAD-produktion, i det mindste delvist. Men da hver bestanddel indeholdt i PPE blev påvist i meget lave koncentrationer, synes det vanskeligt at forklare, at disse bestanddele alene er ansvarlige for PPE's evne til at fremme NAD-indhold i keratinocytter. Nylige rapporter har vist, at de reducerede former for disse NAD-prækursorer, NRH og NMNH, har en større evne til at producere NAD end NR og NMN37-40. Selvom der er behov for yderligere analyser for at bestemme, om PPE indeholder NRH og NMNH, kan den NAD-boostende evne af PPE observeret i denne undersøgelse tilskrives flere NAD-forstærkere, herunder NMN, NR, NMNH, NRH og andre ukendte NAD-prækursorer.

Materialer og metoder

temperatur i en ekssikkator, blev vægten målt med en præcisionsvægt. Tørstofindholdet i PPE var 10,98 mg/ml.

Cellekulturer.

NHEK'er (nyfødt/han, Termo Fisher Scientifc, Waltham, MA, USA) blev dyrket i EpiLife™-medium indeholdende 60 μM calcium suppleret med humant keratinocytvæksttilskud (begge fra Termo Fisher Scientifc) ved 37 grader i en fugtet atmosfære med 5 procent CO2 . Mediet blev skiftet hver anden dag, indtil kulturen nåede ca. 50 procent sammenløb, hvorefter det blev skiftet hver dag. Cellerne blev passeret, da de nåede 80-90 procent sammenflydning. NHEK'er blev ikke brugt ud over passage 5.

NAD kvantificering og genvindingsassay.

Mængden af ​​NAD blev målt under anvendelse af NAD plus/NADH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev 1.0× 105 NHEK'er podet i 12-brøndsplader. Efter 24 timer blev celler behandlet med PPE ved forskellige koncentratmuligheder (0, 0,25, 0,5 og 1 mg/ml) og dyrket i 1-24 timer i nærvær eller fravær af 5 nM FK866 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA). Cellerne blev lyseret med den medfølgende NAD plus/NADH-ekstraktionsbuffer og ultrafiltreret under anvendelse af en Ultracel-10 K centrifugalfilteranordning (Merck, Darmstadt, Tyskland). For at beregne NADH-koncentration blev halvdelen af ​​filtraterne inkuberet ved 60 grader i 60 minutter for at nedbryde NAD plus. Alle filtrater blev udsat for den enzymatiske reaktion ved 37 grader i 1 time. Derefter blev absorbansen af ​​prøverne målt ved 450 nm under anvendelse af en Infinite 200 Pro pladelæser (Tecan, Männedorf, Schweiz). NAD plus-indholdet blev beregnet ved at trække NADH-indholdet fra det totale NAD-indhold. NAD plus/NADH-niveauer blev normaliseret til de respektive proteinkoncentrationer bestemt ved brug af Pierce BCA-proteinassayet (Thermo Fisher Scientific).

med 300 μL 1 mg/mL MTT (Thermo Fisher Scientific) opløsning ved 37 grader og 5 procent CO2 i 3 timer. Efter vask tre gange med PBS blev formazan infiltreret i NHEK'er ekstraheret med 200 μL dimethylsulfoxid ved stuetemperatur i 2 timer. Optisk absorption ved 560 nm blev bestemt under anvendelse af en Infnite 200 Pro pladelæser (Tecan).

Ultrafiltrering af PPE. PPE (500 μL) blev påført på en Ultracel-3K centrifugalfilteranordning (Merck Millipore) og centrifugeret ved 16.100×g ved 4 grader i 60 min. Filtraterne blev anvendt som en LMW-fraktion af PPE. For at genvinde resterne på filteret blev filteranordningerne anbragt på hovedet i et nyt centrifugerør og centrifugeret ved 1000 xg ved 4 grader i 5 min. Resterne blev rekonstitueret med 500 μL phosphatbufret saltvand (PBS) og brugt som en HMW-fraktion af PPE.

min: hold på 100 procent opløsningsmiddel A fra 0 til 10 min., derefter en lineær gradient fra 0 procent B på 10 minutter til 95 procent B på 30 minutter. Eluenterne blev opsamlet i prøverør hvert 2. minut og tørret under anvendelse af en centrifugalfordamper CVE-3100 (EYELA, Tokyo, Japan). Resterne blev rekonstitueret med 100 μL PBS og filtreret gennem en 0,22 μm membran før brug af NAD-genvindingsassayet.

Analyser af NAD-prækursorer.

NMN, NR og NAM blev påvist og kvantificeret ved isotopfortynding LC-MS/MS. Analyser blev udført under anvendelse af et ACQUITY UPLC H-Class system koblet med et TQS-mikro tredobbelt quadrupol massespektrometer (Waters, Milford, MA, USA) med elektrospray-ionisering drevet i positiv ion-tilstand. En Capcell Pak ADME HR-søjle (2 μm, 2,1×100 mm, Osaka Soda, Osaka, Japan) blev brugt til at adskille hver prøve. Mobile faser A-B var vand-methanol (indeholdende {{10}},1 procent myresyre og 10 mM ammoniumformiat). Gradientbetingelsen var som følger: 0–0,5 min (99 procent A), 0,5–3 min (99–60 procent A), 3–5 min (60–2 procent A) og 5–7 min. (2 procent A). Strømningshastigheden var 0,2 ml/min. Kapillærspændingen var 0,75 kV, kildetemperaturen var 150 grader, og desolvationstemperaturen var 500 grader. Keglegasstrømmen var 50 l/time, og desolvatiseringsgasstrømmen var 1100 l/time. For at kvantificere hver NAD-precursor blev NAM-13C6 tilsat til prøverne i en koncentration på 78 nM som en intern standard. Ionerne blev overvåget under anvendelse af multipel reaktionsovervågning (MRM) med følgende overgange: m/z 335→123 for NMN, m/z 255→123 for NR, m/z 123→80 for NAM og m/z 129→85 for NAM-13C6. NMN blev købt fra Oriental Yeast (Tokyo, Japan). NR og NAM-13C6 blev opnået fra Merck (Darmstadt, Tyskland). NAM blev købt fra Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan).

RHE. In vitro RHE-modellen EpiDerm™ (EPI-200) blev købt fra MatTek (Ashland, MA, USA) og dyrket i EPI-100-ASY-medium (MatTek) ved 37 grader og 5 procent CO2. Et hundrede mikroliter PPE (1, 2 og 10 mg/ml) eller 1 procent TX-100 blev påført på stratum corneum-siden af ​​RHE. RHE blev inkuberet i 48 timer i et EPI-100-ASY-medium i nærvær eller fravær af FK866 (5 nM). Efter inkubation blev RHE vasket tre gange med PBS. Til NAD-genvindingsassayet blev de totale NAD-niveauer i RHE kvantificeret ved hjælp af NAD plus /NADH Assay Kit-WST. Til analysen af ​​cellemetaboliske aktivitet blev RHE overført til en 24-brøndplade og inkuberet med 300 μL 1 mg/ml MTT (Thermo Fisher Scientific) opløsning ved 37 grader og 5 procent CO2 i 3 timer. Efter vask tre gange med PBS blev formazan infiltreret i RHE ekstraheret med 2 ml dimethylsulfoxid ved stuetemperatur i 2 timer. Optisk absorption ved 560 nm blev bestemt under anvendelse af en Infnite 200 Pro pladelæser (Tecan). Absorbansen med 1 procent TX-100 behandlet RHE blev brugt som den positive kontrol for cellemetaboliske aktivitetsanalysen.

Statistisk analyse. Data præsenteres som middelværdi ± standardfejl af middelværdien af ​​mindst tre uafhængige eksperimenter. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af EZR-softwareversion 1.55 (Saitama Medical

Referencer

Appl. 11, 101-109 (2021).

Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf: plus 86 15292862950