Plumbagin undertrykker -MSH-induceret melanogenese i B16F10 musemelanomceller ved at hæmme tyrosinaseaktivitet, del 2

3. Diskussion

Plumbagin er en planteafledt sekundær metabolit og udviser adskillige biologiske funktioner, herunder anti-inflammatoriske, anti-cancer, anti-allergiske og antibakterielle aktiviteter [8,9]. Det var dog ikke kendt, om plumbagin havde en hæmmende effekt på melanogenese forbundet med hyperpigmentering og melanom. I denne undersøgelse viste vi, at plumbagin kraftigt undertrykker melanogenese i B16F10 melanomceller, og dette arbejde kunne give mulighed for at udvikle hudplejekosmetik baseret på plumbagins anti-inflammatoriske, anti-allergiske, antibakterielle og anti-melanogenese aktiviteter.

Ifølge relevante undersøgelser er cistanche en almindelig urt, der er kendt som "mirakelurten, der forlænger livet". Dens hovedkomponent er cistanosid, som har forskellige virkninger såsom antioxidant, anti-inflammatorisk og immunfunktionsfremme. Mekanismen mellem cistanche og hudblegning ligger i cistanche-glykosidernes antioxidante virkning. Melanin i menneskelig hud produceres ved oxidation af tyrosin katalyseret af tyrosinase, og oxidationsreaktionen kræver deltagelse af ilt, så de iltfrie radikaler i kroppen bliver en vigtig faktor, der påvirker melaninproduktionen. Cistanche indeholder cistanosid, som er en antioxidant og kan reducere dannelsen af frie radikaler i kroppen og dermed hæmme melaninproduktionen.

cistanche nedir

Klik på Rou Cong Rong fordele ved blegning

For mere info:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Fordi opregulering af melanogenese ofte observeres ved malignt melanom med overudtrykte tyrosinaseniveauer i blodet såvel som tumorvæv, er det tydeligt, at melanogenese er et potentielt mål for kemoterapi af maligne melanomer [1]. I denne undersøgelse fandt vi, at plumbagin direkte undertrykker tyrosinaseaktivitet uafhængigt af det transkriptionelle maskineri forbundet med melanogenese (figur 6). Derfor tyder vores resultater på, at plumbagin kan være en potentiel komponent i en forebyggende og terapeutisk strategi til håndtering af malignt melanom. Faktisk er de anti-melanom, kemosensibiliserende og radiosensibiliserende virkninger af plumbagin på melanomterapi blevet rapporteret [17-21].

cistanche gnc

I tidligere undersøgelser, der beskæftiger sig med de anti-cancer og antiinflammatoriske virkninger af plumbagin, er ca. 5-10 µM plumbagin (højere end koncentrationen anvendt i denne undersøgelse) blevet brugt i in vitro-modeller [17,22 ,23]. Derfor undersøgte vi den toksiske virkning af plumbagin i proliferative celler, herunder normale keratinocytter (HaCaT) og linseepitelceller (B3), der kan blive beskadiget af hudplejekosmetik. Vores resultater viste, at lavere koncentrationer, ca. 0.5-1 µM plumbagin, ikke er toksiske for normale keratinocytter og linseepitelceller, men er effektive nok til at reducere tyrosinaseaktivitet og melaninsyntese. Derudover fandt vi også ud af, at plumbagin mere effektivt undertrykker melanogenese end 1 mM arbutin eller 0,2 mM kojinsyre, som er velkendte hudblegemidler. Disse resultater tyder på, at plumbagin er sikkert at bruge som en komponent til udvikling af hudblegende kosmetik.

I denne undersøgelse undersøgte vi plumbagins hæmmende virkninger på tyrosinaseenzymreaktionen ved hjælp af cellulære og cellefri tyrosinaseaktivitetsassays baseret på L-DOPA-oxidation. Ikke desto mindre foreslog vi ikke en præcis molekylær mekanisme for, hvordan plumbagin hæmmer tyrosinaseaktivitet. Denne mekanisme bør undersøges yderligere for at bestemme, om plumbagin interagerer direkte med tyrosinase og hæmmer dets oxidaseaktivitet, eller om det har indirekte virkninger, der fører til nedsat tyrosinaseaktivitet.

4. Materialer og metoder

4.1. Reagenser og antistoffer

Plumbagin, -MSH (M4135), arbutin (A4256), kojinsyre (K3125), L-DOPA (333786) og tyrosinase (T3824) renset fra svampe blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Antistoffer mod MITF (#12590), p-AKTS473 (#4060), p-AKTT308 (#13038), p-CREB (#9198), p-ERK1/2 (#4370), ERK1/2 (#9102), H2AX (#9718), PARP (#5625) og caspase-3 (#9665) blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Tyrosinase (sc-7833) og -tubulin (sc-9104) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA).

cistanche norge

4.2. Cellekultur og cellelevedygtighedsanalyse

B16F10 (musemelanomceller), B3 (humane linseepitelceller) og HaCaT (human keratinocyt) celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum og 25 mM glucose. Cellerne blev inkuberet i en befugtet atmosfære af 95 procent luft og 5 procent CO2 ved 37 ◦C. For at måle levedygtigheden blev celler inkuberet med forskellige koncentrationer af plumbagin opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) i 48 eller 72 timer. Efter inkubation blev dyrkede celler vasket med PBS og derefter inkuberet med 0,5% krystalviolet farveopløsning i 20 minutter ved stuetemperatur. For at måle optisk tæthed blev farvede celler inkuberet med en 1 procent natriumdodecylsulfat (SDS) opløsning i 15 minutter ved stuetemperatur, og den optiske tæthed af hver brønd blev derefter målt ved 570 nm (OD570) ved hjælp af en absorbanslæser (BioTek, Winooski, VT, USA).

4.3. Immunblotting

Dyrkede celler blev lyseret under anvendelse af 1 procent IGEPAL (octylphenoxypolyethoxyethanol), 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM NaF og en proteaseinhibitorcocktail i lysisbuffer. Proteinprøver blev adskilt via natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og de adskilte proteiner blev derefter overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Membraner blev inkuberet natten over med primære antistoffer (1:1000) ved 4 ◦C og derefter inkuberet med HRP-konjugerede sekundære antistoffer (1:10.000) i 1 time ved stuetemperatur. Proteiner blev visualiseret ved hjælp af et ECL Prime-kit (GE Healthcare Pittsburgh, PA, USA).

4.4. Måling af intracellulært og ekstracellulært melaninindhold

Melaninindholdet blev bestemt og kvantificeret ved hjælp af en tidligere beskrevet metode med let modifikation [2,24]. Til melaninindholdsanalyse blev B16F10-celler dyrket i phenolrød-frit DMEM indeholdende 10 procent føtalt bovint serum. B16F10-celler blev dyrket med -MSH-behandling i fravær eller tilstedeværelse af plumbagin i 3 eller 4 dage. De dyrkede celler eller medier blev høstet, og pellets blev opløst i 1N NaOH indeholdende 10 procent DMSO ved 80 ◦C i 1 time. Melaninindholdet blev målt ved hjælp af en absorbanslæser ved 475 nm (OD475), og melaninindholdet blev derefter normaliseret til den cellulære proteinkoncentration.

does cistanche work

4.5. RNA-isolering og kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra B16F10-celler under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA), og 2 µg totalt RNA blev brugt til cDNA-syntese ved anvendelse af et højkapacitets cDNA revers transkriptionskit (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Kvantitativ PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Sekvenserne af PCR-primerne (50-30 µm) var som følger: TCAAGTTTCCAGAGACGGGT og CATCATCAGCCTGGAATCAA for MITF; ATAGGTGCATTGGCTTCTGG og TCTTCACCATGCTTTTGTGG for TYR; CATTTCCAG CTGGGTTTCTC og TGGTCTGTGAATCCTTGGAA til TYRP1.

4.6. Cellulær tyrosinaseaktivitetsanalyse

Cellulær tyrosinaseaktivitet blev bestemt ved anvendelse af en tidligere beskrevet metode med modifikation [25,26]. Dyrkede B16F10-celler blev inkuberet med -MSH i fravær eller tilstedeværelse af plumbagin, og cellerne blev derefter vasket og lyseret med PBS indeholdende 1 procent natriumdeoxycholat og 0,5 procent Triton X{{8} }. Efter at proteinkoncentrationen var bestemt, blev 50 µg protein inkuberet med 2,0 mM L-DOPA og 0,1 M PBS (pH 6,8) i 1 time ved 37 ◦C. Oxidationen af L-DOPA blev målt ved 475 nm (OD475) under anvendelse af en absorbanslæser. Aktiviteten blev målt ved hjælp af følgende formel: tyrosinaseaktivitet (procent)=(OD475 af prøve/OD475 af kontrol) × 100.

4.7. Cellefri tyrosinaseaktivitetsanalyse

For at bestemme plumbagins hæmmende virkning på tyrosinaseaktivitet blev renset svampetyrosinase inkuberet i 2 timer med en reaktionsblanding indeholdende 0,1 M PBS (pH 6,8) og 2 mM L-DOPA i fravær eller tilstedeværelse af plumbagin . Oxidationen af L-DOPA til dopakrom blev målt ved 475 nm (OD475) med en absorbanslæser. Aktiviteten blev målt ved hjælp af følgende formel: tyrosinaseaktivitet (procent)=(OD475 af prøve/OD475 af kontrol) × 100.

4.8. DPPH Radical Scavenging Activity Assay

For at bestemme plumbagins radikalopfangende aktivitet blev en {{0}},2 mM DPPH-opløsning i methanol fremstillet og anvendt. Hver prøve blev fortyndet med destilleret vand til slutkoncentrationer på 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 og 5 mg/mL (plumbagin) eller { {13}}.005, 0.01, 0,05, 0,1, 0,2 og 0,5 mg/ml (C-vitamin). Efter reaktionen blev optisk densitet (OD) målt ved 517 nm (OD517) under anvendelse af en absorbanslæser. Frie radikalfjernende aktivitet blev beregnet ved hjælp af følgende formel: DPPH radikalfjernende aktivitet ( procent )=10 − ((ODs/ODc) × 100), hvor ODs repræsenterer absorbansen af prøverne, og ODc repræsenterer absorbansen af køretøjskontrol.

4.9. Statistisk analyse

Alle data blev analyseret ved hjælp af en uparret Student's t-test for to eksperimentelle sammenligninger og en envejs variansanalyse (ANOVA) med Tukey's post hoc test for multiple sammenligninger ved hjælp af Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Data præsenteres som middel ± standardafvigelse (SD). Forskelle mellem middelværdier blev betragtet som statistisk signifikante, når den tilknyttede p-værdi var mindre end 0.05.

5. Konklusioner

De vigtigste resultater af denne undersøgelse er, at plumbagin (i) undertrykker -MSH-induceret melaninsyntese ved at hæmme tyrosinaseaktivitet; (ii) påvirker ikke det MITF-koblede transkriptionelle maskineri og signaltransduktionskaskader inklusive AKT- og ERK1/2-aktivering forbundet med melanogenese; og (iii) ikke forårsager toksicitet i normale keratinocytter (HaCaT) og linseepitelceller (B3), når dets koncentration var mindre end 5 µM. Tilsammen ophæver plumbagin -MSH-induceret melaninsyntese ved at hæmme tyrosinaseaktivitet uafhængigt af CREB-MITF transkriptionsaksen. Disse resultater tyder derfor på et lovende og sikkert naturprodukt plumbagin til at reducere hyperpigmentering ved at bruge det i udviklingen af hudblegende kosmetik.

cistanche and tongkat ali reddit

Anerkendelser:Dette arbejde blev støttet af Konkuk University i 2016.

Forfatterbidrag:Ji-Hong Lim udtænkte og designede eksperimenterne; Taek-In Oh, Jeong-Mi Yun, Eun-Ji Park og Young-Seon Kim udførte eksperimenterne; Ji-Hong Lim, Taek-In Oh og Yoon-Mi Lee analyserede dataene; Ji-Hong Lim og Yoon-Mi Lee skrev manuskriptet.

Interessekonflikt:Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Forkortelser

-MSH alfa-melanocyt-stimulerende hormon

TYR tyrosinase

L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanin

MITF mikroftalmi-associeret transkriptionsfaktor

TYRP1 tyrosinase-relateret protein 1

CREB cAMP respons element bindende protein

PKA proteinkinase A

ERK1/2 ekstracellulær signalreguleret kinase 1/2

Referencer

1. Riley, PA Melanogenese og melanom. Pigment Cell Res. 2003, 16, 548-552. [CrossRef] [PubMed]

2. Bae, JS; Han, M.; Yao, C.; Chung, JH Chaetocin hæmmer IBMX-induceret melanogenese i B16F10 musemelanomceller gennem aktivering af ERK. Chem. Biol. Interagere. 2016, 245, 66-71. [CrossRef] [PubMed]

3. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signaleringsveje i melanogenese. Int. J. Mol. Sci. 2016. [CrossRef] [PubMed]

4. Kim, HJ; Yonezawa, T.; Teruya, T.; Woo, JT; Cha, BY Nobiletin, et polyethoxyflavonoid, reduceret endotelin-1 plus SCF-induceret pigmentering i humane melanocytter. Photochem. Fotobiol. 2015, 91, 379-386. [CrossRef] [PubMed]

5. Kang, SJ; Choi, BR; Lee, EK; Kim, SH; Yi, HY; Park, HR; Sang, CH; Lee, YJ; Ku, SK Inhiberende virkning af tørret granatæblekoncentrationspulver på melanogenese i B16F10 melanomceller; involvering af p38 og PKA signalveje. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 24219-24242. [CrossRef] [PubMed]

6. Kim, JW; Kim, HI; Kim, JH; Kwon, OC; Søn, ES; Lee, CS; Park, YJ Effekter af ganodermanondiol, en ny melanogenese-hæmmer fra den medicinske svamp Ganoderma lucidum. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1798. [CrossRef] [PubMed]

7. Tsao, YT; Huang, YF; Kuo, CY; Lin, YC; Chiang, WC; Wang, WK; Hsu, CW; Lee, CH Hinokitiol hæmmer melanogenese via AKT/mTOR-signalering i B16F10 musemelanomceller. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 248. [CrossRef] [PubMed]

8. Padhye, S.; Dandawate, P.; Yusufifi, M.; Ahmad, A.; Sarkar, FH Perspektiver på medicinske egenskaber af plumbagin og dets analoger. Med. Res. Rev. 2012, 32, 1131-1158. [CrossRef] [PubMed]

9. Gupta, SC; Kim, JH; Prasad, S.; Aggarwal, BB Regulering af overlevelse, spredning, invasion, angiogenese og metastase af tumorceller gennem modulering af inflammatoriske veje med nutraceuticals. Cancer Metastasis Rev. 2010, 29, 405-434. [CrossRef] [PubMed]

10. Jackson, JK; Higo, T.; Hunter, WL; Burt, HM Topoisomerase-hæmmere som anti-arthritiske midler. Inflflamm. Res. 2008, 57, 126-134. [CrossRef] [PubMed]

11. Ahmad, A.; Banerjee, S.; Wang, Z.; Kong, D.; Sarkar, FH Plumbagin-induceret apoptose af humane brystcancerceller medieres af inaktivering af NF-KB og Bcl-2. J. Cell. Biochem. 2008, 105, 1461-1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Aziz, MH; Dreckschmidt, NE; Verma, AK Plumbagin, en medicinsk plante-afledt naphthoquinon, er en ny hæmmer af vækst og invasion af hormon-refraktær prostatacancer. Cancer Res. 2008, 68, 9024-9032. [CrossRef] [PubMed]

13. Thasni, KA; Rakesh, S.; Rojini, G.; Ratheeshkumar, T.; Srinivas, G.; Priya, S. Østrogen-afhængig cellesignalering og apoptose i BRCA 1-blokerede BG1 ovariecancerceller som svar på plumbagin og andre kemoterapeutiske midler. Ann. Oncol. 2008, 19, 696-705. [CrossRef] [PubMed]

14. Gomathinayagam, R.; Sowmyalakshmi, S.; Mardhatillah, F.; Kumar, R.; Akbarsha, MA; Damodaran, C. Anticancermekanisme af plumbagin, en naturlig forbindelse, på ikke-småcellede lungekræftceller. Anticancer Res. 2008, 28, 785-792. [PubMed]

15. Wang, CC; Chiang, YM; Sung, SC; Hsu, YL; Chang, JK; Kuo, PL Plumbagin inducerer cellecyklusstop og apoptose gennem reaktive oxygenarter/c-Jun N-terminale kinaseveje i humane melanom A375.S2-celler. Cancer Lett. 2008, 259, 82-98. [CrossRef] [PubMed]

16. Shih, YW; Lee, YC; Wu, PF; Lee, YB; Chiang, TA Plumbagin hæmmer invasion og migration af leverkræft HepG2-celler ved at reducere produktionen af matrix metalloproteinase-2 og urokinase-plasminogenaktivator. Hepatol. Res. 2009, 39, 998-1009. [CrossRef] [PubMed]

17. Anuf, AR; Ramachandran, R.; Krishnasamy, R.; Gandhi, PS; Periyasamy, S. Antiproliferative virkninger af Plumbago rosea og dets oprensede bestanddel plumbagin på SK-MEL 28 melanomcellelinjer. Pharmacogn. Res. 2014, 6, 312-319.

18. Gowda, R.; Sharma, A.; Robertson, GP Synergistiske hæmmende virkninger af celecoxib og plumbagin på melanom tumorvækst. Cancer Lett. 2017, 385, 243-250. [CrossRef] [PubMed]

19. Li, J.; Shen, Q.; Peng, R.; Chen, R.; Jiang, P.; Li, Y.; Zhang, L.; Lu, J. Plumbagin forbedrer TRAIL-medieret apoptose gennem opregulering af dødsreceptor i humane melanom A375-celler. J. Huazhong Univ. Sci. Teknol. Med. Sci. 2010, 30, 458-463. [CrossRef] [PubMed]

20. Nair, S.; Nair, RR; Srinivas, P.; Srinivas, G.; Pillai, MR Radiosensibiliserende virkninger af plumbagin i livmoderhalskræftceller er gennem modulering af den apoptotiske vej. Mol. Carcinogen. 2008, 47, 22-33. [CrossRef] [PubMed]

21. Prasad, VS; Devi, PU; Rao, BS; Kamath, R. Radiosensibiliserende virkning af plumbagin på musemelanomceller dyrket in vitro. indiske J. Exp. Biol. 1996, 34, 857-858. [PubMed]

22. Li, YC; Han, SM; Han, ZX; Li, M.; Yang, Y.; Pang, JX; Zhang, X.; Chow, K.; Zhou, Q.; Duan, W.; et al. Plumbagin inducerer apoptotisk og autofagisk celledød gennem hæmning af PI3K/Akt/mTOR-vejen i humane ikke-småcellede lungecancerceller. Cancer Lett. 2014, 344, 239-259. [CrossRef] [PubMed]

23. Checker, R.; Sharma, D.; Sandur, SK; Khanam, S.; Poduval, TB Anti-inflammatoriske virkninger af plumbagin medieres af hæmning af NF-KB-aktivering i lymfocytter. Int. Immunopharmacol. 2009, 9, 949-958. [CrossRef] [PubMed]

24. Kim, B.; Lee, SH; Choi, KY; Kim, HS N-Nicotinoyl tyramin, et nyt niacinamidderivat, hæmmer melanogenese ved at undertrykke MITF-genekspression. Eur. J. Pharmacol. 2015, 764, 1-8. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, HY; Jang, EJ; Bae, SY; Jeon, JE; Park, HJ; Shin, J.; Lee, SK Anti-melanogen aktivitet af Gauguin D, et stærkt oxygeneret diterpenoid fra den marine svamp Phorbas sp., via modulering af tyrosinaseekspression og nedbrydning. Mar. Drugs 2016, 14, 212. [CrossRef] [PubMed]

26. Winder, AJ; Harris, H. Nye assays for tyrosinhydroxylase- og DOPA-oxidaseaktiviteterne af tyrosinase. Eur. J. Biochem. 1991, 198, 317-326. [CrossRef] [PubMed]

For flere oplysninger: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Inhiberende virkning af Gastrodia Elata Blume-ekstrakt på alfa-melanocyt-stimulerende hormon-induceret melanogenese i murint B16F10-melanom

Plumbagin undertrykker -MSH-induceret melanogenese i B16F10 musemelanomceller ved at hæmme tyrosinaseaktivitet