Pin1 forværrer nyreskade induceret af iskæmi og reperfusion hos rotter via Nrf2/HO-1 medieret endoplasmatisk retikulumstress
Jul 17, 2023
Abstrakt
1. Formål
At undersøge rollen af peptidyl-prolyl cis/trans isomerase 1 (Pin1) på nyreiskæmi-reperfusion (I/R) skade og den underliggende mekanisme.
2. Metoder
Ved at etablere in vitro- og in vivo-modellerne af renal I/R blev Pin1s rolle undersøgt ved hjælp af molekylære assays.
3. Resultater:
I renal I/R var endogent Pin1-niveau opreguleret i I/R-svækkede nyrer. Undertrykkelse af Pin1 med juglone gav beskyttelse mod I/R-medieret nyredysfunktion og reduceret I/R-induceret endoplasmatisk retikulum (ER) stress in vivo. I overensstemmelse med in vivo-resultaterne gav undertrykkelse af Pin1 med juglone eller gen-knockdown med si-Pin1 cytobeskyttelse og begrænset hypoxi/reoxygenering (H/R)-drevet ER-stress i HK-2-celler. Samtidig afslørede yderligere undersøgelser, at Nrf-2/HO-1-signaler var forbundet med Pin1- og ER-stress som reaktion på nyre-I/R. Derudover blev Nrf-2/HO-1-signalvejen inaktiveret, efter at nyren blev udsat for I/R, som angivet ved nedreguleringen af Nrf-2/HO{{18 }} niveauer. Desuden reddede inhibering af Pin1 på bemærkelsesværdig vis inaktiveringen af Nrf-2/HO-1.
4. Konklusion
Pin1-moduleret I/R-medieret nyreskade på ER-stressmåde afhængig af Nrf2-HO-1-vej i I/R-skade.
Nøgleord
NIMA-interagerende Peptidylprolyl Isomerase. Iskæmi. Reperfusion. NF-E2-relateret faktor 2. Heme-oxygenase-1. Endoplasmatisk retikulum stress.
Klik her for at se virkningerne af Cistanche på nyrefunktionen
Introduktion
Renal iskæmi-reperfusion (I/R) skade, der betragtes som en af de vigtigste stimuli, der disponerer nyren for akut nyreskade (AKI), kan svække nyrefunktionen efter nyretransplantation og delvis nefrektomi1. Især er mekanismerne, hvorved I/R resulterer i nyreskade, komplicerede og multiple, med forskellige skadede stimuli impliceret i patogenesen, herunder apoptose, ER-stress, autofagi og oxidativ stress2,3. Tidligere undersøgelser har været forpligtet til at udforske lovende terapier til beskyttelse mod I/R-induceret AKI, såsom fjern iskæmisk prækonditionering, postkonditionering og nye farmakologiske indgreb4,5. Der er dog kun valideret lidt arbejde i den prækliniske fase. Derfor er det nødvendigt at bestemme de potentielle mekanismer og undersøge nye terapeutiske mål i renal I/R.
Pin1 giver sin funktion ved effektivt at fremme de konformationelle ændringer af substratproteinerne gennem specifik identifikation af phosphorylerede Ser/Thr-Pro peptidbindinger6. Pin1 katalyserer isomeriseringen af substratproteinerne og ændrer de funktionelle aktiviteter af målrettede phosphoproteiner for at kontrollere mange biologiske processer, herunder tumorigenese og udvikling, gentranskription og redoxbalance7. En nylig rapport indikerede, at Pin1 var relateret til progressionen af iskæmisk slagtilfælde ved at målrette p53-transaktivering8. En anden undersøgelse indikerede, at undertrykkelse af Pin1 begrænsede intestinal iskæmisk skade, og disse virkninger blev medieret af den p66Shc-inducerede mitokondrielle homeostase6. Hvorvidt Pin1 medierer nyredysfunktion i forbindelse med I/R-skade, mangler dog at vise.
Den nuklear faktor-erythroid 2-relaterede faktor 2/hæm oxygenase-1 (Nrf2/HO-1) signalvej er forbundet med forskellige cellebiologiske processer, herunder ER-stress. Nrf2/HO-1 blev rapporteret at være opstrømsregulatoren af ER-stress under AKI9,10. Hvorvidt Pin1 er korreleret med Nrf2/HO-1-udtryk og ER-stress er dog stadig ukendt. Heri viste vi, at undertrykkelse af Pin1 svækkede I/R-induceret ER-stress hos rotter og udforskede de involverede mekanismer.
Cistanche supplement
Metoder
1. Etablering af dyr, I/R-model
Sprague-Dawley (SD) hanrotter (180-200 g, 8 uger gamle) blev opnået fra Shanghai Science Academy Animal Center (Shanghai, Kina). Projektet blev udført i overensstemmelse med principperne for laboratoriedyrspleje (NIH-publikationer nr. 8023, revideret 1978). Alle dyreprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Anhui Medical University (godkendelsesnummer: LLSC20210858). Dyrene blev holdt i et frit tilgængeligt miljø med mad og vand med en 12-h lys og 12-h mørk cyklus. I/R-modellen blev udført efter den veletablerede metode11. Kort fortalt blev der lavet et abdominalt midtlinjesnit, og begge nyrer blev blotlagt. De vigtigste nyrearterier og vener blev identificeret ved hjælp af et stereotaktisk mikroskop, efterfulgt af en højre nefrektomi. Derefter blev de venstre nyrearterier og vener okkluderet i 45 minutter med ikke-traumatiske mikroaneurismeklemmer. Efter 45 minutters nyreiskæmi blev abdomen genåbnet, og klemmerne blev fjernet. Nyrerne blev inspiceret i mindst 1 min for at sikre genoprettelse af blod. Abdomen blev lukket med kontinuerlige 4-0 polypropylensuturer. Nyrevæv og blod blev opnået ved forskellige reperfusionstidspunkter (6, 12, 24 timer). Sham-kirurgi bestod af en identisk procedure uden påføring af mikroaneurismeklemmer på venstre nyrearterier og vener.
2. Dyregrupper
Tooghalvfjerds rotter blev tilfældigt opdelt i følgende grupper (n=8): Sham-gruppe (n=8) – rotter blev kun udsat for Sham-kirurgi; I/R 6 timers gruppe (n=8), I/R 12 timers gruppe (n=8) og I/R 24 timers gruppe (n=8) – rotter led af iskæmi i 45 minutter og forskellige reperfusionsperioder; I/R-gruppe (n=8) – rotter blev kun udsat for I/R-skadefornærmelse; I/R plus DMSO-gruppe (n=8) – rotter blev injiceret den samme DMSO før I/R-etablering; I/R plus juglone (2,5 mg∙kg–1) gruppe (n=8), I/R plus juglone (5 mg∙kg–1) gruppe (n=8), I/R plus juglone (10 mg∙kg–1) gruppe (n=8) – rotter blev intraperitonealt injiceret med forskellige doser af juglone (en gang om dagen), tre på hinanden følgende dage før I/R kirurgisk protokol.
3. Serumassays
Serumkoncentrationerne af blodurinstofnitrogen (BUN) og Cr blev vurderet af det kommercielle kit (Nanjing Jiancheng-virksomheden, Kina) baseret på producentens instruktioner.
4. Cellekultur og behandling
Den humane nyrecellelinje (HK-2) blev dyrket i komplet Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) (Invitrogen, USA) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS) og 1 procent penicillin og streptomycin i et fugtigt miljø indeholdende 5 procent CO2 ved 37 grader. For at etablere en efterlignende hypoxisk atmosfære af H/R-modellen blev celler inkuberet i en hypoxisk inkubator med 1 procent O2, 94 procent N2 og 5 procent CO2 i 12 timer. Derefter til reoxygenering blev cellerne dyrket i en normoxisk inkubator i 2, 4 og 6 timer. Kontrolcellerne blev dyrket i en fugtig atmosfære med 5 procent CO2 ved 37 grader.
5. Lille interfererende RNA (siRNA) transfektion
Til transfektion blev HK-2-celler dyrket i et medium uden FBS. Specifikke siRNA'er eller negative siRNA'er (GenePharma, Kina) blev transficeret ind i celler ved hjælp af Lipofectamine 2000-reagens i 6 timer. Derefter blev mediet erstattet med et komplet medium suppleret med 10 procent FBS.
Cistanche tubulosa
6. Hæmatoxylin og eosin (H&E)
Nyrevæv blev skåret i 4 μm tykt efterfulgt af fikserede, paraffinindlejrede. Derefter blev sektionerne brugt til at vurdere histologiske skader af H&E. Histologiske evalueringer blev udført i henhold til de tidligere etablerede kriterier af Jablonski et al.12. Morfologiske ændringer blev målt af to patologer, som ikke vidste noget om behandlingsgruppen.
7. Omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR)
Totalt RNA fra celler eller nyrevæv blev fremstillet under anvendelse af Trizol (Invitrogen, USA), efterfulgt af syntese til cDNA under anvendelse af cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA). qPCR blev udført ved hjælp af SYBR Green (BioRad). Primersekvenser rettet mod specifikke gener blev anført som følger: R-Pin1: 5΄-GCTCAGGCCGTGTCTACTACTTC-3΄ (F), 5΄-TCCGAGATTGGCTGTGCTTC-3΄ (R); R- -aktin: 5΄-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3΄ (F), 5΄-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3΄ (R). Relative ekspressionsniveauer af mRNA blev målt ved Ct-værdier og normaliseret til GAPDH.
8. Western blotting
Samlede proteinprøver blev fremstillet fra celler eller nyrevæv under anvendelse af et radioimmunpræcipitationsassay (RIPA) proteinekstraktionssæt. Primære antistoffer, der blev brugt i dette afsnit, blev anført som følger: Pin1 (1:1000, Abcam), p-eIF2 (1:1000, Cell Signaling Technology), eIF2 (1:1000, Cell Signaling Technology), CHOP (1:1000, Cell Signaling Technology), GRP78 (1:1000, Cell Signaling Technology), Nrf2 (1:1000, Abcam), HO-1 (1:1000, Cell Signaling Technology) og -actin (1:5000, Boster Biologisk teknologi). Hvert tæthedsbånd blev målt ved hjælp af billede J.
9. Celletællingssæt-8 (CCK-8)
Cellelevedygtighed blev målt med CCK-8-detektionskittet (Beyotime Biotechnology, #C0037) i henhold til instruktionerne.
10. Statistiske analyser
Data indsamlet fra hver forsøgsgruppe blev præsenteret som middel ± standardfejl for middelværdien (SEM). Den normale fordeling af dataene blev evalueret ved Shapiro-Wilk test. Da datanormalitetsfordelingen var opfyldt, blev grupperne sammenlignet ved en variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest for at bestemme, hvilke grupper der adskilte sig ved parvis sammenligning. Den tidligere prøvestørrelse og post hoc effektanalyser blev beregnet ved hjælp af G-power-pakken. Prøvestørrelsen blev beregnet til ANOVA-testen, som blev brugt til at teste hovedhypotesen for undersøgelsen. Som et resultat af prøvestørrelsesanalysen udført ved hjælp af tidligere undersøgelsesviden, blev det fundet, at 80 rotter, 8 i forskellige grupper, skulle involveres i undersøgelsen for at afsløre de signifikante forskelle i grupperne, der brugte 80 procent kraft (1- =0.80),=0.05 fejl (95 procent konfidensinterval) med en tosidet hypotese. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Cistanche pulver
Diskussion
Vi lagde vægt på vores arbejde med Pin1s rolle i renal I/R og udforskede den relaterede mekanisme. Resultaterne viste, at Pin1 kan være impliceret i I/R-skadede nyrer. Samtidig gav inhibering af Pin1 nefrobeskyttelse mod I/Rumset nyrefunktion og vævsskade. Desuden var Pin1-niveauer forhøjet efter H/R in vitro, og inhibering af Pin1 forhindrede endoplasmatisk retikulumstress induceret af H/R. Ydermere viste yderligere undersøgelse, at endoplasmatisk retikulumstress blev reguleret af Pin1 uafhængig af Nrf2/HO-1-vejen. Derfor viste disse nye resultater, at Pin1 kan være et lovende terapeutisk mål for nyre-I/R.
Pin1 er blevet betragtet som en nøglefaktor til regulering af biologiske processer ved at modificere den målrettede proteinstruktur. Det kunne binde til et p-Ser/Thr-Pro-motiv, katalysere cis-trans-isomerisering og også tilføje et andet niveau af posttranslationel regulering13,14. Tidligere undersøgelser viste, at den forhøjede ekspression af Pin1 fremmer patogenesen og progressionen af cerebral og intestinal I/R-skade6. Vores undersøgelse viste konsistente resultater med de tidligere rapporter.
Vi undersøgte også de forskellige koncentrationer af Pin1-hæmmere mod I/R- og H/R-skade. Hæmning af Pin1 kunne lindre nedsat nyrefunktion og strukturskade induceret af I/R. In vitro-eksperimenterne viste også, at Pin1-hæmmeren kunne beskytte den svækkede HK-2-cellelevedygtighed induceret af H/R. Derfor kunne hæmning af Pin1 beskytte mod nyre-I/R-skade. Den negative kontrol (ingen intervention eller ingen nefrektomi) blev ikke grupperet i denne undersøgelse. Baseret på vores tidligere forskning havde den ingen forskelle i nyrefunktion eller strukturel skade mellem den sham-opererede gruppe og den negative kontrolgruppe.
Iskæmi-reperfusion er en alvorlig komplikation, der normalt opstår ved nyretransplantation, delvis nefrektomi, hjerteoperationer og andre større operationer6. De relevante mekanismer for renal I/R omfatter nekrose, mitokondriel dysfunktion, apoptose, ER-stress og oxidativt stress15. Blandt dem betragtes ER-stress som en af nøglemekanismerne. En tidligere undersøgelse rapporterede, at dexmedetomidinbehandling lindrede myokardieinfarkt-medieret AKI ved at begrænse endoplasmatisk retikulumstress16. En anden undersøgelse viste, at nyre-I/R-svækket skade blev forhindret af fibroblast-vækstfaktor2-behandling afhængig af moduleringen af endoplasmatisk retikulumstress ved aktivering af PI3K/AKT- og MEK-ERK1/2-signaler17. Vores undersøgelse viste, at ekspressionen af ER stress-associerede proteiner var forhøjet efter I/R og H/R processer. Desuden kunne inhiberingen af Pin1, med en inhibitor in vivo eller si-RNA in vitro, lindre den forhøjede ekspression af ER-stressassocierede proteiner induceret af I/R eller H/R. Disse resultater illustrerede, at Pin1 forværrede nyre-I/R-skade gennem opregulering af ER-stress in vivo og in vitro.
Under den fysiologiske tilstand blev Nrf2 lokaliseret og kombineret med Keap1-protein i cytoplasmaet. Under forskellig stressstimulering blev Nrf2 løsrevet fra Keap1 og translokeret ind i kernen og fremmede derefter HO-1-ekspression18. Tidligere undersøgelser har opdaget, at Nrf2/HO-1-vejen var forbundet med ER-stress under I/R-processen. Det blev rapporteret, at den forhøjede Nrf2/HO-1 reducerede I/R-induceret hjertecelleapoptose og myokardiebeskadigelse ved at lindre endoplasmatisk retikulum stress-relaterede signalmolekyler19. En anden undersøgelse viste, at helix B-positionspeptid spillede en nøglerolle i at reducere akut lungeskade ved at aktivere Nrf2/HO-1, hvilket begrænsede ER-stress i lungeepitelceller20. Vi viste, at Nrf2/HO-1-niveauer var nedregulerede, og ER-stress-relaterede proteiner blev forhøjet ved I/R-stimuli og hæmning af Pin1-aktiverede Nrf2/HO-1-signaler, hvilket beskyttede nyren mod I /R-stimulering. For yderligere at demonstrere forholdet mellem Nrf2/HO-1 og ER-stress udførte vi in vitro-eksperimenter med Pin1-hæmmer og Nrf2-hæmmer. Kombinationsbehandlingen med Pin1-hæmmer og Nrf2-hæmmer kunne vende den nedsatte endoplasmatiske retikulum-stress-relaterede proteinekspression induceret af Pin1-hæmning, hvilket indikerede, at Nrf2/HO-1 spillede en nøglerolle i reguleringen mellem Pin1 og endoplasmatisk retikulumstress.
Cistanche kapsler
Konklusion
Hæmning af Pin1 gav beskyttelse mod I/R-skade og begrænset nyreskade afhængig af reguleringen af Nrf2/HO-1. Denne effekt kan forekomme gennem modulering af ER-stress på I/R-stimuli. Disse resultater indikerede, at Pin1 var et lovende terapeutisk mål for nyre-I/R-skade.
Referencer
1. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Akut nyreskade. Lancet. 2019;394(10212):1949-64. https://doi.org/10.1016/ S0140-6736(19)32563-2
2. He L, Wei Q, Liu J, Yi M, Liu Y, Liu H, Sun L, Peng Y, Liu F, Venkatachalam MA, Dong Z. AKI om CKD: øget skade, undertrykt reparation og de underliggende mekanismer. Nyre Int. 2017;92(5):1071-83. https://doi.org/10.1016/j. strik.2017.06.030
3. Han SJ, Lee HT. Mekanismer og terapeutiske mål for iskæmisk akut nyreskade. Nyre Res Clin Practice. 2019;38(4):427-40. https://doi.org/10.23876/j.krcp.19.062
4. Zhang Y, Zhang JJ, Liu XH, Wang L. CBX7-undertrykkelse forhindrer iskæmi-reperfusionsskade-induceret endoplasmatisk retikulumstress gennem Nrf-2/HO-1-vejen. Am J Physiol Renal Physiol. 2020;318(6):F1531-8. https://doi. org/10.1152/ajprenal.00088.2020
5. Wang L, Chen Z, Weng X, Wang M, Du Y, Liu X. Kombineret iskæmisk postkonditionering og ozonpostkonditionering giver synergistisk beskyttelse mod nyreiskæmi og reperfusionsskade gennem inhibering af pyroptose. Urologi. 2019;123:296.E1-8. https://doi.org/10.1016/j.urology.2018.10.015
6. Feng D, Yao J, Wang G, Li Z, Zu G, Li Y, Luo F, Ning S, Qasim W, Chen Z, Tian X. Hæmning af p66Shc-medieret mitokondriel apoptose via målretning af prolyl-isomerase Pin1 dæmper intestinal iskæmi/reperfusionsskade hos rotter. Clin Sci (Lond). 2017;131(8):759-73. https://doi.org/10.1042/CS20160799
7. Lee TH, Pastorino L, Lu KP. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Pin1 i aldring, cancer og Alzheimers sygdom. Ekspert Rev Mol Med. 2011;13:e21. https://doi.org/10.1017/S1462399411001906
8. Balaganapathy P, Baik SH, Mallilankaraman K, Sobey CG, Jo DG, Arumugam TV. Samspil mellem Notch og p53 fremmer neuronal celledød ved iskæmisk slagtilfælde. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1781-95. https://doi. org/10.1177/0271678X17715956
9. Zhao W, Huang XD, Zhang LX, Yang XJ, Wang LH, Chen YS, Wang JH, Wu GL. Penehyclidinhydrochlorid-forbehandling forbedrer rhabdomyolyse-induceret AKI ved at aktivere Nrf2/HO-1-vejen og lindre endoplasmatisk retikulumstress hos rotter. PLoS One. 2016;11(3):e151158. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151158
10. Zhang GZ, Zhang K, Yang SQ, Zhang Z, Chen S, Hou BJ, Yuan JY. VASPIN reducerer inflammation og endoplasmatisk retikulumstress i renale tubulære epitelceller ved at hæmme HMGB1 og lindrer nyreiskæmi-reperfusionsskade. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(17):8968-77. https://doi.org/10.26355/eurrev_202009_22839
11. Wang L, Chen ZY, Liu Y, Du Y, Liu XH. Ozonoxidativ postkonditionering hæmmer oxidativ stress og apoptose ved nyreiskæmi og reperfusionsskade gennem hæmning af MAPK-signalvejen. Drug Des Devel Ther. 2018;12:1293-301. https://doi.org/10.2147/DDDT.S164927
12. Jablonski P, Howden BO, Rae DA, Birrell CS, Marshall VC, Tange J. En eksperimentel model til vurdering af renal restitution fra varm iskæmi. Transplantation. 1983;35(3):198-204. https://doi.org/10.1097/00007890- 198303000-00002
13. Lu KP. Fosforyleringsafhængig prolylisomerisering: en ny cellecyklusreguleringsmekanisme. Prog Cell Cycle Res. 2000;4:83-96. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-4253-7_8
14. Lu KP, Finn G, Lee TH, Nicholson LK. Prolyl cis-trans isomerisering som en molekylær timer. Nat Chem Biol. 2007;3:619- 29. https://doi.org/10.1038/nchembio.2007.35
15. James MT, Bhatt M, Pannu N, Tonelli M. Langsigtede resultater af akut nyreskade og strategier for forbedret pleje. Nat Rev Nephrol. 2020;16(4):193-205. https://doi.org/10.1038/s41581-019-0247-z
16. Tang C, Hu Y, Gao J, Jiang J, Shi S, Wang J, Geng Q, Liang X, Chai X. Dexmedetomidin-forbehandling dæmper myokardieiskæmi-reperfusion-induceret akut nyreskade og endoplasmatisk retikulumstress hos mennesker og rotter. Life Sci. 2020;257:118004. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118004
17. Tan X, Tao Q, Li G, Xiang L, Zheng X, Zhang T, Wu C, Li D. Fibroblastvækstfaktor 2 dæmper nyreiskæmiReperfusionsskade via hæmning af endoplasmatisk retikulumstress. Front Cell Dev Biol. 2020; 8:147. https://doi. org/10.3389/cell.2020.00147
18. Loboda A, Damulewicz M, Pyza E, Jozkowicz A, Dulak J. Nrf2/HO-1-systemets rolle i udvikling, oxidativ stressrespons og sygdomme: en evolutionært bevaret mekanisme. Cell Mol Life Sci. 2016;73(17):3221-47. https://doi. org/10.1007/s00018-016-2223-0
19. Wang J, Lu L, Chen S, Xie J, Lu S, Zhou Y, Jiang H. Opregulering af PERK/Nrf2/HO-1-aksen beskytter myokardievæv fra mus mod skader udløst af iskæmi-reperfusion ved at lindre endoplasmatisk retikulumstress. Kardiovaskulær Diagn Ther. 2020;10(3):500-11. https://doi.org/10.21037/cdt-20-126
20. Bi XG, Li ML, Xu W, You JY, Xie D, Yuan XF, Xiang Y. Helix B overfladepeptid beskytter mod akut lungeskade ved at reducere oxidativt stress og endoplasmatisk retikulumstress via aktivering af Nrf2/HO{{6} } signalvej. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(12):6919-30. https://doi.org/10.26355/eurrev_202006_21683
Honglin Yu 1, Guanjun Jiang 2, Wei Hu 3, Changgeng Xu 4.
1. MD. Radiologiafdelingen – Det første tilknyttede hospital ved Anhui Medical University – Anhui, Kina.
2. MD. Urologisk afdeling – Det femte hospital i Wuhan – Wuhan, Kina.
3. MD. Andrologisk afdeling – Det første tilknyttede hospital – Hengyang Medical School – University of South China – Hunan, Kina.
4. MD. Urologisk afdeling – Central Hospital of Wuhan – Tongji Medical College – Huazhong University of Science and Technology – Hubei, Kina.
